Replikace nukleových kyselín Replikace = tvorba replik (kopií) molekul nukleových kyselin zajišťující přenos genetické informace z DNA do DNA nebo RNA do RNA (z mateřské molekuly se vytvářejí dvě identické molekuly dceřiné) i Charakteristické rysy replikace dvouřetězcové DNA 1. Probíhá semikonzervativním způsobem 2. Probíhá semidiskontinuálně Replikou = oblast nukleové kyseliny, která se replikuje z jednoho počátku replikace (ori) Tři možné způsoby replikace DNA Semikonzervativní Konzervativní Rodičovská DNA DNA po první replikaci DNA po druhé generaci Disperzní Semíkonzervatívní způsob replikace dsDNA Nový (dceřiný) řetězec Nový (dceřiný) řetězec Replisom (protein) Replikační vidlice (DNA + proteiny) mateřský řetězec Důkaz semikonzervativní replikace DNA (Meselson a Stáhl 1958) 14N V Q E.coli cells are grown on 15N for several generations. DNA is extracted and analyzed by CsCI density gradient centrifugation. Control Generation 0 0 Cells are then transferred to medium containing 14N for one generation. f 1 DNA is extracted and analyzed. Control Direction of sedimentation Generation 1 O For two generations. 1 JL DNA is extracted and analyzed. Generation 2 0 For three generations. rS rS rS rS DNA is extracted and analyzed. Generation 3 14N/ 15N 1,70 g/cm3 gradient hustoty l,75g/cm3 Zkumavka s roztokem CsCI Semidiskontinuální syntéza řetězců pří replikaci Směr pohybu replikační vidlice 3' 5' Parenia I DNA Předpoklady a požadavky pro replikací nukleových kyselin 1. Templát (matricový řetězec) = mateřská molekula 2. Primer = krátký oligoribonukleotid s volným 3'OH koncem (volná 3'OH skupina nukleoltidu) 3. Enzymy katalýzu jící připojování nukleotidů (polymeráza, primáza, ligáza) 4. Nukleotidy (dNTP) - ATCCGTGCTGCTTGCTTGAATACC 5'UAGGCACGA-3'OH---► RNA-primer nově syntetizovaný řetězec Syntéza DNA při procesu replikace S'-konéc fetŕb MĚÉtm o ~o-p=o o nove syntetizovaný řetězec O i O -O. O II o "O- P -O- P-O- P-0-CH2 X> l 1*1 O" o o _I difosfát HO deoxyribonukleosidtrifosfát vstupující do reakce dNTP BHBBHBÉHBHI O (T CH2 O o=p-o .1 . o templátovy řetězec T)' CH2 i 0 1 0=P-Cr Ó / 3' konoc: řetězce C — G V O O' CH2 O o=p-o n O' CH2 0 0=P-0_ 1 o O' ■p o=p-o~ I o míamiMmmM 5'-konec řetězce Směr syntézy polynukleotidového řetězce N Q) O U r) i 0 o-p=o 1 0" 5'CH 0 H 0-P=0 1 0" 5'CH^ ► OH H 5'" fosfátový konec Rostoucí řetězec Volný 3-hydroxylový ikonec 0 ť o o II » O-P-O-P-O-P-0 Ó" Ô" Ó" OH H Napojující se nukleozidtrifosfáí z Y S = báze Enzymy kooperující pří replikací a jejích funkce 1. DNA-polymerázy a DNA-primáza: katalyzují polymerizaci NTP 2. DNA-helikázy, DNA-topoizomerázy: odstranění helikálního vinutí dsDNA otevření DNA-helixu 3. SSB - proteiny: stabilizace jednořetězců 4. Iniciátorové proteiny: vazbou na ori katalyzují vytvoření replikační vidlice Počátek replikace = ori specifická sekvence na DNA (dnaA box) 9 Proteiny zajišťující replikaci u E. coli a jejich funkce Protein Gene Function DnaA dnaA Hel i case dnoB DnaC dnaC SSB ssb Primase dnaG RNase H rnhA Pol I po/A Polymerase III f a dnaE e dnaQ 9 holE p dnaN J i dnaX podjednotky <( y ^ 5 no/A 5' no/ß X ho/C ^ >)r /10/D DNA Ligase lig