Imunitní systém Imunitní systém (IS) – mechanismy zajišťující homeostázi organismu obranyschopnost – rozpoznání cizích složek a škodlivin (patogeny a jejich toxiny) autotolerance – poznání vlastních složek imunitní dohled – vnitřní škodliviny – odstraňuje staré, poškozené nebo nádorové buňky Antigen = jakákoliv substance vyvolávající imunitní odpověď Epitop = část antigenu rozpoznávaná imunitními receptory Druhy imunity (obratlovci) a) nespecifická, přirozená (neadaptivní) = vrozená, evolučně starší. Nemá imunologickou paměť. buněčná složka: fagocyty a cytotoxické látky humorální – komplement, interferony, lektiny, sér. proteiny + mechanické zábrany (kůže sliznice), pohyb řasinek, proudy vzduchu a tekutin + chemické – mastné kyseliny, pH, enzymy lysozym, pepsin, defensiny + mikrobiální – přirozená mikroflora, kompetice (mikrobiom) b) specifická (adaptivní) – antigenně specifická, má imunologickou paměť, prostřednictvím protilátek a receptorů specifických pro Ag humorální – protilátky, B-buňky (BCR) buněčná – T-buňky Vznik B-lymfocytů Primární lymfoidní orgány Reakce lymfocytů s antigeny a jejich aktivace bursa Fabricii kostní dřeň thymus (brzlík) sekundární lymfoidní orgány tvorba protilátek (Ab, imunoglobulinů) IgM, IgD sekretované (krátkodobě) ++ AgAg Klonální selekce – diferenciace B-lymfocytů Kmenová buňka Pre-B-lymfocyt - přeskupení subgenů pro H-řetězec, vznik IgM-cytoplazm. Nezralé B-lymfocyty - přeskupení subgenů pro L-řetězec, vznik IgM-membr. Zralé B-lymfocyty - první přesmyk tříd IgM -IgD (membr.) Plazmatické b. + paměťové b. = primární odpověď = sekundární odpověď + antigen vysoká tvorba IgA, IgE, IgG Struktura imunoglobulinů lehkého řetězce CL Struktura protilátky CH2 CH3 CH4 CL VL VH CH1 ~~~~ pantová oblast C1-doména V-doména těžký řetězec lehký řetězec hypervariabilní oblasti C domény tvoří Fc = oblast Ig, která zodpovídá za efektorové funkce Lehký řetězec ~ 220 aa vazba antigenu Těžký řetězec ~ 440 aa C2-doména H L Charakter vazeb: iontové interakce, hydrofobní a van der Waalsovy síly, vodíkové můstky. Síla interakce = avidita (pevnost vazby Ag-Ab). Oblasti hypervariability ve variabilních doménách HV = hypervariabilní oblast; FR = „framework regions“ Frekvence výskytu různých aminokyselin Lokalizace hypervariabilních oblastí na lehkém řetězci Ig Každá hypervaribilní oblast má jen 5 až 10 aa, které se účastní vazby antigenu. Antigen (dva hapteny) Interakce imunoglobulinů s antigeny Typy imunoglobulinů a jejich funkce v organismu klasifikace podle typu těžkých řetězců <1%alergické reakceεIgE 14% součást slin a sekretů αIgA 80% aktivuje komplement γIgG 1% Uvolňopvání histaminu, podíl na alergiích δIgD 5% aktivuje komplement µIgM ProporceFunkceTěžký řetězec Typy imunoglobulinů Komplement – systém sérových proteinů aktivovaných komplexy protilátka-antigen nebo mikroorganismy. Pomáhá eliminovat patogenní mikroorganismy navozením jejich lyze nebo fagocytózy Klasifikace imunoglobulinových řetězců Lehké řetězce (light) VLCL ..... VκCκ nebo VλCλ (tj. 2 typy lehkých řetězců) Těžké řetězce (heavy) VHCH ..... VHC VHCγ VHCα VHCδ VHCε (tj. 5 typů těžkých řetězců) IgM IgG IgA IgD IgE (5 Ig tříd) Skupina imunoglobulinů stejného typu těžkého řetězce tvoří imunoglobulinovou třídu V = variabilní oblast , C = konstantní oblast Lehký řetězec Těžký řetězec Geny pro lehké řetězce: L-VJC Geny pro těžké řetězce: L-VDJC Subgeny = úseky genů pro imunoglobuliny L-subgen V-subgen C-subgen J-subgen D-subgen signální peptid konstantní oblast většina variabilní oblasti část variabilní oblasti VL a VH část variabilní oblasti VH Subgeny Obecná sestava genů Genové