Speciální metody analýzy mikroorganizmů I (Bi6721) Jana Kopecká Milan Bartoš Přírodovědecká fakulta MU Brno, Ústav experimentální biologie, Oddělení mikrobiologie Obsah Vzor protokolu.. 1 Amplifikace genu pro 16S rRNA z bakteriálních lyzátů kultur z čeledi Pasteurellaceae. 3 Elektroforéza produktů PCR v agarózovém gelu.. 7 Purifikace produktů PCR.. 11 Elektroforéza purifikovaných produktů PCR, kvantifikace, příprava pro sekvenování 12 Analýza výsledku sekvenování 13 Izolace bakteriální DNA z Escherichia coli 16 Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky.. 18 Izolace genomové DNA z biologického materiálu.. 20 Detekce Chlamydia trachomatis metodou PCR (end-point). 22 Detekce Chlamydia trachomatis metodou real-time PCR.. 25 Izolace DNA z kvasinek, gelová elektroforéza, PCR ITS regionu pro odlišení komplexu Saccharomyces sensu stricto 27 Informační panel - Základní data o nukleových kyselinách a proteinech.. 33 Informační panel - Vzorce užitečné pro design PCR.. 34 Informační panel - informace užitečné pro práci s PCR.. 35 Informační panel - Tabulka standardního genetického kódu.. 36 Informační panel- Parametry prokaryotické buňky.. 37 Vzor protokolu Protokol, zpracujte ve formě laboratorního deníku, tzn., že si jej předem připravte a vyplňte (možno i elektronicky). Ve cvičení pak do protokolu vyplňujte pozorování, výpočty, získaná data. Následně pak (nejlépe v rámci cvičení) vypracujte Závěry a Diskusi. Záznamy z přístrojů získané v průběhu cvičení nebo sekvenační data doložte jako Přílohu. Protokol odevzdejte ihned po skončení cvičení, nejpozději ve cvičení následujícím. Protokol z laboratorního cvičení [Název cvičení] Jméno studentky/ta: Datum provedení: Princip úlohy: Stručně v jedné větě Změny oproti návodu: Uveďte rovněž, pokud změny oproti návrhu nebyly Řešení doprovodných úloh: Řešení úloh uvedených na konci příslušného návodu ke cvičení Výsledky: Sem napište veškerá pozorování, získaná data, výpočty Diskuse: Podrobně diskutujte získané výsledky Závěr: Napište, co vám cvičení přineslo Přílohy: Přiložte záznamy získané z přístrojů v průběhu cvičení, sekvenační záznamy apod. Amplifikace genu pro 16S rRNA z bakteriálních lyzátů kultur z čeledi Pasteurellaceae (cvičení č. 1) Úvodní slovo Přesná klasifikace řady bakteriálních druhů, a nejen zástupců čeledi Pasteurellaceae, není někdy standardními mikrobiologickými a biochemickými testy možná, a proto se stále častěji používá analýza sekvencí některých evolučně konzervativních genů. Jako vhodným se jeví sekvence genu pro 16S rRNA. Tento gen obsahuje jak konzervativní oblasti, které jsou vhodným místem pro návrh primerů pro sekvenování, tak i variabilní úseky, kterými se jednotlivé bakteriální druhy a poddruhy liší. Úsek genu vyznačený dvěma konzervativními primery je amplifikován a poté sekvenován. Získaná sekvence je opravena, nepřesné úseky jsou eliminovány a výsledný sled nukleotidů je porovnán s obdobnými sekvencemi v genové bance (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). K tomu lze použít standardních prohledávačů umístěných na www stránkách „National Center for Biotechnology Information“ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Jedním z nich je prohledávač označovaný jako BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Pracovat s tímto nástrojem se naučíte ve cvičení č. 3b. Pro diferenciaci mezi zástupci rozsáhlé čeledi významných zvířecích i lidských patogenů se používá také dalších genů, např. provozního genu rpoB, který kóduje β podjednotku RNA polymerázy nebo provozního genu infB, který kóduje translační iniciační faktor IF2. Tyto geny jsou vhodné např. pro diferenciaci druhů Pasteurella, Mannheimia, Moraxella. Postup je stejný jako v případě amplifikace a sekvenování genu pro 16S rRNA. Jen primery a podmínky PCR jsou odlišné. Toto cvičení sestává ze dvou částí 1) Přípravy bakteriálních lyzátů z kultur čeledi Pasteurellaceae 2) Amplifikace jednoho ze tří výše jmenovaných genů, my provedeme amlpifikaci genu pro 16S rRNA Pro amplifikaci genu pro 16S rRNA použijeme primerů podle publikace (podle Simmon et al. 2006), a to jako forward primer sekvenci 5F (5´- TTG GAG AGT TTG ATC CTG GCT C - 3´) a jako reverse primer sekvenci 1194R (5´- ACG TCA TCC CCA CCT TCC TC - 3´). Délka výsledných aplikonů bude pro zástupce čeledi Pasteurellaceae přibližně 1 190 bp. Cíl cvičení Připravit jednoduchou metodou lyzáty z kultur bakterií čeledi Pasteurellaceae