DNA Gyrase a g/fA ß gyrB Topoisomerase IV A parC B parE Initiation of chromosome division; binds to the origin replication Unwinds the double helix Loading of DNA helicase Single strand binding protein Synthesis of RNA primers Partial removal of RNA primers Polymerase I; fills gaps between Okazaki fragments DNA polymerase III holoenzyme strand elongation kinetic proof-reading unknown; part of core enzyme sliding clamp dimerization of core enzyme loading of sliding clamp loading of sliding clamp loading of sliding clamp loading of sliding clamp loading of sliding clamp Seals nicks in lagging strand Introduces negative supercoils Makes and seals double strand breaks in DNA ATP-using subunit Decatenation Makes and seals double strand breaks in DNA ATP-using subunit Charakteristika aktivit DNA-polymeráz • DNA-dependentní-DNA-polymerázy 1. Polymerizace nukleotidů ve směru 5' -3' 2. Odštěpování nukleotidů a) 5'-3'exonukleázová aktivita b) 3'-5'exonukleázová aktivita Odbourávání DNA (exonukleázová aktivita) Polymerizace DNA -► b) a) ■■■■■■■■■ ■■■■■■■■■ 5' 3' AGTC TCAG 3' 5' 11 n dimer , « DNA-polymerázy III E Obr. 128 Sestavování holoenzymu DNA-polymerázy III a-monomer? který katalyzuje poly-merači. Monomer a se vyznačuje již slabou polymerační aktivitou o rychlosti polymerace 8 nukleotidů/s. Nemá však exonukleázovou aktivitu; e-monomer vyznačující se Mcii-exo- nukleázovou aktivitou; G-monomer, který stimuluje účinek e-exonukleáz; y-monomer váže ATP; ô-monomer se váže na p; S'-monomer stimuluje účinek monomeru p; %-monomer, na který se vážou proteiny SSB; monomer tvoří most mezi % a y. primer strand ,J8l It t t t .o* OH -0H- lAAA AAA! AAA template strand rare tautomeric form of C 1C») happens to base-pair with A and is thereby incorporated by DNA polymerase into the primer strand T T T T # 1 A A A A A. A AAA rapid tautomeric shift of O to norma! cytosine (C) destroys its base-pairing with A Korektorská aktivita DNA-polymerázy (proofreading) 3'—► 5' exonukleázová aktivita AAA A A A| A A A unpaired 3'-0H end of primer blocks further elongation of primer strand by DNA polymerase T T T Ty^> Oh AAA A A A A A A 3'-to-5' exonuctease activity attached to DNA polymerase chews back to create a base-paired 3"-0H end on the"primer strand T T T T AAA AAAAAA DNA polymerase continues the process of adding____:_________ nucleotides to the base-paired 3'-0H end of the primer strand T T T T T on OH- počet chybně zařazených nukleotidů = 1/107 výsledný počet chybných bází = 1/109 Proč je DNA syntetizována jen ve směru 5 Makroergní vazby 000 (g) cg) (p) (p) (p) (^J TI hypotetický růst ve směru 3'->5' skutečný růst ve směru * 5'-* 3' 5' 3' (EXpXp) (p) (p) (p) (p) 0 (g) (p) Cp) < u y | i i j u íj | la OPRAVA 5' -konec vytvořený 5' 31 3' -konec vytvořený po odstranění ^ .