segmenty J – joining, D - diversity Organizace lidských genů kódujících imunoglobulinové řetězce těžký řetězec lehké řetězce Lehký řetězec kappa: 250 V-subgenů + 4 J-subgeny + 1 C-subgen 250 x 4 x 1 = 1 000 kombinací (lehkých řetězců) Těžký řetězec: 1000 V-subgenů + 15 D-subgenů + 4 J-subgeny + + 8 C-subgenů 1 000 x 15 x 4 x 8 = 480 000 kombinací (těžkých řetězců) Celkem možných kombinací obou typů řetězců: 1 000 x 480 000 = 480 000 000 kombinací (kompletních řetězců) Přeskupování subgenů a kombinace řetězců jako zdroj variability Ig nahodilost kombinací - dvojčata Procesy upravující geny pro tvorbu protilátek Změny na úrovni DNA: přeskupování subgenů a) kódujících variabilní oblasti (V-J; V-D-J) – dosažení vysoké vazebné specificity protilátky vůči antigenu b) kódujících konstantní oblasti (výběr C subgenů) – optimalizace efektorových funkcí 2. Změny na úrovni transkripce: alternativní sestřih, alternativní zakončení transkripce: přechod membránově vázané formy protilátky na sekretovanou, přechod IgM na IgG 3. Aktivace rodičovských genů: alelická a izotypová exkluze Exprese genu pro lehký imunoglobulinový řetězec 1. přeskupení subgenů 2. transkripce 3. sestřih 4. translace 5. odstranění sign. peptidu vzdáleny mnoho kb Přeskupování subgenů pro těžký imunoglobulinový řetězec 1. D-J 2. V- DJ Molekulární mechanismus přeskupování subgenů Lehký řetězec kappa v zárodečné linii Těžký řetězec Platí pravidlo 12/23 mezerníky 12 nemohou se přímo spojovat V-J – oba mají 23 bp vznik nepřesných spojení Přeskupení subgenů procesem V-J somatické rekombinace RAG1 a RAG2 proteiny = V(D)J rekombináza (recombination-activating gene) Heptamer-mezerník-nonamer = recombination signal sequence (RSS) 12 a 23 bp mezerníky Spojování genových segmentů J a V Schematické znázornění vzniku nepřesných spojení mezi D a J a) vytvoření smyčky po spárování nonamerů a heptamerů b) vyštěpení smyčky rekombinázou c) působením terminální transferázy, DNA-polymerázy a ligázy se konce D a J spojí - v místě spojení je krátká náhodná (nově vytvořená) sekvence Průběh spojování subgenů D a J – vznik variabilních spojení komplex rekombinázy RAG vytváří na heptamerových sekvencích vlásenky, které následně štěpí Terminální deoxynukleotidyl transferáza (TdT) připojuje náhodně nukleotidy (N) na konce jednořetězců Nespárované nukleotidy jsou odstraněny exonukleázou a jsou nahrazeny reparační syntézou P = palindromové nukleotidy tvořící vlásenku, N = „netemplátové“ nukleotidy Produktivní a neproduktivní spojení Nepřesná spojení mezi V a J subgeny vytvářejí další zdroj rozmanitosti protilátek šest možných způsobů spojení V a J Aktivace transkripce po přeskupení subgenů Specifický TF OCT-2 se tvoří až v pre-B-lymfocytu Transkripce probíhá jen z promotoru toho V subgenu, který je nejblíže zesilovači přeskupení P V zesilovač Působení zesilovače Izotypový přesmyk Přesmyk tříd = přechod Ig z jedné třídy do jiné Probíhá na úrovni těžkých řetězců Variabilní oblast těžkého řetězce zůstává zachována, mění se konstantní oblast, zodpovědná za efektorové funkce A. Přesmyk na úrovni transkripce (úprava mRNA) přechod z IgM z membránového na sekretovaný přechod z IgM na IgD přepis překrývajících se transkripčních jednotek ze stejného promotoru, končících různými polyadenylačními signály (terminátory) B. Přesmyk na úrovni DNA vytvořený exon L-VDJH se připojuje k různým subgenům C po deleci sekvence mezi J a některými C přesmyk je řízen signály přesmyku (S) = sekvence na 5´konci CH subgenů za účasti enzymů Charakteristika izotypů lidských imunoglobulinů Převzato: Hořejší, Bartůňková 2002 Průběh přeskupování subgenů a