Příprava vzorků – odběr vzorků, uchování vzorků a izolace Petra Vídeňská, Ph.D. Workflow •Design studie •Odběr vzorků •Izolace DNA •Příprava knihovny •Sekvenace •Analýza • • Amplikony – 16S rRNA Shot gun – celometagenomové sekvenování Nejčastější typy vzorků •Voda •Půda •Biologické vzorky –Stolice –Sliny –Stěry – –!Nejdůležitější je vždy zachovat stejný postup odběru! – Odběr vzorků - půda •Vhodně zvolit lokalitu, možno i z několika hloubek a vícero opakování vzorkování •Odběr do sterilní nádoby, sáčku •Transport na ledu, následné zmražení na -20 °C až -80°C •Na izolaci většinou postačí malé množství půdy, často se ale měří vícero hodnot a odebírá se tedy velké množství – půdu je před zpracováním nutno homogenizovat • • Odběr vzorků - voda •Možno odebírat z více hloubek ve zvolené lokalitě •Odebírá se větší objem (dle očekáváné bakteriální kontaminace 100 – 1000 ml) a transportuje se na ledu do laboratoře •Následně se voda filtruje přes bakteriologický filtr •Filtr je vložen do vhodné tekutiny (voda, TE, PBS) a promyje se • Odběr vzorků – biologické vzorky •složitější, např. u stolice velké množství anaerobů – fakultativně anaerobní bakterie rychle přerůstají •Nutno okamžitě zamrazit •Pokud není možno – komerční kity s pufry sloužící ke stabilizaci DNA a zamezení přerůstání bakterií po dobu 14 dnů Komerční souprava na odběr vzorků stolice DNA Genotek | Collection Instructions | DNA | RNA | Infectious Disease | Livestock - Mozilla Firefox DNA Genotek | OMNIgene | Infectious Disease Research | Microbial DNA - Mozilla Firefox Odběr vzorků stolice - problémy •Nestandardizované odběry vzorků – různá délka vystavení vzorku kyslíku před zamrazením •Problém homogenizace – odběr jen z jednoho místa stolice •Přítomnost inhibitorů PCR • • Ukázka různých přístupů – American Gut Project x uBiome •https://mrheisenbug.wordpress.com/2014/04/24/dear-american-gut-ubiome-you-have-some-explaining-to- do/ Dear American Gut & uBiome: You Have Some Explaining To Do. | Mr. Heisenbug - Mozilla Firefox http://blogs.discovermagazine.com/crux/files/2015/09/Open-kit.jpg American Gut Project – podmínky skladování •http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20412303 nihms-211815.pdf - Mozilla Firefox American Gut Project – podmínky skladování Non-metric Multidimensional Scaling (NMDS) plots of UniFrac weighted and unweighted pairwise distances. Overall community composition was not affected by temperature or duration of storage for weighted UniFrac distances (P> 0.1 in all cases). Length of storage significantly affected the skin communities for the unweighted UniFrac metric (P = 0.02). The remaining unweighted UniFrac distances were not significantly different by day or temperature. Blue=sample 1, red = sample 2. Open symbols = Day 3, closed symbols = Day 14. ▲= 20°C, ■ = 4°C, ● = −20°C, ◆ = −80°C. art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox Vliv laboratorní teploty na degradaci DNA art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox Vliv laboratorní teploty na degradaci DNA art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox Vliv laboratorní teploty na degradaci DNA art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox Vliv laboratorní teploty na degradaci DNA art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox Vliv skladovacích podmínek na bakteriální složení vzorku srep16350.pdf - Adobe Acrobat Pro DC • Figure 1: Species diversity following incubation under six different storage conditions : Scientific Reports - Mozilla Firefox The extent of microbiota structural and composition diversities were measured using (A) Taxa S (species richness), (B) Shannon-Weiner diversity index, (C) Simpson’s evenness index. Each point represents the diversity score for a replicate from collection 1 (●), collection 2 (▲) or collection 3 (■). Error bars represent SEM. Within-group and between-group variations were measured using Kruskal-Wallis one-way ANOVA and Mann-Whitney U-test, respectively. Significant variance is indicated by asterisks; single asterisk (*) indicates p ≤ 0.05, double asterisk (**) represents p ≤ 0.01. Vliv skladovacích podmínek na bakteriální složení vzorku Figure 2: Relative abundance at phylum level for each sample incubated under six different storage conditions. : Scientific Reports - Mozilla Firefox Vliv skladovacích podmínek na bakteriální složení vzorku Table 1: Mean difference in the relative abundance of the phyla Firmicutes Bacteroidetes, Actinobacteria and Proteobacteria in different storage conditions compared to −80°C. : Scientific Reports - Mozilla Firefox Vliv skladovacích podmínek na bakteriální složení vzorku Figure 3: Clustering of samples due to storage conditions by PCoA, based on Bray-Curtis similarity distance. : Scientific Reports - Mozilla Firefox Vliv skladovacích podmínek na bakteriální složení vzorku Izolace DNA •Nejčastěji komerčními kity – přímo dle typu vzorku (MoBio, Qiagen) •2 přístupy –Lyze buněk enzymaticky –Lyze buněk enzymaticky i mechanicky pomocí beat beateru, homogenizátoru àke vzorku se přidají kuličky z různých materiálů dle výrobce, tento krok lze přidat i u pouze enzymatických kitů •Doporučuji přidat krok s RNázou A, pokud není součástí postupu Izolace Microsoft Word - 12888.docx - PowerSoil_DNA_Isolation_Kit_Instruction_Manual.pdf - Mozilla Firefox QIAamp-DNA-Stool-Handbook---June-2012-EN.pdf - Adobe Acrobat Pro DC Cíle izolace •Získat co nejméně degradovanou DNA –Degradovaná DNA pro sekvenaci genu 16S rRNA není problém, ale pro celometagenomové sekvenování už může být – lze řešit vyřezáním z gelu •Získat co největší množství DNA (opět více důležité pro celometagenomové sekvenování) –Pokud není DNA dost – MDA (WGA) – Kontaminace izolačních kitů art%3A10.1186%2Fs12915-014-0087-z.pdf - Mozilla Firefox art%3A10.1186%2Fs12915-014-0087-z.pdf - Mozilla Firefox Kontaminace izolačních kitů art%3A10.1186%2Fs12915-014-0087-z.pdf - Mozilla Firefox Kontaminace izolačních kitů Srovnání kitů Evaluating variation in human gut microbiota profiles due to DNA extraction method and inter-subject differences - fmicb-06-00130.pdf - Mozilla Firefox Evaluating variation in human gut microbiota profiles due to DNA extraction method and inter-subject differences - fmicb-06-00130.pdf - Mozilla Firefox Srovnání kitů fmicb-06-00130.pdf - Adobe Acrobat Pro DC Srovnání kitů