■■/*, ^ řpWpTT po odstranění jednoho nukleotidu ^ ^ "-V S jednoho nukleotidu opravným pochodem Q O 0 opravným pochodem správný deoxyribonukleosidtrifosfát vstupující do reakce ^CpXp) správny deoxyribonukleosidtrifosfát vstupující do reakce (p) (p) (p) 0 (p) (p) (p)~~(p y g L j f ! | Reakce neprobíhá, protože není k dispozici makroergní vazba, která by se štěpila Makroergní vazba je rozštěpena, čímž se získá energie pro polymeraci DNÁ-ligázy 5'3' W 1 DNA-ligáza (ATP) OATP + dNMPn + dNMPm = AMP + PPan +dNMPn + m DNA-ligáza (NAD+) ONAD+ + dNMPn + dNMPm = AMP + nAMN + dNMPn + m 15 Dvousměrná replikace kružnicové chromozómové dsDNA prokaryot Místo ter (terminátor replikace1! ^ Asymetrie replíkační vidlice Syntéza vedoucího a opožďujícího se řetězce při replikaci bakteriálního chromozomu Struktura počátku replikace (oriC) u E. coli -245 bp- L, M, R jsou 13 bp-sekvence JGATCfTNTTNTTTT 1, 2, 3, 4 jsou 9 pb-sekvence TTATNCANA = neopakující se sekvence GATCTNTTNTTTT TTATNCANA opakované sekvence 4 opakované sekvence NV o 13 nukleotidech o 9 nukleotidech, místa vazby N iniciačního proteinu Minireplikon Předprimerová fáze replikace DNA v oriC u E. coli oriC opakované sekvence 13 bp opakované sekvence 9 bp / W // W Protein DnaA se váže na čtyři opakované sekvence 9 bp v místě or/C. protein DnaA 9 Kooperativní vazbou dalších molekul proteinu DnaA vzniká komplex s místem oriC na svém povrchu. Axxxo ■ komplex proteinu DnaA oddělení vláken začína v opakovaných sekvencích 13 bp Q Protein DnaB (DNA-helikáza) a DnaCse připojují k iniciačnímu komplexu a vytvářejí replíkačni bublinu. protein DnaB (DNA-helikáza) replikační bublina protein DnaC 19 Fungování proteinů DnaA, DnaB a DnaC při iniciaci replikace v oriC DnaA se váže na čtyři 9 bp repetice DNA se ohýbá a začíná se rozmotávat v místě tří 13 bp repeticí - zde se pak vážou DnaB a DnaC, což vede k vytěsnění DnaA a rozmotá se celá oblast bohatá na AT páry. DnaB (helikáza) vytváří dvě replikační vidlice -každou v jednom směru 20 Regulace iniciace replikace u E. coli je řízena metylací Plně metylovaný počátek replikace Inciace replikace je zahájena, pokud je dostatek živin hemimetylovaný počátek replikace Hemimetylovaný počátek replikace zabraňuje replikaci Plně metylovaný počátek replikace Plně metylovaný počátek replikace se může opět replikovat Metylaci provádí Dam-metyláza, která metyluje adenin v sekvenci GATC. 21 Iniciace replikace DNA prostřednictvím RNA-primerů ni 3' •RNA-primer '5'1M^_3'_0H ::: 5' templátové vlákno DNA DNA primáza Průběh syntézy primem dna pnmazou (DnaG) Parental DNA A) PriA DISPLACES SSB PROTEIN ..... PrlA í B) Primase binds 3'Am C) PRIMASE MAKES SHORT RNA PRIMER Priinosome ä ULJ.......I.....I, RNA primer ^1 Direction of movement of primosome DNA řetězec uvolněný z materské molekuly s navázanými SSB proteiny Vytěsněni SSB proteinem PriA - tento protein pak navodí napojení primázy (DnaG) Vazba DNA-primázy Syntéza 11-12 nt RNA primem 23 Syntéza Okazakiho fragmentů a proces jejich spojování postupným působením enzymů: 1. DNA-polymerázy 2. Nukleázy (Poli) 3. Li gázy primáza katalyzuje RNA- syntézu nových primer RNA-primerů tem plát pro váznoucí řetězec DNA-polymeráza přidává nukleotidy k RNA-primeru a zahajuje tvorbu dalšího DNA- fragmentu ■ 5'3'^M^H5' ■ DNA-polymeráza dokončuje syntézu DNIA-fragmentu starý RNA-primer je vymazán a nahrazen DNA DNA-ligáza ruší mezeru a připojuje nový DNA-fragment k rostoucímu řetězci 3" 5' HBHMMi m 5' ■:.:^:-,:.:v;-:-.;, 3' 24 Tři kroky při spojování