2.5 0.0 0.5 1.0 2.0 ULTRAVYSOKOTLAKA CHROMATOGRAFIE Pokročilá kapalinová chromatografie IfjOl Jiří Urban, Ustav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz VELIKOST ČÁSTIC A ÚČINNOST B H = A + - + (Cs + Cm) • u u dl(a + b • k + c • k u 24(1 + k)2 • Dm VELIKOST ČÁSTIC A ÚČINNOST B H = A + - + (Cs + Cm) • u u H = 7 2.Ádp + _i 2AD m dp(a + b - k + c - k u 24(1 + k)2 • Dm N = L 2 • d p VELIKOST ČÁSTIC A ÚČINNOST 50 000 n 45 000 A 40 000 A 35 000 A 30 000 A 20 000 A 15 000 A íoooo H 5 000 A B H = A + - + (C5 + Cm) • u H = 1 2Ádp + _i 2 AD m ^dp(a + b - k + c u 24(1 + /c)2 • Dm 25 000 N = L 2 * ďp 10 1 50 mm VELIKOST ČÁSTIC A ÚČINNOST Lineární rychlost, mm/s Ilustrativní zobrazení VELIKOST ČÁSTIC A ÚČINNOST 0 1 2 3 4 5 Lineární rychlost, mm/s Ilustrativní zobrazení VLIV VELIKOSTI ČÁSTIC NA SEPARACI Testovací směs o fenol OH 0 1 HN NH2 OCH, fenylurea metoxybenzen acetanilid NH; u metylphenylketon aniline methylmethoxybenzoát Kolona 150 x 4.6 mm, Cl 8 Sloučenina k Fenol 1.35 Fenylmočovina 3.06 Metoxybenzen Acetanilid 5.48 Methyl phenylketon Anilin 9.60 Methylmetoxybenzoát 10.95 1 0 Lim 5 Lim 3 Lim 1.7 Lim Velikost částic O ° ° Mobilní fáze 55% Acetonitril 150 X 4.6,10 jLim O Průtok 0.5 ml/min Tlak 1 MPa Účinnost 5 000 HETP,3) = 30 jim A A 0 5 10 15 20 25 30 35 40 150 X 4.6,5 |im o Průtok 1 ml/min Tlak 8 MPa Účinnost 1 0 000 HETP,3) = 15 jim konstantní k 0 5 10 15 20 25 30 35 40 150X4.6, 3 |um o Průtok 1.7 ml/min Tlak 37 MPa Účinnost 1 6 667 HETP(3) = 9 jim konstantní k U —i 40 10 15 20 25 30 35 150X4.6,1.7 um- Průtok 2.9 ml/min Tlak 203.5 MPa Účinnost 29 400 HETP(3) = 5 jim konstantní k 11_l 10 15 20 25 30 35 40 VELIKOST CASTIC A RYCHLOST ANALÝZY 1.7 Lim 3 Lim 5 Lim 1 0 Lim 10 15 20 25 30 35 40 VELIKOST CASTIC, ÚČINNOST A TLAK N 50 000 45 000 -40 000 -35 000 30 000 -25 000 20 000 -15 000 10 000 -5 000 10 1.7 Jim VELIKOST CASTIC, ÚČINNOST A TLAK N Ap, MPa 50 000 n 250 n 45 000 -\ 40 000 \ 200 H 35 000 -\ 30 000 J 150 H 25 000 H 20 000 -J 100 A 15 000 H íoooo H so H 5 000 H 10 VELIKOST CASTIC, ÚČINNOST A TLAK N Ap, MPa 50 000 n 250 n 45 000 -\ 40 000 H 35 000 H 30 000 H 25 000 H 20 000 H 15 000 H io ooo H 5 000 H 1.7 Jim VELIKOST CASTIC, ÚČINNOST A TLAK N Ap, MPa 50 000 n 250 n 45 000 -\ 40 000 H 35 000 H 30 000 H 25 000 H 20 000 H 15 000 H io ooo H 5 000 H CASTIC dp, Um ml/min N p, MPa t„„„. min ana' ^3,2 O 10 0.5 5 000 1 36 2.29 o 5 1.0 10 000 8 18 3.25 o o 3 1.7 17 000 37 11 4.20 1.7 2.9 30 000 204 5.57 1 50 x 4.6 mm C18 55% acetonitril konstantní