rostoucích na pevné půdě ve formě kolonií pro provedení metody PCR. Provést amplifikaci genu pro 16S rRNA, který lze následně použít pro diferenciaci bakterií sekvenováním. Seznam přístrojů * laminární box * vodní lázeň nebo suchý blok * třepačka Vortex * centrifuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 14 000 rpm (20 000 g) * pikofuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 6 000 rpm * sada pipet o objemech 20, 200 a 500 ml * termocykler Vlastní pracovní postup Příprava bakteriálního lyzátu 1) Naberte bakteriální kolonii kličkou a resuspendujte ji v 50 µl deionizované vody 2) Povařte v suchém bloku 5 min. při 98°C 3) Centrifugujte 3 min. při 14 000g 4) Lyzát uchovávejte v ledničce při 4°C až 8°C 5) Pro PCR odeberte 2 µl supernatantu Polymerázová řetězová reakce 1) Vytáhněte polymerázu (Maxima™ Probe qPCR Master Mix 2X, „FERMENTAS“), primery a vodu z mrazničky a nechejte rozpustit při laboratorní teplotě (asi 5 minut) 2) Uracil-DNA glykosyláza vyndejte z mrazničky bezprostředně před použitím 3) Namíchejte směs pro 10 reakcí PCR podle následující tabulky: Komponenta Množství na 1 reakci (v µl) Množství na 10 reakcí (v µl) MasterMix 18,0 180,0 Primer 5F (100 µM) 0,1 1,0 Primer 1194R (100 µM) 0,1 1,0 Uracil DNA glykosyláza 0,1 1,0 Deionizovaná voda 7,7 77,0 DNA (lyzát) 2,0 - CELKEM 20,0 á 18,0 4) Dobře promíchejte pipetou opatrným natažením a vypuštěním (neprobublávat, nevytvářet bublinky) asi 5x 5) Rozpipetujte směs do jednotlivých zkumavek po 18 µl 6) Přidejte po 2 µl lyzátu a do poslední zkumavky jen vodu 7) Zkumavky dobře uzavřete, krátce stočte kapalinu na pikofúze a vložte zkumavky do termocykleru 8) Amplifikujte podle následujícího programu pro amplifikaci: Program pro amplifikaci Krok Teplota Čas 1 37°C 2 min. 2 94°C 15 min. 3 94°C 30 s 4 60°C 30 s 5 72°C 2 min. 6 GO TO 2 29x 7 72°C 2 min. 8 10°C ∞ 9) Po ukončení amplifikace proveďte elektroforézu v 1% agarózovém gelu podle cvičení 2a. Další informace k této problematice najdete v následující literatuře Christensen H. and Bisgaard M. 2010: Molecular classification and its impact on diagnostics and understanding the phylogeny and epidemiology of selected members of Pasteurellaceae of veterinary importance. Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 123, Heft ½, Seiten 20-30. Simmon K.E., Croft A.C., Petti C.A. 2006: Application of SmartGene IDNS Software to Partial 16S rRNA Gene Sequences for a Diverse Group of Bacteria in a Clinical Laboratory. Journal of Clinical Microbiology 44(12), 4400-4406. Kontrolní otázky a příklady 1) Limit detekce DNA na transluminátoru je přibližně 5 ng. Kolik cyklů PCR musí proběhnout, aby bylo možno detekovat amplifikační produkt genu pro 16S-rRNA o délce 1 190 bp, jestliže na počátku reakce máte ve směsi pouze jedinou kopii genu? 2) Taq polymeráza připojuje nukleotidy rychlostí 150 nukleotidů/sekundu. Jak dlouho trvá tomuto enzymu, než syntetizuje fragment o délce 1 190 bp? 3) Jaké množství dNTP potřebujete dát minimálně do PCR reakce, abyste měli dostatek stavebního materiálu k amplifikaci fragmentu o délce 1 190 bp (za předpokladu, že ve fragmentu je rovnoměrné zastoupení všech nukleotidů)? Předpokládejte, že chcete získat 200 ng fragmentu a máte k dispozici zásobní roztok směsi všech čtyř nukleotidů, ve které má každý nukleotid koncentraci 25 mM. 4) Jak dlouhý amplikon může vzniknout na níže popsaném úseku DNA (je uveden pouze jeden z komplementárních řetězců) pokud má experimentátor k dispozici následující dvojici primerů? Primer forward: Primer reverse: 5´- ATG TGA GCG GTC TAC TGG - 3´ 5´- GAT AGC TAG AAT TGA TAG - 3´ Sekvence, na které probíhá amplifikace: 5´- ATG TGA GCG GTC TAC TGG AAA TGC AGT GCA TCA GTC AGC GAT GGG TGA GTC ACC CCC GTC ACG TCA GAT TCA TGA CTA AGC GTC CGT GCT TGA TCG AGT CTA TCA ATT CTA GCT ATC ATC ATG GTT GAC ATC - 3´ 5) Jedna jednotka enzymu Taq polymerázy inkorporuje 10 nmol nukleotidů za 30 minut při teplotě 72 °C. Přepočtěte tuto hodnotu na počet inkorporovaných nukleotidů za minutu. 