"Když chemik neví, co s tím, tak to zahřeje. "
Neznámý autor
CHROMATOGRAFIE PŘI VYSOKÝCH TEPLOTÁCH
Jiří Urban, Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz
Pokročilá kapalinová chromatografie
VISKOZITA MOBILNÍ FÁZE A PERMEABILITA
Acetonitril Metanol
25 "C 90 "C 200 "C
ÚČINNOST
Difúzni koeficient
;_ „ T 1 r]
74.1 f)_8T  ch. M B B~D  ~ —       C~-~ —
m r,   .1/0.6 u 1 m
'I sv   v A
A — turbulentní difúze
Wilke-Chcmgova rovnice B - molekulová difúze ľ J* ~ I C
C - odpor proti převodu hmoty
0 1 ■ ... I ■ ... I ■ ... I ■ ... I ... ■
0 20 40 60 80
"dp/Dm25
VLIV TEPLOTY NA ÚČINNOST
1000 t
APmax = 800 bar
100 4
104
1 4
0.1
' *5    Critical point 50 000 pater
■   lit_i 111
......
■   ■ i i i 11
Pozor na vysokoúčinné
separace a na experimentální uspořádání
1000
10000 100000
plate number
1000000
16.D
<!:i
25^
1SO t
0.5 1.0 1.5
Mobile Phase Velcc ly {cmfeec|
45 40 35 , 30
I
25 20 15
. 20°C
40°C
6<rc
▼
80°C
0.8 1.6 2.4
Linear flow velocity, mm/s
MÉNĚ ORGANICKÉ FÁZE („GREEN CHEMISTRY")
Při vyšší teplotě dochází ke změně dielektrické konstanty vody, což ovlivňuje její polaritu a rozpustnost látek. Voda se stává víc „organickou".
Ar 3.75 °C ~ A(p 1 % metanolu Ar 5.00 °C ~ A<p 1 % acetonitrilu
60% metanol
100 % H20 při 1 30 °C
Při teplotách nad 1 00 °C je nutné použít za detektorem restriktor (snížení bodu varu v koloně)
% Organic in Water (for 'Methanol', 'Ethanoľ, '2-propanoľ, 'Tetrahydrofuran', and 'Acetonitrile') 0 20 40 60 80 100
95
85 ■■
75 ■
65 ••
~ 55 c
*-< o
u Q
45 ■-
35 ■■
25 --
15 ■■
100 Bar
600 Bar -►Methanol •Ethanol
2-propanol —Tetrahydrofuran
Acetonitrile
95
0 50 100        150        200 250
Water Temperature, °C (for '100 Bar' and '600 Bar')
VLIV TEPLOTY NA SEPARACI
Steroidy na Zr02 částicích pokrytých polybutadienem. Mobilní fáze 1 00 % H20
INSTRUMENTALN
v w       r r
Injector
Column Oven
<=z-C£
Preheater
Column
o-
Effluent Cooler
Backpressure regulator
Waste <■
Detector
D.2, Counter-Flow Heat Exchanger
D.1, Pre-Heater
Pump
oven
)—	<"-,		Preheater
	—    HPLC column <		
			
Vstupní teplota musí být + 5 °C jako v koloně
(Ale spíše lépe)
ln
2nL
Tin — Tß
Tout - Tb y rhCpR\h
Pozor na „domácí" instrumentaci
J. Sep. Sei. 30 (2007) 1 672 - 1 685.
795429
VLIV TEPLOTY NA ÚČINNOST
Thermally equilibrated    oven = 70 °C
Ideální stav
70 °C f	
l	i
70 °C
70 °C
70 °C
Studená mobilní fáze
ncoming solvent
Oven = 70 °C -i-i-
45 °C
f i %
65 °C
70 °C
70 °C
::.
