INTERAKCE ROSTLIN
S PATOGENY
Rostliny čelí celé řadě výzev
BIOTICKÝ STRES
Hmyz
Viry
Bakterie
Oomycety
Houby
Poranění
ABIOTICKÝ STRES
Teplotní stres (teplo, chlad, mráz)
Sucho
Záplavy
Zasolení
Ozón
Intenzivní světlo
Těžké kovy
• Rostliny jsou přisedlé organismy
• Rostliny hostí celou řadu nepatogenních a patogenních mikroorganismů
• Rostliny chrání mechanické bariéry a rozvinul se u nich mnohovrstvý imunitní systém
Patogen, škůdce, onemocnění
• Rostlinný patogen – organismus, jehož část životního cyklu se odehrává uvnitř
rostliny
• Škůdce – herbivorní hmyz, nematoda savec nebo pták živící se vegetativními částmi
rostliny
• Původ rostlinných patogenů
- předchůdce suchozemských rostlin přinesl patogeny sebou z moře
- po přechodu z moře některé druhy přešly k patogennímu způsobu života
- příchod suchozemských rostlin poskytl nové útočiště již existujícím patogenům
• Počátky zemědělství (před cca. 10 tis. lety)
- nový vztah mezi domestikovanými druhy a jejich škůdci a patogeny
- objevení se geneticky identických jedinců v monokulturách
- šlechtění za účelem výnosu a specifických vlastností
Významné choroby
• Plíseň bramborová - oomyceta Phytophthora infestans
- velký hladomor v Irsku (1840)
• Rez travní (černání stonků) – houba Puccinia graminis
- kolaps pěstitelů pšenice (1950, USA)
- vyšlechtění nové rezistentní variety
- v Africe (1999) se objevil nový virulentní kmen Ug99
- na Sicílii (2016) se objevil nový virulentní kmen TTTTF
• Černá Sigatoka – askomyceta Mycosphaerella fijiensis
- ohrožuje pěstování kultivaru Cavendish (Musa acuminata Colla a
M. balbisiana Colla)
- až 50% ztráta výnosu – předčasné zrání plodů a hnědnutí listů
• Rez kávovníku – houba Hemileia vastatrix
- zdecimovala produkci kávovníků na Srí Lance (1870)
- vedla ke konzumaci čaje v Británii místo kávy
Moderní zemědělství
• v minulosti hlavní kritéria pro šlechtění – výnos, vzhled, velikost
• rezistence – nebyl bod zájmu = chemie to vyřeší
• hlavní problém zemědělství = monokulturní plodiny
• GMO – v Evropě problematické
k září 2016, 55 GMO plodin bylo schváleno
• Molekulární křížení – QTL (Quantitative Trait Loci) mapování
Solanum habrochaites Solanum pimpinellifolium Solanum lycopersicum cv. Money maker 5
Strategie útoku patogenu
Nekrotrofní: patogen zabijí rostlinou buňku
Biotrofní: rostlinná buňka přežívá
Hemibiotrofní: na počátku infekce patogen udržuje buňky živé, ale v
pozdější fázi infekce je zabíjí
Patogen není schopen rostlinu infikovat
• Rostlina obsahuje strukturní bariéry nebo toxické látky
• Aktivace obranných mechanizmů
• Změna okolních podmínek
Úspěšná infekce patogenu
• Příznivé okolní podmínky
• Rostlina není schopna patogen rozpoznat
• Obranná odpověď vůči patogenu je neúčinná
Koncept Gen proti Gen (1971)
Harold Henry Flor, 1900–1991
“for each gene conditioning rust reaction in the host there is a specific gene
conditioning pathogenicity in the parasite”
Genotyp
patogenu
Genotyp hostitele