alternativní sestřih hnRNA u těžkých řetězců – změny na úrovni transkripce IgM IgD M S DNA RNA Alternativní zakončení transkripce Formy protilátek (imunoglobulinů) Dvě formy protilátek (imunoglobulinů) Povrchové n. transmembránové = BCR-receptor (B-lymfocytový receptor) = receptor pro antigeny, zajišťuje přenos signálu do buňky Sekretované = uvolňované do prostředí Vznik membránové formy IgM mebránová forma Transkripce končí na druhém (vzdálenějším) terminátoru a sestřihem je odstraněn úsek RNA kódující hydrofilní aminokyseliny (SC). Vytváří se protilátka IgM, která je ukotvena v membráně. Membrane-coding sequence MC sekvence určující zakotvení v membráně 1. 2. terminátor Sekvence odstraněná sestřihem Vznik sekretované formy IgM sekretovaná forma Transkripce končí na prvním terminátoru, vzniklý transkript neobsahuje část kódující hydrofobní aminokyseliny (MC) a vzniká protilátka, která se uvolňuje z buňky Secretion-coding sequence Sekvence určující uvolnění protilátky z buňky 1. terminátor Změnu v RNA transkriptu H-řetězce indukuje aktivace B buňky antigenem Makrofág, který se pomocí svého Fc receptoru váže na protilátky, které opsonizují povrch bakterie Opsonizace = navázání určitých látek na povrch antigenu, které navozuje jeho fagocytózu imunitními buňkami. Opsoniny = látky, jež se vážou na povrch antigenů. Mezi nejčastější opsoniny patří protilátky a složky komplementu C Koexprese IgM a IgD regulovaná úpravou transkriptu Exprese IgM Exprese IgD Ve zralých B-buňkách začíná transkripce na promotoru VH a pokračuje přes exony Cµ a Cδ. Ukončení transkripce v pA1 a následný sestřih vede k tvorbě mRNA kódující těžký řetězec µ, zatímco ukončení transkripce v pA2 a následný odlišný způsob sestřihu odstraní exony Cµ a vzniklá mRNA pak kóduje těžký řetězec δ. Oba způsoby transkripce mohou probíhat paralelně, takže v buňkách dochází k současné produkci IgM a IgD Přesmyk tříd (izotypový přesmyk) při diferenciaci B lymfocytů Genový komplex po V-D-J přeskupení Vyštěpení části DNA kódující těžký řetězec Přepis a sestřih RNA . Signály přesmyku (S) GAGCT)nGGGGTDNA je deletována Regulace cytokiny třída IgE (např) S M Přesmyky tříd probíhající u těžkých řetězců Časný přesmyk probíhající na úrovni transkripce a sestřihu u naivních B buněk (které se dosud nesetkaly s antigenem) nejdříve vzniká jen Cµ, později též Cδ. Pozdní přesmyk probíhající intrachromatidovou rekombinací během zrání B buněk (v jednom nebo více krocích) .signály přesmyku chybí signál přesmyku Izotypové přesmyky mohou probíhat sekvenčně, dokud je možné zatím nevyštěpené C subgeny eliminovat Přesmyk v jednom kroku Přesmyk ve více krocích Alelická exkluze Během vývoje B-buňky jsou aktivovány pouze geny jednoho z rodičů (nejasný mechanismus) Izotypická exkluze Z lehkých řetězců je aktivován pouze jeden z možných typů: lambda nebo kappa Výsledná buňka tvoří protilátku obsahující jedinečné vazebné místo pro antigen Alelická a izotypová exkluze Monospecifická protilátka Časový průběh vytváření H- a L-řetězců protilátek 1. Nejdříve se v pre-B lymfocytu vytvoří těžký řetězec typu µ – probíhají pokusy o přeskupení u obou alel – jakmile se to u jedné podaří, přeskupování u druhé alely se zastaví. 2. Zatím však není vytvořen lehký řetězec a těžký řetězec se páruje s „náhradním“ L- řetězcem (ψL), složeným ze dvou malých proteinů. Vzniká pre-B receptor. 3. Po obdržení signálu (??) z jiných buněk začne přeskupování subgenů pro L- řetězec. 