Teplota tření
Frictional heating
70 °C
Oven = 70 °C
• • •	• •	• ■	• • • • i X •
}     73 °C • _^_	:p	76 °C	• • • • • • • • • • • ■ .Xť i
80 °C
Kompenzace
Compensation
60 °C
Oven = 70 °C
VLIV TEPLOTY NA SEPARACI
(a)  Incoming mobile phase T = 56 °C Oven T = 56 °C
(b) Incoming mobile phase T = 39 °C Oven T = 56 °C
(c)   Incoming mobile phase T = 51 °C Oven T = 77 °C
i  i  i i—i—~r-
8 10 12 Time (min)
■i    i i
14 16
A
8 10 12 Time (min)
I       I       I      'l-1-1—T-1
14 16
G i
I—r
o
i   i   i   i i—i—
4 6 8
Time (min)
i
10
i i
T-1—I
12        14 16
CHLAZENÍ MOBILNÍ FÁZE (DETEKCE)
Délka a průměr mimokolonových kapilár
6000
5000
+- 4000 c
3 O
O
<D
« 3000 a
75 o
§ 2000
1000
o
-20 cm of 0.010 ■ 40 cm of 0.004 -».-40 cm of 0.007 -±—40 cm of 0.010
Protiproudy chladič
D.2, Counter-Flow Heat Exchanger
.1, Pre-Heater
Det. U—(ex«
;changer 1y
Pre-heater
exchanger 2J-y I inj
200 > 70-80 °C
Alternativně ledová lázeň
5 10 15
Water (mobile phase) flow rate {mUmin)
20
J. Sep. Sei. 30 (2007) 1 672 - 1 685.
TERMODYNAMIKA RETENCE
Gibbsova volná energie
AG° = —RT • \r\K
Distribuční koeficient
Standardní molární entalpie
\
AG° = AH0 - TAS0
/
Standardní molární entropie
převodu látky mezi stacionární a mobilní fází
Gibbsova volná energie
Obecný popis pravděpodobnosti průběhu (chemické) reakce (AG°)
■ -AG° — proběhne
■ AG° — neproběhne
Entalpie
Změna energie při přestupu z mobilní do stacionární fáze. Odpovídá rozdílu interakcí mezi stacionární a mobilní fází. Přechod mobilní > stacionární fáze je preferován (retence), což odpovídá záporným hodnotám entalpie, -AH°, které upřednostňujeme.
Entropie
Odpovídá změně entropie (míře neuspořádanosti) při přechodu z mobilní do stacionární fáze. Neuspořádanost je v prostoru stacionární fáze omezena, což se projeví negativními hodnotami AS0. Proto upřednostňuje pozitivní hodnoty změny entropie.
R — plynová konstanta, 8.31 4 JK'moľ1 , T — termodynamická teplota, K, k— retenční faktor
GIBBSOVA ENERGIE
nižší teplota ~|", K vyšší teplota
vyšší retence nižší retence
GIBBSOVA ENERGIE
nižší teplota ~|", K vyšší teplota
vyšší retence nižší retence
GIBBSOVA ENERGIE
nižší teplota ~|", K vyšší teplota
vyšší retence nižší retence
VAN'T HOFFOVA ROVNICE
Gibbsova volná energie
AG° = -RT-lnK
Distribuční koeficient
AH° AS0 Ink = ——+ — -In p RT      R H
Standardní molární entalpie
\
AG° = AH° - TAS0
/
Standardní molární entropie
převodu látky mezi stacionární a mobilní fází
\nK = -
AH° AS0'
RT R
_ 1 _ Vs
Van't Hoffova rovnice
AH°    ASU Vs Ink = - —— + ——+ ln
o
RT R
Vi
M
\nK = ln/c/?       /3 =
V,
Mobilní
v.