Okazakiho fragmentů Okazaki fragment Okazaki KNA primer fragment | New DNA nucleotides inserted Pol I movement \ror SBSffi:: DNA li gase ô11 3' ,>3' Nove nasyntetizovaný řetězec tvořený Okazakiho fragmenty Vazba potymerázy Pol I a odbouráni RNA-primeru Spojení mezery v řetězci DNA ligázou 25 5 V 3' templát vedoucího řetězce / 7^ nově syntetizovaný řetězec sviraci protein opožďující se řetězec RNA-primer nový Okazakiho fragment / DNA-polymeráza na vedoucím řetězci rodičovská DNA DNA-helikáza pnmaza vazebný protein ssb pro jednoduchý řetězec templát pro opožďující se řetězec DNA-polymeráza na váznoucím řetězci (právě dokončuje syntézu Okazakiho fragmentu) Relativní poloha podjednotek DNA polymerázy replikační vidlici 11111111111111111111111 • dvě podjednotky Polili a i m 11111 m i n i n i n 111 fungují společné Směr pohybu Polili ■ 1111111111111 11111111111111 pokud by DNA nevytvořila ohyb, podjed notky by se oddělily Směr syntézy DNA TT C i ■ i * 1III —► Směr pohybu Polili ohyb DNA umožní podjednotkám zůstat pohromadě 27 Syntéza vedoucího řetězce a Okazakiho fragmentů Pro zjednodušení není zakreslena 8-svorka a ykomplex 28 Úloha podjednotek gama a beta při replikaci y -komplex Nakládá (3 -svorku na dvouřetězcový úsek složený z RNA-primeru a matricového DNA-řetězce a rozeznává RNA-primetyJéto sestavě. prodlužovaný vedoucí 5' 5f Ol - podjednotka DNA-polymerázy p -svorka Stabilizuje dvouřetězcovou strukturu a hlavně zvyšuje procesivitu DNA-polymerázy III. matricový DNA-řetězec 29 Globální pohled na průběh replikace dsDNA prodlužování vedoucího řetězce (polymerace ) Odbourávání primem z jeho 5'-konce. Přidávání nukleotidů k 3'-konci Okazakiho Spojení fragmentu. Okazakiho fragmentů. hotový hotovy \ RNA-primer Okazakiho fragment prodlužující se Okazakiho fragment >5' >3> 30 Terminace replikace bakteriálního chromozomu 11x GATC K t metylace V terminus Ter - místa (23 bp) spolu s Tus-proteinem brání pohybu helikázy a zastavují pohyb vidlice 31 Zjednodušené schéma buněčného cyklu zdůrazňující počet molekul dsDNA v chromozomech v jeho různých fázích V M-fázi proběhne mitóza O V G2- fázi se buňka připravuje k dělení. Každá molekula dsDNA sa nachází v navzájem ještě neoddělených chromatidách. Teprve v anafázi se sesterské chro-matidy oddelí v nezávislé chromozomy. buňka a j I = 2 molekuly dsDNA. Každá je v jiném chromo-omu stejného páru. čet molekul dsDNA se v každém chromozomu zdvojnásobí. Buněčný cyklus savčí buňk> s generační dobou 16 hod 32 Struktura chromozomu během dělení buňky telomera replikační počátek centromera on INTERFÁZE MITOZA i r replikační bublina Chromatinová doména = replikon část mítotického vřeténka INTERFÁZE duplikované chromosomy v oddělených buňkách Počet počátků replikace u různých organismů Organismus Počet replikonů Velikost replikonů Rychlost pohybu vidlice (E. coli) (S. cerevisiae) (D. melanogaster) (X. laevis) (M. musculus) (V. faba) 1 500 3 500 15 000 25 000 35 000 4200 kb 40 kb 40 kb 200 kb 150 kb 300 kb C 50 000 bp/min 3 600 bp/min 2 600 bp/min 500 bp/min 2 200 bp/min Rozdíly v rychlosti syntézy 34 Složky bakteriálního a eukaryotického replizomu Složka replizomu