R1 r1
AVR1 - +
avr1 + +
- nekompatibilní interakce vedoucí k rezistenci
+ kompatibilní interakce vedoucí k onemocnění
• Všechny patogeny mající vztah gen proti genu jsou po určitou část života biotrofové
• 1990 - První Avr gen klonován z Pseudomonas syringae (Staskawicz et al., 1990)
• 1993 – Naklonován příslušný R gen (PTO) (Martin, G.B. et al.,1993)
• 1996 – Prokázání fyzické interakce AvrPTO - PTO (Tang et. al, 1996 Scofield et al., 1996)
Avr
Avr R
R Avr
Avr
R
R
Nekompatibilní
Kompatibilní
Cik-Cak Model (2006)
Jonathan Jones
Jeff Dangl
MAMPs
ETS
Efektor
patogenu
ETS
Efektor
patogenu
Míraobrany
Práh pro Hypersenzitivní
Reakci (HR)
Práh pro efektivní
rezistenci
Vysoká
Nízká
MAMPs – Molekulární vzory spojené s mikroby (flagelin, chitin nebo oligogalakturonidy)
PRRs – Receptory rozpoznávající molekulární vzory
NBS-LRRs – intracelulární receptory obsahující nukleotid vázající místo a leucin bohaté repetice
MTI/ETI – MAMPs/Efektory vyvolaná imunita
ETI
Avr-R
NBS-LRRs
ETI
Avr-R
NBS-LRRs
MTI
PRRs
HR +
HR -
Hypersenzitivní reakce
• Programovaná buněčná smrt
• Slouží k restrikci šíření patogenu a jeho usmrcení
Receptory rozpoznávající vzory (PRR)
FLS2
EFR
BAK1 BAK1
ELR
Flagelin, EF-Tu Elicitiny
CERK1
Chitin
LYM1/3
LRR-RK LRR-RLP LysM-RK/LysM-RP
Kinázová doména Leucine-rich repeat LysM doména Transmembránová doména
Rodina Funkce
PR-1 Neznámá
PR-2 b-1,3-glukanáza
PR-3 chitináza
PR-4 chitináza
PR-5 podobné thaumatinu
PR-6 inhibitory proteináz
PR-7 endoproteináza
PR-8 chitináza
PR-9 peroxidáza
PR-10 podobné ribonukleáze
PR-11 chitináza
PR-12 defensin
PR-13 thionin
PR-14 lipid-transfer protein
PR-15 oxalát oxidáza
PR-16 podobné oxalát oxidáze
PR-17 Neznámá
Exprese proteinů spojených s patogenezí
Proteiny spojené s patogenezí (PR)
Vztah MTI/ETI
Přímé/Nepřímé rozpoznání efektoru
• Pto – serin/threonin proteinová kináza
• Prf – NB-LRR protein
• AvrPto/AvrPtoB – efektorové molekuly P. syringae
• AvrRpm1/AvrB – efektorové molekuly P. syringae
• Rpm1 – NB-LRR protein
Systémová rezistence
Spoel & Dong, Nature Reviews Immunology 12
SAR (Systémově navozená rezistence)
• Slouží k obraně rostliny před biotrofními
patogeny
• Je spojena s dráhou kyseliny salicylové
• Je spojena s akumulací SA-responzivních PR
proteinů
ISR (Indukovaná systémová rezistence)
• Indukované symbiotickými bakteriemi a houbami
kořenového systému
• Je spojena s dráhou kyseliny jasmonové/ethylenu
• Nedohází k akumulaci PR proteinů ale po
napadení patogenem je jejich exprese silně
akcelerována
• Je spojena s tzv. “Defence Priming“ fenoménem
Systémová rezistence
SAR (Systémově navozená rezistence)
• Počátek infekce musí být doprovázen nekrotickými lézemi
• Silně indukována ETI a slabě PTI
• Aktivace kyselých forem PR proteinů
• Nutná přítomnost KYSELINY SALICYLOVÉ (INA, BTH)
• Prokázána úloha DIR1 proteinu – apoplastický Lipid Transfer Protein
• Prokázána role glycerol-3-fosfátu a kyseliny azaleové