Stacionární Fázový poměr
R - plynová konstanta, 8.31 4 JK'moľ1 , T - termodynamická teplota, K, k- retenční faktor
B
\ogk = A+j
www.chromatographyonline.com/elevated-temperatures-liquid-chromatography-part-iii-closer-look-van-t-hoff-equation
www.chromatography-online.org/Retention/Thermodynamics/rs_l_l 5.php
VAN'T HOFFOVA ROVNICE
1.00
0.80
0.60
O)
.2 0.40
0.20
0.00
B
ln k = — + A T
0.0029 0.0030 0.0031 0.0032 0.0033 0.0034
i A k-1
Poměr fází
Konstantní při různých teplotách (?)
:i:::::::t:t:í:::t:í:::;:i
B
logk = A+-
\nk = -
		AS0	
	+		+ ln
RT		R	VM
směrnice
úsek
entalpický příspěvek
entropický příspěvek
AH
o
AS
o
ENTALPIE vs. ENTROPIE
Systém A
In* I
Systém B
In* I
1/T
1/T
ENTALPIE vs ENTROPIE
Systém A
Ink
as0 vs'
Systém B
In k
AS0 Vs
Dominantní vliv entalpie \/j Malý vliv entropie
Malý vliv entalpie Velký vliv entropie
ENTALPIE vs ENTROPIE
Systém A
In*
Dominantní vliv entalpie \/j Malý vliv entropie
Rozdělení kontrolují molekulární síly, interakce vzorku se stacionární fází
Systém B
Malý vliv entalpie 1/T Velký vliv entropie
Rozdělení kontrolované (náhodnou) entropií. Zádně interakce. Větší záporná entropie — větší retence (menší chaos).
ENTALPIE vs. ENTROPIE
Systém A
Ink
Dominantní vliv entalpie \/j Malý vliv entropie
Rozdělení kontrolují molekulární síly, interakce vzorku se stacionární fází
Systém B
Chirální separace Size-exclusion
Malý vliv entalpie 1/T Velký vliv entropie
Rozdělení kontrolované (náhodnou) entropií. Žádné interakce. Větší záporná entropie — větší retence (menší chaos).
TERMODYNAMICKÝ POPIS RETENCE
Termodynamika retence popisuje, že existují dva hlavní mechanismy. Nelze ale přímo odvodit, jak lze takto retenci kontrolovat. To se musí dít/studovat skrze rozdělovači koeficient (K) ovlivněný molekulárními interakcemi a poměr objemů stacionární a mobilní fáze (VyVM), tedy geometrií stacionární fáze.
TEPLOTNÍ KONTROLA SELEKTIVITY
Ovlivnění selektivity Homologická řada
Paracetamol —Caffeine i/T'K1
—— Phenacetin —•-Theophylline ♦toluene Bethyl benzene     propyl benzene Xbutyl benzene     amyl benzene
Antipyrine -Aminoantipyrine
Hydroxyantipyrine
Charakterizace kolon: AH0, AS0
RETENČNÍ MECHANISMY
Reverzní fáze Hydrofilní interakce
25
t (min) l<min)
15% acetonitril, 30 - 80 °C 90% acetonitril, 30 - 80 °C
Separace fenolických kyselin na monolitické kapilární koloně.
J. Chromatogr. A 1217 (2010) 7981-7989.
RETENČNÍ MECHANISMY
Reverzní fáze
Hydrofilní interakce
(B) 1.25-, 1 -
^ 0.75 0.5 -I 0.25 0
o
--1-1-1--1-1
0.0028       0.0029        0.003        0.0031        0.0032 0.0033
1/T(K"1)
♦ SIN   ■ FER   APRO+VAC    O GAL   X PHB   □ CAF   A SYR+HPA
(A)   0.6 n
0.3
U) O
-0.3-
n      n       ľ,-n--°-^					
■x-	-X-	- - Y			
Q	-9_	o	n	n	-X
A	▲	A			
			■ -	-■-	
■-	-■-				♦
-1--1-1-1-i					
-0.6
0.0028 0.0029
0.0032 0.0033
0.003 0.0031
in-(K1)
♦ GAL  dPRO  A CAF   • PHB  X HPA  xVAC   O SYR ■ FER ASIN
15% acetonitril, 30 - 80 °C
Typický průběh pro reverzní fáze, vliv entalpie
90% acetonitril, 30 - 80 °C
Retence téměř nezávislá na teplotě, vliv entropie
Separace fenolických kyselin na monolitické kapilární koloně.