4. Nejdříve se začnou přeskupovat subgeny pro L řetězec typu κ. Pokud vznikne funkční L řetězec, zastaví se přeskupování druhé alely κ. Pokud ne, začnou se obdobně přeskupovat alely λ. Pokud se to nepodaří a nebo se vytvoří L řetězec, který se nemůže spojit s H řetězcem, pre-B lymfocyt hyne. Vznik somatických hypermutací v přeskupené variabilní oblasti imunoglobulinového řetězce (afinitní maturace) Vznikají různé typy mutací, z nichž některé vedou k zesílení vazby antigenu protilátkou – buňky, které takové protilátky tvoří, proliferují. Deaminace cytozinu na uracil, pak reparace Rozptýlené mutace v oblasti V Akumulace více mutací v oblasti V Negativní selekce Proliferace B buněk silně vázajících antigen 6. den 8-16 dní Příčina rozmanitosti protilátek (specifita vazby antigenů) 1. Přeskupování V-D-J-subgenů – somatická rekombinace, náhodné spojování V, D a J 2. Nepřesná spojení V-J (V-D-J) – delece, inzerce, reparace v místech spojování subgenů 3. Kombinace lehkých a těžkých řetězců – náhodný proces 4. Somatické hypermutace v okolí V – vysoká frekvence mutací po styku zralého B-lymfocytu s antigenem Humorální imunitní odpověď k infekci zprostředkovaná B-buňkami 1. Makrofág pojme antigen 2. Makrofág antigen zpracuje a jeho složky vystaví na povrchu prostřednictvím MHC II 3. Antigen je rozpoznán pomocnou T buňkou, která (4) aktivuje Bbuňky, které rovněž nesou části antigenu 5. Aktivované B buňky se buď diferencují na paměťové buňky (5a), nebo se z nich stávají plazmatické buňky sekretující antigen (5b) 6. Protilátky vážou antigen, tím vytvářejí komplex, který je zničen makrofágem Vysoká frekvence mutací Sekundární odpověď aktivace MHC-molekuly (glykoproteiny) hlavní histokompatibilní komplex (major histocompatibility complex) - lidské MHC: HLA (human leucocyte antigens) Funkce MHC glykoproteinů vazba peptidových fragmentů cizorodých proteinů (antigenů) a vystavovat je na buněčném povrchu tak, aby byly potenciálně rozpoznatelné T lymfocyty. MHC gp I - jsou na všech buňkách organismu: vazba peptidů produkovaných buňkou po odbourání struktur patogena (bakterie, viry) MHC gp II - jsou na buňkách prezentujících antigen: vazba peptidů pohlcených buňkou a odbouraných makrofágy a B- lymfocyty Globální schema humorální a buněčné imunitní odpovědi Humorální imunita - zprostředkovaná B-lymfocyty (3,5,7) Buněčná imunita - zprostředkovaná T-lymfocyty Rozpoznání buněk infikovaných virem T-lymfocyty komplex MHC gpI-peptid je rozpoznán TCR, signál navodí v T-buňce tvorbu enzymů degradujících infikovanou buňku TCR-vazba antigenu CD3 - Přenos signálu CD4 - koreceptor rozpoznávající komplex MHC- peptid Zánětlivá reakce Tvorba protilátek Po navázání T-buňky na B-lymfocyt prezentující antigen začíná Tbuňky syntetizovat lymfokiny, které pak stimulují proliferaci jak Tbuněk tak i B-lymfocytů, které se pak mění na plazmatické buňky vytvářejí velká množství protilátek IL = interleukin, TNF = tumor nekrotizující faktoir, IFN- interferon Antigen (virus) je zachycen receptorem (protilátkou) na povrchu B-lymfocytu, který je tím aktivován, proliferuje a diferencuje se na plazmatické buňky, které pak uvolňují protilátky do prostředí. Uvnitř B-lymfocytu je antigen rozložen na peptidy, které jsou prostřednictvím MHC zanořeny do povrchu, kde je rozeznávají T-lymfocyty. T-lymfocyty tvoří cytokiny, které stimulují proliferaci plazmatických buněk tvořících protilátky. V lymfatických uzlinách se vytvářejí makrofágy pohlcující antigeny, které jsou v nich rozloženy na peptidy a pomocí HMC vystaveny na povrch, kde jsou rozpoznány T-lymfocyty – ty zvyšují aktivitu makrofágů tvorbou cytokinů (interferon). Somatické buňky infikované viry (bakteriemi) je rozloží na peptidy, které pomocí MHC vystaví na povrch, kde jsou rozpoznány T-lymfocyty a dochází k indukci apoptózy.