• Klíčový protein v SAR je NPR1 (nonexpressor of pathogenesis-related genes)
benzothiadiazolek. isonikotinováaspirin
salicin
SAR (Systémově navozená rezistence)
NPR1 protein
• npr1 mutantní rostliny neexprimují PR proteiny, i když akumulují SA a vykazují silnou HR
• NPR1 – pozitivní regulátor SAR a negativní regulátor efektory spouštěné HR
• Ve zdravé rostlině je v oligomerní formě (inaktivní) - oligomeraci napomáhá S-nitrosylace
• Po napadení thioredoxin odstraňuje S-nitrosylaci a uvolňuje so monomer
• Monomerní NPR1 aktivuje TGA transkripční faktor (SA-responzivní elementy)
• Fosforylace NPR1 v jádře urychluje jeho degradaci proteasomem
• U Arabidopsis dva SA receptory – NPR3 nízkoafinitní a NPR4 vysokoafinitní
ISR (Systémově indukovaná rezistence)
• Indukce mechanickým poraněním nebo ožerovým hmyzem
• U rajčete spojená s polypeptidem SYSTEMINEM (18 AK, účinný ve femto-molární koncentraci)
- syntéza odštěpením C-konce pro-systeminu (200 AK) v místě poranění
- aktivuje signální dráhy k. jasmonové a ethylenu
• Při napadení syntéza proteinázových inhibitorů
- serin, cystein a aspartyl inhibitory proteináz
- interagují s proteinázami v žaludku hmyzu/nematod
- inhibice jejich rozvoje/smrt
Larvy Manduca sexta (Lišaj)
PIs - PIs +
https://www.youtube.com/watch?v=5keqSZdPXpE
https://www.youtube.com/watch?v=TKQ-CIX9afA
Rezistence k nekrotrofům
• Zprostředkovaná kyselinou jasmonovou a ethylenem
• Spojená s expresí defensinů
- malé 7 kDa bazické proteiny bohaté na cystein
- anti-mikrobiální aktivita
- strukturně podobné proteinu u ptáků, savců a hmyzu
• JA-izoleucin důležitý derivát rozpoznávaný F-box proteinem COI (Coronatin Insensitive 1)
• Klíčový regulátor JA odpovědi – AtMYC2 transkripční faktor a JAZ protein
Vztah mezi SA/JA/ethylenem
Plasmodezmata
• Důležitá role plasmodezmat v procesu vývoje a patogeneze
- transport signálních molekul do a z floému
- v procesu patogeneze rychlé uzavření depozicí kalózy (achilova pata obrany)
Reaktivní formy kyslíku (ROS)
• Klíčová role NADPH oxidázy a extracelulární peroxidázy
• NADPH oxidáza kódována rboh genem
- pro produkci ROS jsou potřeba proteiny rbohD a rbohF
- k aktivaci potřeba fosforylační kaskáda a vápník
- superoxidový anion rychle konvertován superoxid dismutázou
Anti-mikrobiální látky
Glukosinoláty
Phytoalexiny
Strategie patogenů
Nekrotrofie Biotrofie Hemibiotrofie
Strategie útoku Sekrece enzymů
degradujících buněčnou
stěnu a/nebo toxinů
Těsný Intracelulární kontakt
s rostlinou buňkou
Počáteční biotrofní fáze
Specifikum
interakce
Zabít rostlinné pletivo a
kolonizovat; výrazný
rozklad patogenem
Rostlinná buňka zůstává živá
s minimálním poškozením
V počáteční fázi infekce
zůstávají rostlinné buňky
živé, v pozdější fázi značné
poškození pletiva
Spektrum
hostitelů
Široké Úzké, pouze konkrétní druhy Střední
Příklady Bakteriální hniloba
(Erwinia spp.), houbová
hniloba (Botrytis cinerea)
Houbové plísně a rzi, viry,
endoparazitické nematody,
bakterie Pseudomonas spp.