J. Chromatogr. A 1217 (2010) 7981-7989.
NELINEARITA TEPLOTNÍ ZÁVISLOSTI
J. Chromatogr. A 1 408 (201 5) 1 45-1 50.
Cholesterolem modifikované stacionární fáze
Kapalný krystal cholesterolu (změna teplotní závislosti)
Dominantnější pro kolony s větším pokrytím cholesterolem.
VLIV nH
Změna ionizace molekul vlivem teploty a pH prostředí (zejména při pH ~ pKa)
ApKa = -0.03/°C Zvýšení retence se zvyšující se teplotou
0.0029      0.0030     0.0031      0.0032 0.0033
l/T, K 1
0.65 +
c
Protriptylin
Tricyklické antidepresivum 0,25
0.55 +
0.45 +
0.35 +
0.0029 0.0030
0.0031 0.0032
1/T,K"1
0.0033
Teplota
Teplota
teplotní kontrola selektivity
on/off efekt
T2 > TI
			1 Temperature 1 1	Temperature 2		
Pump		Injector	-| Column 1 |-	-►	Column 2	
e.g. C18-Si02 e.g.ZirChrom-CARB
Ortogonalita stacionární fází
Detector
20
10
(A)
Z) < 20
(B)
21
o
Ě <
6
7 I
10
15
U
■PC, 1 ml/min Tocs=30°C;Tc.zrtJJ=125°C
10
25
30
T C, 3mJŕmin
10
11)
Okénkový diagram
2 trial runs on column A *aITi),*a(Ti)
43-
43-
43-
2 trial runs on column B in (Tú. *r (Ta)
43-
l"gíľí=(11!-,-[5l!'T
43-
'nB=tMä(1+*i1)
43-
tE„, (Ta, T„ ) - tE.« (Ta H t Ei „ (T„) - t..
43-
Anal. Chem. 72 (2000) 72, 1 1 0 - 1 1 8., Anal. Chem. 72 (2000) 2788 - 2796.
teplotní kontrola selektivity
on/off efekt
T2 > TI
			1 Temperature 1 1	Temperature 2		
Pump		Injector	-| Column 1 |-	-►	Column 2	
Detector
e.g. C18-Si02 e.g.ZirChrom-CARB
Ortogonalita stacionární fází
um ■
ü Tm -
i—i—i—i—i—i—i—j—r-
r=0.401 sd=03«
o
....................j ■ ■
■i 00 vin'
I
w 1 ,l	i 4+5 « i   h /L
E                         -4-                         4 1	
i	\1Á_:
_1_1_1_J_1_1_1_1_L_1_1_1_1_1_1_1_1_■_1_!	
	li la i	i !
:		
Z ÍU Time [m\n\
■5
li
vil
J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31-62.
STACIONÁRNÍ FÁZE
1. Zavedení methylových skupin
poměr alkyl : CH3 : SiOH — 1:1:1 nověji - ethylenové můstky
2. Nesilikagelové nosiče
a. Organické polymerní částice
b. Uhlík
c. Oxid hlinitý
d. Modifikovaný oxid zirkoničitý
- uhlíkem
- Cl 8, Cl 8 a uhlíkem
- polystyrenem
- polybutadienem
3. Hybridní materiály, matrice
polymer - silikagel, Zr02 - silikagel
r
Silica C18 Materials
1/2 Max C1B/Endcap 1/2 Free Silanols
Zr-PBD
Zr-Carbon
Hybrid Particle C18
1/3 Incorporated Methyls 1/3 MaxCie/Eridcap 1/3 Free Silanols
Zr-PS
Zr-CarbonCl8
TEPLOTNÍ STABILITA KOLON
Inflow Outflow
20 65 65 20 40
Relative distance between measuring powitions [mm]
5 a 50 hodin
Heating time [h] Retention time [min]
—•-k Phenol -■- k Naphihalere   -*- k AMhracsna -aftar 5 hours       alter 50 hauis