U bakterií U eukaryot Replikativní polymeráza lloloenzym polili* pola/primáza v komplexu s pol 5 Faktor zvyšující procesivitu replikativní polymeráty P-svorka PCNA Faktor nakládající (3-svorku (PCNA) y-komplex RFC Primáza jen DNA-primáza (DnaG-protein) komplex pola/primáza Helikáza DnaB-protein, n-protein ? Odstranění primem DNA-polymeráza I exonukleáza MF1 Oprava opožďujícího se řetězce DNA-polymeráza I a DNA-li gáza Komplex pol &7pol e ? a DNA-ligáza DNA-topoizomeráza II (gyráza) II Proteiny vázající se na jednořetězcové úseky DNA SSB-proteiny replikační protein A (RP-A) nebo lidský SSB (HSSB) Eukaryotícké DNA-polymerázy • a Syntéza Okazakiho fragmentů, 3 -5' exonukleáza Je v komplexu s DNA-primázou • ó Syntéza vedoucího řetězce a dokončení syntézy opožďujícího se řetězce 3 -5' exonukleáza • £ Neznámá funkce (možná syntéza vedoucího řetězce) • B Syntéza krátkých řetězců při reparaci DNA • y Syntéza mitochondriové DNA Odstranění RNA-primerů z Okazakiho fragmentů: Ribonukleáza Hl, Ribonukleáza FEN-1 Přehled vlastností a funkcí eukaryotíckých DNA-polymeráz Proliferační buněčný antigen (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) ~ß-svorka Označení, u savců .Označení u kvasinek Umístění Počet podjedno- Polyrňerá-zová aktivita • 5'-3' Esonukleá-zová aktivi- Sdružené faktory Procesivita Funkce poli v jádře + mirna začátek syntézy Okazakiho fragmentů primery pol4 v jádře nízká oprava poškozené DNA polM v mito-chondriích + pol3 v jádře vysoká katalýza replikace v mito-chondriích vysoká ve sdružení s PCNA syntéza prodlužujícího se řetězce a dokončení syntézy Okazakiho fragmentů pol2 v jádře >1 vysoká neznáma 37 Struktura počátku replikace u kvasinek Soubor proteinů = ORIZOM transkripční faktory :xoiiioí proteiny rozeznávající transkripční počátek replikace (oři) faktory I DNA OHlCiHOOC sekvence potřebná k odvíjení DNA vazebné místo pro transkripční faktory sekvence, na níž se zahajuje odvíjení DNA vazebné místo pro transkripční faktory rozeznávací sekvence počátku replikace 1. Vazba inciačních proteinů na sekvenci ore (helikáza, polymeráza atp) 2. Vazba transkripčních faktorů a jejich interakce s proteiny v místě ORE 3. Iniciace replikace, rozmotání DNA v místě DUE Různé transkripční faktory aktivují různé počátky replikace Před zahájením replikace se poblíž počátku replikace naváže RLF (replication licensing factor), který je po zahájení replikace odstraněn: koordinace iniciace mnoha ori 38 Iniciace replikace u eukaryot - rozdíly oproti bakteriím A) B) C) D) RNA primer 3' «. Sliding clamp PCNA iDNA a) Primáza syntetizuje RNA-primer, poté se važe DNA polymeráza a, která nasyntetizuje i DNA (iniciátorova DNA). RFC slouží u eukaryot k nakládání PCNA podobně jako y komplex k nakládání beta-svorky u E. co li b) RFC nasedá na iDNA RFC napomáhá navázat DNA-polymerázu ô a PCNA protein (trimer) DNA-polymeráza ô pak prodlužuje nový řetězec DNA 39 Základní složky replizomu eukaryot replikační faktor C Schéma replikační vidlice eukaryotické jaderné DNA nové nukleozomy staré nukleozomy Staré a nové nukleozomy se na matricových a podle nich syntetizovaných komplementárních řetězcích rozdělují