6) Jestliže frekvence začlenění chybného nukleotidu činí u Taq polymerázy 285 x 10^-6, kolikrát může tento enzym chybovat při syntéze 200 ng amplikonu o délce 1 190 bp? Co můžete říct o počtu chybných amplikonů v takovém výsledném vzorku DNA? Elektroforéza produktů PCR v agarózovém gelu (cvičení č. 2a) Úvodní slovo Elektroforéza v agarózovém gelu je standardní metoda pro dělení, identifikaci a purifikaci fragmentů DNA. Touto relativně jednoduchou metodou je možné rozdělit i komplexní směsi fragmentů DNA, které nelze rozdělit jinými způsoby, například centrifugací v hustotním gradientu. Kromě toho je při elektroforéze možné přímo sledovat polohu jednotlivých fragmentů a tím stanovit jejich velikost. Díky fluorescenci po „obarvení“ ethidiumbromidem odhadnout i koncentraci DNA. Princip elektroforézy spočívá v protlačování fragmentů DNA (nebo v principu jakýchkoli jiných makromolekul) rozpuštěných v tekutém prostředí ve stejnosměrném elektrickém poli molekulovým sítem, který tvoří gel agarózy. Chemická struktura agarózy, to jsou střídající se zbytky D-galaktózy a 3,6-anhydro-L-laktózy, vzájemně spojené střídavě glykosidickými vazbami β-1-4 a a-1-3. Elektroforetickou pohyblivost ovlivňuje řada faktorů. Základní silou, která určuje pohyb DNA je skutečnost, že součástí struktury DNA jsou zbytky kyseliny fosforečné, které dávají molekule DNA celkový záporný náboj. Proto DNA putuje ve stejno-směrném elektrickém poli od záporného ke kladnému pólu. Rychlost pohybu DNA v elektrickém poli však není dána velikostí náboje, ale především jejími rozměry. Lineární fragmenty DNA se pohybují rychlostí, která je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Dalším důležitým faktorem je koncentrace agarózového gelu. Čím je vyšší koncentrace agarózy, tím hustší je síť, kterou musí fragmenty DNA procházet. Existují různé komerčně dostupné druhy agaróz, ale obecně platí, že na běžném agarózovém gelu (používají se koncentrace 0,6 % až 3,0 %) lze úspěšně rozdělit fragmenty o velikostech od 100 bp do 20 000 bp (20 kbp). Větší fragmenty vyžadují jiné uspořádání, tzv. pulsní gelovou elektroforézu. Rovněž konformace DNA má vliv na její pohyb v elektrickém poli. Jinou rychlostí se pohybují kompaktní struktury CCC plasmidové DNA, jinou její OC formy a jinou lineární fragmenty. Kromě toho je elektroforéza ovlivňována intenzitou elektrického pole, složením elektroforetického média (pufru) a teplotou. V tomto cvičení provedete elektroforézu v 1 % agarózovém gelu, v tris-borátovém pufru, při laboratorní teplotě, při napětí 10 V/cm gelu (optimální je 5 V/cm). DNA je v gelu detekována po „obarvení“ ethidiumbromidem. Ethidiumbromid, který má planární strukturu, se vmezeřuje mezi báze v nukleové kyselině. Po ozáření krátkovlnným ultrafialovým zářením fluoreskuje červeným světlem o vlnové délce 590 nm, které je možno zachytit fotografickým zařízením. Ethidiumbromid vmezeřený v DNA září asi 80x intenzivněji než ve volném stavu. Cíl cvičení Detekovat amplifikační produkty z předchozích cvičení. Seznam přístrojů * váhy s váživostí +/- 0,1 g * aparatura pro elektroforézu * mikrovlnná trouba * sada pipet o objemech 10, 50 a 200 ml Příprava gelu 1) Připravte 1 litr 0,5x TBE pufru ze základního roztoku 5x TBE. 2) Změřte velikost gelu, jehož výška musí být 6 mm. 3) Spočítejte objem gelu a navážku agarózy na 2% gel. 4) Navážku agarózy vsypte do Erlenmeyerovy baňky o objemu alespoň 2x větším, než je uvažovaný objem gelu. 5) Odměřte objem 0,5x TBE pufru a nalijte do Erlenmeyerovy baňky s agarózou. 6) Vynulujte váhy s Erlenmeyerovou baňkou. 7) Dokonale rozvařte agarózu v mikrovlnné troubě, tzn. za průběžného míchání, přiveďte 3 až 4x k varu. Pozor na utajený var! 8) Znovu zvažte Erlenmeyerovu baňku s rozvařenou agarózou a úbytek hmotnosti doplňte destilovanou vodou. 9) Zchlaďte rozvařenou agarózu na teplotu 50 až 60 °C (odhadem). 10) Přidejte roztok ethidium bromidu (0,15 mg/ml) v množství stanoveném podle objemu gelu. Platí, že množství přidaného objemu roztoku ethidiumbromidu v mikrolitrech musí být stejné jako objem gelu v mililitrech. 11) V průběhu zchlazování agarózy upevněte matrici pro tvorbu komůrek (hřebínek) do nalévací aparatury. Dolní okraj hřebínku se nesmí dotýkat dna - optimální je výška 1mm nad dnem. Nalévací aparatura musí být umístěna na vodorovné podložce. 12) Ochlazenou agarózu nalijte po opatrném, ale důkladném zamíchání do nalévací aparatury, čistou špičkou odstraňte případné bubliny. 13) Nechte gel zatuhnout (asi 30 min). 14) V průběhu tuhnutí nalijte elektroforetický pufr do elektroforetické vany. 15) Po zatuhnutí gelu vložte nalévací aparaturu včetně hřebínku do elektroforetické vany. 16) Tahem kolmo vzhůru vyjměte hřebínek. 17) Zkontrolujte neporušenost komůrek pro nanášení vzorku. 