J. Chromatogr. A 1 1 14 (2006) 89-96.
Zr02 pokrytý polybutadienem, ZirChrom-PBD, 4.6 mmxl50 mm, 3[imf 300 °A
STABILIZACE POVRCHU POLYMEREM
V ideálním případě
■ nedochází k blokování pórů
■ je částice homogenně pokrytá
Bloknckage of pore volume by PBD
1 DC
Q
m
E
s-. 80
-C
B o m
o
« E
ô >
40
c Q.
.s PC's
0
* m
Silica [88]
Zirconia [92]
10 15 20 25 30 35
PBD volume/Pore volume [%]
40
(G
Influence of PBD coating on pore diameter and surface area
% of pore volume blocked by PBD {%)
-Surface area - silica [88]   - - » - -porediam. -silica [88] -surfacearea - zirconia[92] - - O - - porediam. - zirconia [92]
Polymerní pokrytí poskytuje srovnatelnou účinnost jako silikagel (oproti čistě polymerním částicím)
J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31-62.
SROVNÁNÍ SELEKTIVITY
a> c
Q> n c
CD
m
"5 ■*->
d o
o)
o
Normalized Selectivity Comparison
PLRP
Luna, ZirChrom-PBD,
~o*      -p -$y x?      <^p «p vo <x>   ^ mo ^ ^ xo ^      x? ^ & <
3P 00 OCT
V
Silikagel (Luna) Zr02 (ZirChrom) Polymer (PLRP)
J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31-62.
120000
•Jj 100000 -O
+Z   80000 t
iS
Q_ 60000
4) 40000 >
< 20000
//V
V
J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31
POKRYTÍ POLYSTYRENEM vs. POLYBUTADIENEM
10 20. 30
Normalized Retention Time Alkylbenzeny a aromatické uhlovodíky, 50% acetonitril, T = 30 °C
J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31-62.
í UHLÍKEM
NM
2 -^3~Y + 2 HX + NaN°2 - XN=N ~0~Y + 2 H2° ' NaX Reaction 1
DiamondBond Cl 8
Where Y C11H3
Carbon clad zirconia
Diazonium Salt
Derivalized Carbon clad zirconia
Reaction 2
CH5 Ch^ "Ch^
lCHJnt fj!ht)nc (Chth, CH-, CHi Chfe
Nor
40 35 30 25 20 15 10 5 0
150 °C
Separation in 1 minute
1.4
-i—r 1.6
1.8 min
1. Acetaminophen
2. Ketoprofen
3. Naproxen
4. Ibuprofen
5. Oxaprofen
J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31-62.
63
STABILITA VZORKU
□ 30 "C Ľ340 *C □ 50 "C B 70 "G 185 ""C
CytaraUna ArnoxIcIlHn      CrHorarriprienicúl Etopoalde
Stabilita cytostatik a antibiotik při vyšší pracovní teplotě na stacionární fázi tvořené Zr02 pokrytým polybutadienem, 15% acetonitril + 0.1% FA
STABILITA VZORKU-VLIV KOLONY
Uhlíkem pokrytý Zr02 Polystyren-Divinylbenzen
ZirChrom Carb, 1 50 mm X 4.6 mm, 3 |im PLRP-S, 1 50 mm X 4.6 mm, 3 |im
Time (min) 0 10 20
Time (min)
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 46 (2008) 625—630.