Phytophthora infestans
(plíseň bramborová)
Oomycety
• oomycety (řasovky) jsou fylogeneticky odděleny od hub
• jsou to jedny z nejvíce devastujících rostlinných patogenů
• v houbových vláknech (hyfy) téměř chybí přepážky
• buněčná stěna neobsahuje chitin, pouze β-1,3, and β-1,6 glukany
• tvoří sporangia, ze kterých se uvolňují zoospory (nemají buněčnou stěnu, umí plavat)
https://www.youtube.com/watch?v=l9ikfDWZaT8
Nekrotrofové
• Oomycety rodu Pythium a houba Botrytis cinerea (plíseň šedá)
• Produkce enzymů rozkládajících buněčnou stěnu
• Některé produkují speciální toxiny
- HC toxin (Cochliobolus carbonum) inhibuje histon-deacetylázu)
- AAL toxin (Alternatria alternata) aktivuje PCD u rajčete
- Fusicoccin (Fusicoccum amygdali) inhibuje PM H+-ATPázu
- Kyselina šťavelová (Sclerotinia sclerotiorum) potlačuje ox. vzplanutí
AAL toxin Fusicoccin k. šťavelová
Biotrofové/Hemibiotrofové
• Využívají živé buňky jako zdroj živin
• Během patogeneze prochází třemi vývojovými stupni
- Buněčnou stěnu penetrují pomocí appresoria
- Tvorba apresoriálního infekčního lalůčku (penetration peg)
- Formace haustoria
• Haustorium se tvoří po invaginaci plazmatické membrány
• Opouzdření extrahaustoriální membránou (EHM)
• Někteří biotrofové netvoří apresorium
- Cladosporium fulvum – prochází přes průduchy
- Roste v apoplastickém prostoru
• Hemibiotrofové - přepnutí na nekrotrofní stádium
- vysoké nároky na živiny
- asexuální reprodukce
- u P. infestans přepnutí po několika dnech infekce
Biotrofové/Hemibiotrofové
Infekce plísní Cladosporium fulvum
(biotrof)
Infekce houbou Mycosphaerella graminicola
(hemibiotrof)
Bakterie
• většinou gram-negativní tyčky rodů Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas nebo Erwinia
• vzácně penetrují přes buněčnou stěnu
• Penetrace často zprostředkovaná hmyzem
• po většinu života v mezibuněčném prostoru nebo xylému
• sekretují toxiny, extracelulární polysacharidy (EPS) nebo enzymy degradující buněčnou stěnu
- nejsou zcela nutné pro patogenezi – pouze napomáhají
- coronathin – toxin P. syringae, mimikuje JA-Ile – otevírání průduchů, interference s SA odpovědí
- rozklad buněčné stěny – polygalakturonidáza (hydroláza), pektin lyáza (lyáza)
• často účast tzv. „kvórum detekčního“ mechanismu
- N-acyl homoserin lakton (Erwinia), protein Ax21 (Xanthomonas oryzae)
- faktory virulence spouštěny až při dostatečném nárůstu
- rychlé usmrcení buňky – předejití aktivní obranné reakci rostliny
• Během infekce použití sekrečního systému typu III pro doručení efektoru do buňky
- strukturní komponenty kódovány v rámci hrp genového klastru
Bakterie
Agrobacterium
Agrobakteriem zprostředkovaná transformace – nástroj pro rostlinou transformaci
Nematody (hlístice)
• Všechny nematody jsou obligátní biotrofové na kořenech
• Ektoparasitické (vně) x endoparasitické (uvnitř)
• Mezi nejvíce devastující nematody patří:
- nematody tvořící cysty (rody Heterodera a Globodera)
- nematody tvořící uzly (rod Meloidogyne)
• Životní cyklus:
- dormantní vajíčko obdrží rostlinný signál
- vylíhnutí se juvenilní nematody
- migrace do pletiva za kořenovou špičkou
- napíchnutí rostlinné buňky – modifikace metabolismu buňky
- tvořící cysty – tvorba nádorových struktur
- tvořící uzly – tvorba obřích buněk
- vývoj nematody = zrání vajíček
• Důležitý prvek – výživové vlákno
- součást sosáku
- tvoří so pokaždé při krmení (hromadí se v buňce)
- molekulový cut-off (20-40 kDa)
Hmyz
• OŽEROVÝ
- velké poškození pletiv
- napadení závisí na vývojovém stádiu
• SAVÝ
- minimální poškození pletiv
- pomocí sosáku nabodnou floém
- může vést k inhibici růstu
• Přenos celé řady patogenů
• Rostlina uvolňuje volatilní látky
- slouží k přilákání/odlákání
- největší skupina terpenoidní látky
- produkce (E)-b-farnesenu - ochrana
Obranný priming
• aktivace multi-genových obraných mechanismů
poskytujících dlouhotrvající rezistenci
• Spojen především z rezistencí indukovanou
mykorrhizními houbami, poraněním nebo chemikáliemi
(beta-aminomáselná kyselina)
• Molekulární mechanismy spojené s tímto fenoménem
jsou popsány pouze z části
ZÁKLADNÍ MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY
• Mitogen-aktivované protein kinázy
• Obohacení plazmatické membrány receptory rozpoznávající molekulární vzory
• Epigenetické změny
34
Obranný priming
35