k Při použití 1 Lim částic bude pracovní tlak dp 1 25x větší než v případě 5 |LXm částic 389661 ČÁSTIC dp, jxm ml/min N p, MPa t„„„, min ana' *3,2 O 10 0.5 5 000 1 36 2.29 o 5 1.0 10 000 8 18 3.25 o 3 1.7 17 000 37 11 4.20 1 50 x 4.6 mm C18 55% acetonitril konstantní k 1.7 2.9 30 000 204 5.57 APopt ~ ,3 Při použití 1 |jm částic bude pracovní tlak dp 1 25x větší než v případě 5 |LXm částic Nutnost použití kolon s menšími rozměry 389661 50 X 20)1.7 jam Ultra high pressure liquid chromatography (UPLC) Průtok 0.6 ml/min Tlak 68 MPa Účinnost 9 804 HETP(3) = 5 jim JU konstantní k o.o 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 HPLC vs. UPLC HPLC Separation o «o Li 30 mins 0 40 I JO 10.30- 0.10 i • • ■ I.......t • • ' t • • • r t.fti..;...|...I...|.f.t...< 0.00 1.00 4.00 »00 000 10.00 11.00 14.00 1» 00 It 00 10.00 11.00 14.00 34.00 II 00 10.00 MnufeM Typical Column Volume = 2.49 mL : M 0.00 ■ 1 ■ 0» UPLC Separation 1U 4 mins ' ! ■ 1.00 ' I ' 1 SO ■ • I ' 2 00 MlnutM ' I ■ 2 S.0 3 00 • I ■ 3 SO Typical Column Volume = 0.17 mL HPLC UPLC Reduction UPLC Run Time 30 min. 87% Run Time 3.86 min. Solvent Consumed 30 mL 83% Solvent Consumed 4.97 mL Sample Consumed 20 mL 93% Sample Consumed 1.0 mL www.americanlaboratory.com HPLC vs. UPLC i 00-, HPLC Separation UPLC Separation Li 30 mins 0 40 I 30 I 0.20- 0.10 .i ,.■.[. i i! i ii |ii.l..i|.nlirt[ti.1t,.li. 0.00 3.00 4.00 ».00 «00 10.00 12.00 14.00 1» 00 lt.00 20.00 22.00 24.00 20.00 21.00 30.00 Minuto* Ml-- 0.00 4 mins 0.W3 1 00 ' I ' 1 so ' I ' zoo ' I ■ 2*0 3 00 ' I ' 3 SO Nevýhody UPLC ■ Instrumentální nároky ■ Vyšší pracovní tlak ■ Teplota tření ■ Nižší životnost kolon ■ Lze řešit vyšší teplotou Výhody UPLC ■ Větší selektivita a citlivost ■ Rychlé analýzy ■ Nižší provozní náklady ■ Vyšší produktivita Rychlejší optimalizace www.americanlaboratory.com OPTIMALIZACE SYSTÉMU! 0i6n ACQUIT Y UPtCMMC,. 7 I » 50 mm. I 7 ym Pb.tM.-i», 1 »6002350 Al«jnc«» 2695 HPIC 5yH*« Flow lat* a 0.1 ml/min f^MAK ■ 4.JO0 016-i 163 5.400 ■ 007 Same Column HPLC Instrument Sub-2 um Pattulc Column Pefloimanc* Undef HPIC Condition-. (Non-Optimal Un»ar VelotHu) 6» i ACQUITY UnCMHCu 2 I «50 mm. 17 pm Port M^fc* 1860073. Flow tot* ■ 0.6 ml/miii PSImM. ».400 ^* )| ■ í 25 UPLC Instrument Sub-2 um Paitlcle Cotumn Petloimarwce Under UM.C Condition-. (Optimal lineat Vrlooty) elze pouze „koupit přístroj" nebo „UPLC" kolonu 56 ČERPADLA Jednopístový systém Outer Spacer Seal Compression Ring Spring International Journal of Pharmaceutical