náhodně Na obrázku je pro jednoduchost schématického vyjádření nukleozom znázorněn jako tetramer histonů. Ve skutečnosti však jde o oktamer. ds DNA nukleozom Nukleozomy se rozpadají při replikaci. JS-fS-tt\ ^^ssDNA nové histony zásoba histonů _ re konstituce nukíeozomů ©e staré histony 41 Sestavování nukleozomů během replikace sestavování nukleozomů během replikace chromozomu nukleozomový sestavovací protein-1 <«.........................w& transport histonů z cytoplazmy do jádra (b) cytoplazma jádro 5' 3' 1 5' 3' m \ c o 5'™er^ chromatinový sestavovací faktor-1 histonu , (CAF.1}^ zralé nukleozomy nově sestavené nukleozomy "transport histonů k místu replikace DNA rodičovský nukleozom 42 Problém doreplikování 3'konců lineárních chromozomů problém s primerem pro telomery na opožďujícím se vlákně konec směřující k centromere vzdálený konec telomera 3' 11111111111111111 iTTf 1111111ii1111iii m 11111111 - o \ i_ -V Okazakiho fragment RNA-primer je odbourán y Potenciálne i i i i i i i i ITTTTTTn 11 i i i i.....1nedoreplikovaný 3.........HI...........II.....5' U 3 konec 3-OH skupina není kdispozici pro kovalentní prodloužení (a) 43 Struktura telomerázy TERT = telomerase reverse transcriptase; TR (TERC) = telomerase RNA 44 Telomeráza řeší problém koncového primem. ___________^rodičovské dákno y 1 1 TŤaGGGŤT AGGGŤf AGGGŤ Ta" i t f i ň~jľT-~neúplné, nově syntetizované opožefujici se vlákno telomeráza 11TTAGGGTTAGGG |AATCCC TTAGGGTTAGGGTTA I Dokončeni komplementárního vlákna DNA-polymerázou (DNA-dependentni syntéza DNA). . i . i i »/""^ 11,111 TTAGGGTTAGGG TTAGF6GTTAGAG T TA Z G C t t a A.A3HBAAUCCC \ 5' RNA-primer DNA-polymeráza Funkce telomerázy parental strand / 3' TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG 5'X incomplete, newly synthesized lagging strand ]AACCCCX Vazba telomerázy ^ ^ ; 1TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG 3AACCCC 5' Telomeráza prodlužuje 3'konec ACCCCAACpHr direction of telomere synthesis telomerase with bound RNA template 3' ^r:'~' - TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG ]MCCCC ^ACCCCAAC Dokončení syntézy opožďujícího se řetězce DNA-polymerázou 5' 3' ]TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG ]AACCCC .CCCCAACCCCAACCCC W * DNA polymerase Sekvence telomer různých organismů TTGGGG T2G4 u Tetrahymena thermophila a Glaucoma chat toni ITTTGGGG - T4G4 u Eupiotes aedicuiatus a Oxytricha nova T3A1G3 u Arabidopsis thaiiama TG3 u Saccharomyces cerevisiae T2A^ u člověka, myší, a Trypanosoma brucei f asi 1000 kopií na konci každé telomery 5' GGGTTA 3' TTTAGGG TGGG TTAGGG 47 Prodlužování telomer u drosofily Mobilní elementy (retrotranspozony) Het-A, TART a Tahre (telomere associated retrotranspozon) Přednostně se transponují do koncových oblastí chromozomů a tím je prodlužují HeT-A Gag tart (telomere associated retrotransposon) Tahre ,] Gag j pol ľ " Iaaaaa The three D. melanogaster telomere retrotransposons drawn as their putative RNA transposition intermediates. Coding regions, Gag and Pol, are labeled. Gray regions indicate 5' and 3' untranslated regions. AAAA indicates the 3' poly(A) tail on each RNA. It is the source of