18) Zkontrolujte výšku hladiny pufru nad gelem – musí být alespoň 1mm nad gelem. Nanesení vzorků, elektroforéza 1) Upravte polohu černé fólie pod nanášecí komůrky. 2) Do vzorku po provedené PCR napipetujte koncentrovaný nanášecí pufr (6 x GLB) v poměru 5 : 1 (vzorek : 6 x GLB). 3) Pipetou naneste 10 ml směsi do komůrek pod hladinu elektroforetického pufru. 4) Připojte elektroforetické kabely k vaně, zasuňte bezpečnostní kryt a připojte kabely ke zdroji - černý kabel k zápornému pólu, červený kabel ke kladnému pólu. Pozor na správnou orientaci vany. DNA putuje od minus k plus pólu! 5) Proveďte elektroforézu při 10 V/cm gelu. 6) Po 5 minutách zkontrolujte průběh elektroforézy, zejména správný směr pohybu detekční barvičky (bromfenolová modř) obsažené v 6 x GLB pufru. 7) Poté, co detekční barvička dosáhne asi 2/3 gelu (nebo uběhne předepsaná doba po kterou se má elektroforéza provádět, což je v našem případě asi 30 min), ukončete elektroforézu. 8) Odpojte elektrické kabely od zdroje. 9) Nasaďte si rukavice. 10) Odsuňte bezpečnostní kryt z elektroforetické vany. 11) Přeneste gel na UV-transluminátor, proveďte vizuální kontrolu gelu, případně vyfotografujte na dokumentačním zařízení. Další informace k této problematice najdete v následující literatuře Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press Složení roztoků 5 x Tris-borátový pufr (5xTBE pufr) (0,089M tris-borát/0,089M kyselina boritá/0,002M EDTA) 1) Navažte a postupně rozpusťte v 900 ml destilované vody 54 g trishydroxymethyl-aminomethanu a 27,5 g kyseliny borité. 2) Přidejte 20 ml 0,5M EDTA (pH 8,0). 3) Doplňte objem na 1 000 ml v analytické odměrné baňce. 4) Přelijte roztok do 1 000 ml láhve se šroubovacím uzávěrem. 5) Skladujte při 4 až 8 °C, při tomto způsobu skladování možno používat 6 měsíců. Zásobní roztok ethidiumbromidu (10 mg/ml) Ethidiumbromid je červená krystalická látka. Je to mutagen a karcinogen, proto je nutné při jakékoli manipulaci s touto látkou nebo roztoky, které ethidiumbromid obsahují, pracovat v rukavicích a dodržovat zásady manipulace s mutageny a karcinogeny ! 1) Na analytických vahách navažte 100 mg krystalického ethidiumbromidu do umělohmotné zkumavky s uzávěrem. 2) Přidejte 10 ml destilované vody. 3) Po rozpuštění ethidiumbromidu skladujte roztok při laboratorní teplotě ve tmě, možno skladovat po dobu 5 let. Nanášecí elektroforetický pufr s barvičkou (6 x GLB) Pufr se připravuje v šestinásobném zahuštění, obsahuje detekční barvičku bromfenolová modř. 1) Na analytických vahách navažte 0,5 g bromfenolové modři 2) Rozpusťte v 50 ml 1 x TBE pufru. 3) Přidejte 50 ml glycerolu. 4) Doplňte objem do 200 ml pomocí 1 x TBE pufru v analytické odměrné baňce. 5) Sterilizujte v přehřáté páře při 112 °C/30min. 6) Část roztoku po 1 ml sterilně rozpipetujte do sterilních 1,5 ml mikrozkumavek. 7) Rozpipetované dávky a zbytek uskladněte při 4 až 8 °C, lze skladovat po dobu 10 let. Kontrolní otázky a příklady 1) Závislost velikosti DNA na elektroforetické pohyblivosti není lineární. V určitém zjednodušení může být vyjádřena logaritmickou funkcí. Stanovte délku amplifikačního produktu z obrázku výsledné elektroforézy. Mleko020702 Standard A B C D E START Velikost standardů Elektroforetická pohyblivost A = 500 bp 29,0 mm B = 400 bp 32,5 mm C = 300 bp 35,5 mm D = 200 bp 38,0 mm E = 100 bp 45,0 mm Návod řešení: Vyneste hodnoty přirozeného logaritmu velikosti standardů a elektroforetické pohyblivosti do grafu a z něho pak odečtěte velikost amplikonu. N = ln X kde N = elektroforetická pohyblivost v cm X = velikost DNA fragmentu v bp 2) Jaká je výsledná koncentrace ethidiumbromidu ve vámi připraveném agarózovém gelu? 3) Kolik ml zásobního roztoku ethidiumbromidu (10 mg/ml) použijete pro přípravu 100 ml roztoku o koncentraci 0,15 mg/ml? Purifikace produktů PCR (cvičení č. 2b) Úvodní slovo Během PCR reakce vznikají v malém množství i nespecifické amplikony. Pro některé aplikace (in vitro translace, klonování) je nutné získat potřebné úseky DNA ve velmi čisté podobě, bez příměsí nespecifických amplikonů a v roztoku, který by neinhiboval následné reakce. Po rozdělení produktů takové PCR reakce v agarózovém gelu je možné požadovaný fragment DNA (amplikon) z gelu vyříznout a izolovat ho. PCR produkty se používají také k sekvenování. I v tomto případě je vhodné amplikony purifikovat a zbavit je přebytečných solí, zbytků polymerázy, nespotřebovaných nukleotidů a primerů. Pokud při PCR nevznikají nespecifické produkty, je purifikace jednodušší, není zapotřebí