Research & Analysis 2 (2012) 24-31. PRŮMĚR KOLONY A PRŮTOK MOBILNÍ FÁZE 4.6 2.1 1.0 0.5 Vnitřní průměr kolony, mm OBJEM KOLONY 150 x 4.6 mm, V = 2.49 ml 100 x 4.6 mm, V = 1.66 ml 75 x 4.6 mm, V = 1.25 ml 50 x 2.1 mm, V = 0.17 ml DÁVKOVANÝ OBJEM 150 x 4.6 mm, V = 2.49 ml 100 x 4.6 mm, V = 1.66 ml 75 x 4.6 mm, V = 1.25 ml max 1 35 MPa 75 x 2.1 mm, V = 0.26 ml 50 x 2.1 mm, V = 0.17 ml Posil ion A CARRIER.' MOBILE PHASE ■.-AM-*Lb COLUMN Position B CARRIER' MOBILE PHASE SAMPLE VENT' WASTE COLUMN SAMFl v SLOT UNUSED SLOT VENT.' WASTE DETEKCE V UPLC Velmi úzké píky (malá disperze) < 1 s u 2 — 3x větší citlivost (ve srovnání s HPLC) Nutné rychlé vzorkování 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 min www.chromatog raphyonline.com/system-and-column-volumes-hplc-we-still-haven-t-got-message MS, UV, DAD, EC, FL MIMOKOLONOVÉ Rozmytí v systému J. Chromatogr. A 1 21 7 (201 0) 3000-301 2. 79 MIMOKOLONOVÉ OBJEMY Agilent 1 1 00 Agilent 1 200 Agilent 1 290 Waters Acquity Každý systém je jiný! J. Chromatogr. A 1 21 7 (201 0) 3000-301 2. MIMOKOLONOVÉ Systém Dávkovač, ni Kapiláry, ni Detekční cela, |il = 30.5 jíl Agilent 1 100 2.3 15.2 13 Agilent 1 100 opt. 1.2 3.8 1.7 = 6.7 jíl Agilent 1 200 opt. 1.1 3.1 1.7 = 5.9 jíl Agilent 1290 1.7 6.2 2.4 = 10.3 jil Waters Acquity 8.2 0.5 = 8.7 jil J. Chromatogr. A 1 21 7 (201 0) 3000-301 2. 79 MIMOKOLONOVÉ Systém Dávkovač, ni Kapiláry, in Detekční cela, |il 100% ACN, nl2 65% MeOH, nl2 Příspěvek vex, % Agilent 1 100 2.3 15.2 13 41.5 73.2 49 Agilent 1 100 opt. 1.2 3.8 1.7 13.7 10.7 17 Agilent 1 200 opt. 1.1 3.1 1.7 3.5 6.1 |©| Agilent 1290 1.7 6.2 2.4 9.4 17.3 18 Waters Acquity 8.2 0.5 8.5 8.0 12 J. Chromatogr. A 1 21 7 (201 0) 3000-301 2. 79 VLIV MOBILNÍ FÁZE 1 00% acetonitril (A) 100 —■- Initial Agilent 1100 —Optimized Agilent 1100 a Optimized Agilent 1200 —Standard Agilent 1290 —Acquity 10 0.0 0.5 1.0 1.5 F [mL/min] 2.0 naphtho[2,3-a]pyren 65% metanol (B) 3 'I 100 10 -■- Initial Agilent 1100 • Optimized Agilent 1100 * Optimized Agilent 1200 ▼ Standard Agilent 1290 ▼ Acquity 0.0 0.5 —i— 1.0 1.5 Fv [mL/min] 4-ŕerŕ-butylphenol 2.0 Větší viskozita, větší rozmytí píků (ale konstantní při vyšších průtocích). J. Chromatogr. A 1 21 7 (201 0) 3000-301 2. MIMOKOLONOVÉ Rozměr kolony, mm Maximální mimokolonové objemy, Lil 100 x 4.6 50 x 4.6 25 50 x 3.0 10 lOOx 2.1 50 x 2.1 5 30 x 2.1 4 www.chromatographyonline.com Maximálně 2 — 3 % z objemu kolony 79 TLAK vs PRŮMĚR KAPILÁRY 60 80 100 120 140 160 Průměr kapiláry Lim Br|L AP = —— u Viskozita vody při pokojové teplotě, délka kapiláry 50 cm, www.chromacademy.com PŘEVOD METODY 0.25 HPLC XBridge C18 4.6 x 100 mm 7.0 min gradieň 1 m L/m in 30 °C 1,100 psi Rs = 6 Pc = 102 7.6 MPa 0jm I affeine UPLC 0.80 ACQUITY UPLC Q£H C18 E 2.1 x 100 mm,0|jm 0.60- c 7.0 min gradient B 3 o 0.6 mL/min c Cl u >• 30 °C c a X 8 12,000 psí 0.40- o c •o >. Rs = 20 Ě S £ Pc = 255 : > 0.20 82.7 MPa 0.00- Minutes XBridge C18 4.6 x 100 mm, 5 pm 7.0 min gradient 1 mL/min 30 °C 1,100 psi Rs = 6 Pc = 102 c a o c £ S JU 9 B I \ 1.40 1 1.20 1.00 0 60 0 20- 0 00 ~i—1—1—r i—■—1—i-Minutes is ACQUITY UPLC BEH C 2.1 x 100 mm, 1.7 pm 2.4 min gradient 0.9 mL/min 90 °C 12,000 psi RS = 19 P£ = 211 Minutes (J) www.waters.com PREVOD METODY Farmaceutika U PLC JL 11 12 "A_L ' I ' I ' I ' I ' I ' I 1 1 1 I 1 I 1 I 1 I ' \ ' I ' I 1 \ 1 I M ' I M 1 I ' I 1 I 1 I 1 I 1 I ' I ' I ' I ' I ' [" > I I I I I I I I I I I I \ M I I I I I I I I I \ I I I p I I I I I I I I I I \ I I I \ M I I I I I I I I I j 5 0 10 0 15 0 20 0 25 0 30 0 W 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2 8 Rentention Time (min) Retention Time (min) Cl 8, 150 x 4.6 mm, 5 |Jm, 1 mL/min, Vinj = 20 liL, celkový čas analýzy 45 min Cl 8 50 x 2.1 mm, 1.7 |Jm, 0.61 mL/min, Vinj = 1.4 liL, celkový čas analýzy 5.1 min Eu. J. Pharm. Biopharm 68 (2008) 430-440 RYCHLOST vs ROZLIŠENÍ 0.20 0.15 =1 O 10 0 05 0 00 API a) Fast method 6 min, 50-mm column Deg A Aniline, Deg B U i i i i i i...... 3.SQ 3.B0 A.Oa \ -i—i—i—i—i—r 0.00 0.50 i I i 1,00 T-1-■-1-1 I I I 1.S0 2.00 ' I i 2.50 "i—I-" 3.00 3.50 -i—I—i—i—p—i— 4.00 4.S0 Mitiutes API 0.20 0,15 0,10 0.05 0-00 b) Medium-resolution method 16 min, 100-mm column Aniline Deg B Deg A • I 1 1 1 I 1 1 1 I 1 11.6» 1180 . 12.00 000 2.00 4JM 600 Minute-; 800 API 10-00 12-00 0.20 0.15 0.10 0.05 0,00 c) High-resolution method 30 min, 150-mm column 0.00 22.00 24.DO Minutes C nr>irtlia HPLC 1000 bd 'UHPI C _l_I_I_l_ HT-UHPI Z fiHEd-eme HTl C 2q0 250 300 350 4QQ A5Q sod Analytical and Bioanalytical Chemistry 397 (201 0) 1 069-1 082. Peak capacity -|- (Highest possible P for tgrad= 3 h] CO JE NEJLEPSI? rutin 1Q c 3 0 T 1 I l_ in I I 20 30 40 50 60 70 30 SO'OOO 8 I'll □. E "5 CE Isocratic mod* - rutin of MW=6dd gfmo.1 BHT-UHPLC J ■ HTLC IHHLC ' luriiNJ i.-i>n \ :_ -_ : HLL 10UU bar A HPLC _1_1_1_1__1_1_1_1_ _1_1_1_1_ lOO'OOO 150n000 200'000 250'000 Efficiency (Highest possible N for ^ = 30 in in) Gradient made - rutin of MW=G00 g/mol ■ i m T-UHPLC ™ -fuse J-care 'UHPLC - MTL MM