the (dA/T)n that joins each DNA copy to the chromosome when the element transposes. Sizes are only approximate because individual elements can differ in length of both coding and noncoding regions. HeT-A elements are~6 kb. The 5' end of TART has not been completely defined but subfamilies appear to be 10-13 kb. Tahre is~10.5 kb 48 Srovnání prodlužování telomer telomerázou a retroelementy Telomerase katalytická podjednotka nekomplementární sekvence 49 In Drosophila, the role of telomerase is carried out by three specialized retrotransposable elements, HeT-A, TART and Tahre. Telomeres contain long tandem head-to-tail arrays of these elements. Within each array, the three elements occur in random, but polarized, order. Some are truncated at the 5' end, giving the telomere an enriched content of the large 3' untranslated regions which distinguish these telomeric elements from other retrotransposons. Thus, Drosophila telomeres resemble other telomeres because they are long arrays of repeated sequences, albeit more irregular arrays than those produced by telomerase. The telomeric retrotransposons are reverse-transcribed directly onto the end of the chromosome, extending the end by successive transpositions. Their transposition uses exactly the same method by which telomerase extends chromosome ends—copying an RNA template. In addition to these similarities in structure and maintenance, Drosophila telomeres have strong functional similarities to other telomeres and, as variants, provide an important model for understanding general principles of telomere function and evolution 50 Telomerová opakování ~ mechanismus pro kontrolu buněčného dělení • při narození mají v somatických buňkách telomery úplnou délku • při každém dělení buňky ztrácí telomera 50-100 nt • po mnoha děleních zdědí buňky defektní chromozomy a dochází k zástavě dělení buněk = replicative cell senescence • Mechanismus zajišťuje, že nedochází k nekontrolovatelnému dělení buněk („measuring stick") O lidské fibroblasty ve tkáňové kultuře - po 60 děleních buněk dochází k zástavě tvorby telomerázy O po vložení genu s aktivní telomerázou se délka telomer udržuje a buňky nestárnou O Vnesení genu pro telomerazu do myší prodlouží jejich život o 1A O Deregulace exprese telomerázy může vést k onkogenezi Další funkce telomerázy O Reparace DNA 51 Replikace DNA mechanismem otáčející se kružnicí Template is circular duplex DNA Initiation occurs on one strand 3'-OH _Q_ < Nick at origin I Elongation of growing strand displaces old strand After 1 revolution displaced strand reaches unit length Continued elongation generates displaced | strand of multiple unit lengths 52 Replikace virových molekul otáčející se kružnicí Synth ksis of a secqnd strano of ona New complementarv strand of ONA _______/_ 53 Replikace plazmidů a virů otáčející se kružnicí b) I konkatemer <— J JL__ h komplementárni (kohejrii^ konce i komplementárni (kohézni) konce Replikace genomu adenoviru (též některé bakteriofágy) Specifický protein pro iniciaci replikace Ostatní viry: vlastní DNA polymerázy nebo DNA-polymerázy hostitele; proteiny pro iniciaci replikace; retroviry: RT 56