elektroforézy a vyřezávání amplikonů z gelu. K výše uvedeným purifikačním procesům (vyčištění PCR směsi nebo izolace amplikonů vyřezaných z gelu) byly vyvinuty komerčně dostupné soupravy, které to umožňují. Základem je pufr, který rozpustí agarózu a uvolní tak DNA do roztoku. Z roztoku je pak DNA vyvázána na silikagel a zachycena na filtr „chromatografické“ kolonky. Následuje promytí kolonky, které je spojeno s odstraněním všech kontaminujících látek a eluce čisté DNA do požadovaného roztoku. Takto izolovaný PCR fragment je velmi čistý, bez přítomnosti nespecifických produktů a solí. Cíl cvičení Izolovat PCR amplikon z roztoku nebo z gelu pro účely sekvenování Seznam přístrojů * sada pipet o objemech 10, 100 a 1000 ml * suchý termoblok * centrifuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 14 000 rpm (20 000 g) Vlastní pracovní postup K purifikaci použijeme některou z komerčně dostupných souprav a budeme postupovat přesně podle návodu výrobce. Návod je veden v anglickém jazyce a studenti tak budou mít možnost zdokonalit se v porozumění psaného odborného textu. Získané produkty prověří studenti elektroforézou v agarózovém gelu v následujícím cvičení. Další informace k této problematice najdete v následující literatuře Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press Manuály společnosti QIAGEN (Germany) Kontrolní otázky a příklady 1) Spočítejte, jaké přetížení působí na dně zkumavky na materiál, jestliže jste na vaší centrifuze použili maximální otáčky, tj. 14 000 rpm. Poloměr rotoru je 7 cm. Elektroforéza purifikovaných produktů PCR, kvantifikace, příprava pro sekvenování (cvičení č. 3a) Úvodní slovo Poznámky k agarózové elektroforéze jsou uvedeny ve cvičení č. 2a Cíl cvičení Provést kontrolu purifikace produktů PCR, odhadnout koncentraci produktu a připravit vzorek k odeslání komerční firmě pro účely sekvenování Seznam přístrojů * pomůcky k elektroforéze podle cvičení č. 2a * UV spektrofotometr podle cvičení 4a * pikofuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 6 000 rpm Vlastní pracovní postup Elektroforéza a odhad koncentrace 1) Provedeme elektroforézu malého množství PCR produktu ze cvičení 2b 2) Součástí nanášených vzorků bude i vhodný kvantifikační standard, který umožní odhad koncentrace DNA Kvantifikační standard je sériově naředěná směs různě dlouhých fragmentů dsDNA o známé koncentraci. Odhad koncentrace se provádí porovnáním intenzity fluorescence fragmentu kvantifikačního standardu s intenzitou fluorescence purifikovaného PCR produktu. Hodnota je ovšem velmi orientační a nelze jí nahradit spektrofotometrii nebo fluorometrii. Nicméně v některých případech může být pro další manipulace s DNA dostačující. Příprava vzorku pro sekvenování 1) Purifikovaný amplikon nezaměnitelně označíme, uvedeme informaci o stanovené koncentraci DNA a vložíme do transportního sáčku – poštovní obálky 2) Na stránkách společnosti Macrogen (http://dna.macrogen.com/eng/) se seznámíme s nabídkou firmy týkající se sekvenování, způsoby sekvenování, objednávání a odesílání vzorků na sekvenování. O zjištěných skutečnostech sepíšeme krátkou zprávu. Rovněž zjistíme, na jakou adresu odešleme naše vzorky a co dalšího ještě musíme vložit do obálky. Další informace k této problematice najdete v následující literatuře Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press Internetové stránky společností Macrogen (http://dna.macrogen.com/eng/) a Generi-Biotech (http://www.generi-biotech.com) Analýza výsledku sekvenování (cvičení č. 3b) Úvodní slovo Toto cvičení je přímým pokračováním cvičení č. 1. Pro druhové zařazení může postačovat sekvence části genu pro 16S rRNA. Ověření a přesnější klasifikace lze dosáhnout porovnáním sekvencí více genů v databázi. Pro účely klasifikace vybraných zástupců čeledi Pasteurelllaceae jsme zvolili kromě genu pro 16S rRNA provozní geny rpoB a infB. Sekvenování se provádí z jednoho z primerů pro sekvenování nebo lze navrhnout vhodnou sekvenci uvnitř amplikonu. V našem případě je takovou sekvencí primer 810R, který leží uvnitř amplikonu získaného amplifikací genu pro 16S rRNA. Nepoužívá se primer amplifikační (1194R). Přehled amplifikačních a sekvenačních primerů je uveden v této tabulce: Gen Primer Účel Sekvence Citace 16S rRNA 5F A, S 5´- TTG GAG AGT TTG ATC CTG GCT C - 3´ Simmon et al. 2006 1194R A 5´- ACG TCA TCC CCA CCT TCC TC - 3´ Simmon et al. 2006 810R S 5´- GGC GTG GAC TTC CAG GGT ATC T - 3´ Simmon et al. 2006 rpoB Pasrpob-L A, S 5´- GCA GTG AAA GAR TTC TTT GGT TC - 3´ Korczak et al. 2004 Rpob-R A, S 5´- GTT GCA TGT TNG NAC CCA T - 3´ Korczak et al. 2004 infB infB-F1241 A, S 5´- CCT GAC TAY ATT CGT AAA GC - 3´ Christensen et al. 2004 infB-R1727 A, S 5´- GTA GCA ACC GGA CCA CGA CCT TTA T - 3´ Christensen et al. 2004 A = amplifikace, S = sekvenování Délka amplikonu z genu pro 16S rRNA je přibližně 1 190 bp Délka amplikonu z genu pro rpoB je přibližně 558 bp Délka amplikonu z genu pro infB je přibližně 486 bp Pro porovnávání námi získaných sekvencí s celosvětovou databází použijeme algoritmus BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), který je v současnosti asi nejrozšířenějším heuristickým algoritmem, který umožňuje prohledávat rozsáhlé databáze. Pro účely srovnávání nukleotidových DNA sekvencí bakterií je nejvhodnější využít databáze BLASTN. Po seznámení se s vzhledem příslušných www stránek zvolíme nastavení default, je ale možné zvolit vlastní parametry prohledávání. Cíl cvičení Analyzovat výsledky sekvenování Seznam přístrojů Toto je pouze teoretické cvičení, potřebovat budete pouze záznamy o sekvenování a výsledné protokoly Analýzy provedete s využitím volně dostupných internetových nástrojů Jediným přístrojem pro toto cvičení je počítač napojený na internet Vlastní pracovní postup 1) Stáhněte si v elektronické formě “Záznamy o sekvenování”, vyberte si 3 záznamy k libovolnému vzorku označenému čísly 22 až 44 2) Vyžádejte si od vyučujícího “Výsledné protokoly ze sekvenování” 3) Zkontrolujte a opravte sekvence 1) Prohlédněte si záznamy sekvencí jednotlivých genů a vyhledejte ty nukleotidy, které nejsou dobře čitelné. 2) Opravte v záznamu software neurčené nukleotidy, případně vyřaďte ty, které jsou nečitelné. 3) Zkontrolujte, jestli na záznamu dokážete najít jeden z primerů, které byly použity k amplifikaci. Je to ten druhý primer než ten, který byl použit pro sekvenování. 4) Zkontrolujte, jak dlouhý je získaný sekvenační záznam oproti délce amplikonu. 5) Vyznačte v sekvenci celistvý úsek, který už po opravě neobsahuje žádné nečitelné nebo špatně čitelné nukleotidy. 4) Prohledejte databázi a zařaďte výsledky 6) Vyhledejte prohledávač označovaný jako BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). 7) Vložte sekvenci celistvého úseku do prohledávače. 8) Vyčkejte, až program provede porovnání vaší sekvence s databází. 9) Odečtěte výsledek a zaznamenejte nejpravděpodobnější zařazení druhu do vyhodnocovací tabulky. 10) Postupně proveďte vyhledání a zařazení podle všech tří sekvencí, genů pro 16S rRNA, rpoB a infB. 11) Určete, o jaký druh bakterie se nejspíš jednalo. 12) Porovnejte svůj výsledek s tabulkou, ve které jsou uvedeny výsledky zařazující bakterie podle biochemických charakteristik Vzor vyhodnocovací tabulky Vzorek č. Zařazení podle Závěr 16S rRNA rpoB infB 22 24 30 33 35 36X 37X 38 40 41 42 43 44 45 Gallibacterium anatis (Actinobacillus sp.) Gallibacterium anatis Gallibacterium anatis Gallibacterium anatis Další informace k této problematice najdete v následující literatuře Cvrčková, F. 2006: Úvod do praktické bioinformatiky. Academia, Praha. Šmarda et al. 2005: Metody molekulární biologie, Masarykova Universita, Brno Simmon K.E., Croft A.C., Petti C.A. 2006: Application of SmartGene IDNS Software to Partial 16S rRNA Gene Sequences for a Diverse Group of Bacteria in a Clinical Laboratory. Journal of Clinical Microbiology 44(12), 4400-4406. Korczak B., Christensen H., Emler S., Frey J., Kuhnert P. (2004): Phylogeny of the family Pasteurellaceae based on rpoB sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54, 1393-1399. Christensen H., Kuhnert P., Olsen J.E., Bisgaard M. (2004): Comparative phylogenies of the housekeeping genes atpD, infB and rpoB and the 16S rRNA gene within the Pasteurellaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54, 1601-1609. Izolace bakteriální DNA z Escherichia coli (cvičení č. 4a) Úvodní slovo Obecný postup izolace bakteriální DNA sestává ze čtyř základních kroků: Ø Růstu kultury a sedimentace buněk Ø Rozbití buněk a jejich obsahu Ø Zpracování buněčného extraktu – odstranění všeho kromě DNA Ø Zahuštění výsledného roztoku Nízkomolekulární relativně znečištěnou DNA jsme izolovali jako hrubý lyzát buněk v úloze č. 1. Analýza bakteriálních genů však vyžaduje často izolaci i vysokomolekulární genomové DNA, která musí být kromě toho získána ve vysoké čistotě. V