mAU ; 60 -
50
40 -30 -20 -10 -_
o -j-
(A) o
mAU
U
2 4 6
VWD1 A, Wave length =254 nm (P102501\TEST0151.D)
80-
60-
40-
20
0
(B) 0
-i-1-1-r
2
21 °C 29.0% ACN 1.35 ml/min 195 bar 1 2.5 min
2.4      2.6     2.8     3        3.2 min
TV
10	12 14
3	80 °C
ft	26.5% ACN
	3.00 ml/min
	195 bar
	2.5 min
V	
0.9    0.95    1     1 05    1A     1,15  12     125min
T-1-1-1-1-1-T-1-1-í-T
J-1-í-1-J-1-1-1^-j-í-1-1-j-í-
8 10 12 14 rrin
Spotřeba mobilní fáze
16.9 ml
7.5 ml
21 °C
80 °C
ZirChrom-PBD, 1 00 x 4.6 mm      J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31-
66173832
TOKOFEROLY A
LU
60
5<H
40
30 20
10
0
LU
60-I
50 AQ\
30
20
10 H
10
20
30
40
	LU 60
	50
	40
	30
	20
o-T A	10 0
50 mm 0	
i  A ,     m iA<^
r » ■ * ■ f
10     20    ~30     40     50     60     70     80    90 min Kolona PerfectSil Target, isopropanol/voda (75:25); průtok 0.3 mL/min
40 60 80 100 mm
J. Agric. Food Chem. 60 (201 2) 2076-2082.
111197
TOKOFEROLY A
LU
60
5<H
40
30 20
10
0
LU
60-I
50
40.1
30 20 10 H
10
20
30
40
	LU 60
	50
	40
	30
	20
o-T A	10 0
50 min 0	
i  A ,     m iA<^
r » ■ * ■ f
10     20    ~30     40     50     60     70     80    90 min Kolona PerfectSil Target, isopropanol/voda (75:25); průtok 0.3 mL/min
40 60 80
J. Agric. Food Chem. 60 (201 2) 2076-2082.
111197
IZOKRATICKA ELUCE vs. GRADIENT TEPLOTY
Izokratická separace
Teplotní gradient
o.i.
0.0-
1
U\JLJ
A.
9
A
—r 10
15
—r
20
Time (Minutes)
10
25 30
—\—
35
0.1.
0.0
/
0 5 10
Time (Minutes)
Alkylbenzeny, RP-C1 8, 50 cm x 1 mm, 7 |am, 80% acetonitril, 25 °C
25 -100 °C,7°C/min
J. Chromatogr. 279 (1 983) 431 -438.
BIOCHEMICKÝ SCREENING
equation 2	
	
equation 3	
	
ESI-MS
HTLC
detection
Kombinace vysokotepelné chromatografie
s enzymatickou reakcí
Anal. Chem. 77 (2005) 7894-7900.
jZ-Phe-Aig-OCH, ^Z-Phe-Arg-OH
VODA JAKO MOBILNÍ FÁZE
Sample In
Water In ■
Waste
FID Jet
s
FID ✓
i
it
GC Oven
SS Capillary Restrictor
\
HPLC Column
\
"V
3 cm
Alkohol	Deklarováno, %	Nalezeno, %
Whisky	50.5	49 ± 0.5
Rum	40.0	41 ± 1.0
Červené víno	13.0	1 3 ± 0.5
Pivo	5.6	5.5 ± 0.1
Anal. Chem. 69 (1 997) 623-627.
40°C
t,i !1:.n- ■
Kí-lniihoŕi Tim« imiri)
/
T"™" 80°C
j«bj|jnŕl
J
14 :<-■ H
RáHňllun Tlma |rrnn]
S
140°C
.11
4 ID
_- -1 Tiíilů I ■: - ' i
—r—
a6
—i
Teplotní program
■R#«ľt1lDn Tlrrw |n*Hn|
/ think truth has no temperature. "
Cameron Diaz