současné době je na trhu k dispozici celá řada výtečných komerčních souprav, které jsou pro mikrobiologa metodou první volby. Teprve když komerční souprava nedokáže poskytnout dostatečně kvalitní izolát pro analýzu, je třeba sáhnout do teorie a zajistit s pomocí dostupné literatury nebo konzultace s molekulárním biologem jinou metodu. Principem soupravy, kterou budeme v této úloze používat, je lyze buněk aniontovým detergentem v přítomnosti DNA stabilizátoru. Stabilizátor inhibuje aktivitu vnitrobuněčných DNáz a také DNáz, které by se mohly do izolovaného materiálu dostat z vnějšího prostředí. RNA je ze vzorku odstraněna působením RNázy. Další kontaminanty, např. proteiny, jsou odstraněny precipitací v roztoku s vysokou koncentrací solí. Genomová DNA je získána precipitací v alkoholu a precipitát je rozpuštěn v roztoku 1mM EDTA/10 mM Tris.Cl pH= 7,5. Izolovaná DNA by měla mít poměr absorbance A260/A280 mezi 1,7-1,9. Cíl cvičení Izolovat genomovou DNA bakterie Escherichia coli komerční soupravou Seznam přístrojů * vodní lázeň nebo suchý blok * třepačka Vortex * centrifuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 14 000 rpm (20 000 g) * pikofúga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 6 000 rpm * sada pipet o objemech 20, 200 a 500 ml * stopky Vlastní pracovní postup K izolaci použijeme některou z komerčně dostupných souprav a budeme postupovat přesně podle návodu výrobce. Návod je veden v anglickém jazyce a studenti tak budou mít možnost zdokonalit se v porozumění psaného odborného textu. Prvním krokem izolace bude stanovení počtu bakterií ve vzorku. Pro Escherichia coli platí, že při vlnové délce 600 nm hodnota optické hustoty OD[600] = 1 odpovídá asi 8 x 10^8 buněk/ml. Předpokládejme dále, že je závislost počtu buněk na OD[600] lineární. Koncentraci a čistotu izolované DNA proměříme spektrofotometricky ve cvičení č. 4b. Další informace k této problematice najdete v následující literatuře Marmur, J. 1961: A procedure for isolation of DNA from microorganisms. Journal of Molecular Biology 3, 208-218. Jedná se o první článek, ve kterém jsou popsány základní principy izolace DNA. Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press Manuál společnosti QIAGEN (Germany) Kontrolní otázky a příklady 1) Jakou hmotnost má chromozóm Escherichia coli, u něhož bylo zjištěno celkem 4 x 10^6 párů nukleotidů? Průměrná molekulová hmotnost jednoho bp je 650. 2) Jestliže máte koncentraci Escherichia coli v suspenzi 8 x 10^8 buněk/ml, jaké maximální množství DNA můžete teoreticky izolovat ze 2 ml této suspenze? 3) Kolik molekul chromozómu Escherichia coli by bylo obsaženo v 1 mg DNA? 4) Jak dlouhý je v lineárním stavu chromozóm Escherichia coli? Připomeňme si, že vzdálenost mezi dvěma páry bazí je 0,34 nm. 5) Doplňte následující tabulku týkající se genomové DNA různých organismů Organismus Velikost DNA (bp) Molekulová hmotnost Hmotnost 1 molekuly Počet molekul v 1 g Escherichia coli 4,0 x 10^6 Bakteriofág l 48 514 Saccharomyces cerevisiae 1,6 x 10^7 Člověk 3,2 x 10^9 Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky (cvičení č. 4b) Úvodní slovo Rychlou a jednoduchou metodu stanovení koncentrace nukleových kyselin představuje proměření spektra v rozsahu 230 až 320 nm. Báze v nukleových kyselinách mají absorpční maximum při 260 nm. Obecně platí, že pokud je hodnota absorbance A[260] v 1 cm kyvetě rovná 1,0, je koncentrace dvouřetězcové DNA v kyvetě 50 μg/ml. Pro jednořetězcovou DNA a RNA platí hodnota 38 μg/ml. Čistota DNA je nejčastěji odhadována na základě poměru absorbancí při různých vlnových délkách. Pro čistou DNA platí poměr: A[260]/A[280] = 1,80 Tento parametr je nejdůležitější a v běžné praxi nejčastěji používaný. Pokud je hodnota jiná než 1,80, pak je vzorek DNA kontaminován proteiny nebo RNA. Druhý poměr, který je vhodné sledovat je A[260]/A[230] > 2,00 Pokud je tento poměr pod 2,00, pak není izolát čistý a obsahuje zbytky roztoků z izolační soupravy. Poměr A[260]/A[230 ]nesmí přesáhnout hodnotu 3,00. Cíl cvičení Stanovit koncentraci a posoudit čistotu izolované bakteriální DNA Seznam přístrojů * UV-VIS spektrofotometr * sada pipet o objemech 20, 200 a 500 ml Vlastní pracovní postup 1) Zapněte spektrofotometr. 2) Do kyvety napipetujte 100 ml roztoku AE (eluční pufr ze cvičení č. 1) a proveďte nastavení nulového pozadí (tzv. blank). 3) DNA izolovanou ve cvičení č. 1 nařeďte 10x tak, že k 10 ml DNA napipetujte 90 ml roztoku AE. 4) Naředěnou DNA napipetujte do kyvety a změřte hodnoty absorbance při 230, 260 a 280 nm. 5) Je-li naměřená hodnota A[260] mimo hodnoty 0,1 až 0,3, opakujte ředění vzorku DNA. Jen v rozsahu hodnot 0,1 až 0,3 je závislost koncentrace na absorbanci lineární a naměřené hodnoty jsou přesné. 6) Vyhodnoťte dosažené výsledky. Další informace k této problematice najdete v následující literatuře Manchester, K. L. 1995: Calue of A[260/280] ratios for measurements of purity of nucleic acids. BioTechniques 19, 208-219. Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press Kontrolní otázky a příklady 1) Kolik μl vzorku DNA nanesete do reakce, potřebujete-li 2 ng a máte k dispozici roztok DNA o koncentraci 2 μg/ml? 2) Kolik molekul DNA plasmidu pCR2.1 o velikosti 3 900 bp je obsaženo ve 100 μl vzorku o koncentraci DNA 50 μg/ml? 3) Kolikrát musíte naředit roztok DNA o koncentraci 100 μg/ml, aby byla jeho absorbance při 260 nm rovna hodnotě 0,2? 4) Kolik ředícího roztoku přidáte do 30 μl vzorku DNA o koncentraci 60 μg/ml tak, aby koncentrace DNA po zředění klesla na 15 ng/μl? 5) Kolik molekul plasmidové DNA o velikosti 50 000 bp obsahuje 100 μl roztoku, u něhož byla hodnota absorbance při 260 nm po 10 násobném zředění rovna 0,15? Izolace genomové DNA z biologického materiálu (cvičení č. 5a) Úvodní slovo Chlamydia trachomatis jsou gramnegativní bakterie, které parazitují uvnitř vnímavých buněk sliznic. Jedná se o jednoho ze tří původců chlamydiózy. Chlamydia trachomatis se přenáší pohlavním stykem a může u mužů i u žen způsobit vážné zdravotní komplikace. Předpokládá se, že ročně je chlamydiemi infikováno asi 90 milionů lidí. Laboratorně se chlamydie vyšetřují již od počátku 80. let minulého století. Zpočátku byly chlamydie stanovovány cytologicky a tento test byl doplněn kultivací na buněčných kulturách. V 80. a 90. letech pak byly vyvinuty komerční soupravy na detekci antigenů a později i nukleových kyselin. Klinické vzorky, které se používají k detekci chlamydií, jsou stěry z různých tělesných částí nebo tělní tekutiny, jak je uvedeno v tabulce. V tabulce jsou taky uvedeny doporučené diagnostické metody podle typu vzorku, všimněte si, že metoda stanovení z DNA je univerzální pro všechny typy vzorků. Diagnostická metoda Vzorek Mikroskopie Kultivace Imunoanalýza Hybridizace PCR Spojivkový + + + + + Nasofaryngeální - + - - + Cervikální - + + + + Uterální - + + + + Rektální - - - - + Poševní - - - - + Vaginální - - - - + Introitální - - - - + Moč - - - - + Lymfatický - + - - + Semeno - - - - + V praktiku nepoužijeme přímo klinický materiál, ale vzorky imitující moč obohacené umělou DNA, obsahující část sekvence genomu Chlamydia trachomatis. Přesto budeme ke vzorkům přistupovat jako k potenciálně nebezpečnému klinickému materiálu a budeme dodržovat příslušné bezpečnostní předpisy a pravidla bezpečnosti práce. Izolovanou DNA použijeme pro metodu polymerázové řetězové reakce ve standardním systému a v modifikaci real-time PCR. Cíl cvičení Izolovat genomovou DNA bakterie Chlamydia trachomatis komerční soupravou z klinického materiálu. Seznam přístrojů * vodní lázeň nebo suchý blok * třepačka Vortex * centrifuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 14 000 rpm (20 000 g) * pikofuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 6 000 rpm * sada pipet o objemech 20, 200 a 500 ml * stopky Vlastní pracovní postup K izolaci použijeme některou z komerčně dostupných souprav a budeme postupovat přesně podle návodu výrobce. Návod je veden v anglickém jazyce a studenti tak budou mít možnost zdokonalit se v porozumění psaného odborného textu. Koncentraci a čistotu izolované DNA proměříme spektrofotometricky ve cvičení č. 4b. Pak provedeme vlastní detekci metodou PCR ve cvičeních 5a a 5b. Další informace k této problematice najdete v následující literatuře Marmur, J. 1961: A procedure for isolation of DNA from microorganisms. Journal of Molecular Biology 3, 208-218. Jedná se o první článek, ve kterém jsou popsány základní principy izolace DNA. Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press Manuál společnosti QIAGEN (Germany) Chernesky, M.A. 2005: The laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Can J Infect Dis Med Microbiol, 16(1):39-44. http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Chlamydia Kontrolní otázky a příklady 1) Jakou hmotnost má chromozóm Chlamydia trachomatis, u něhož bylo zjištěno celkem 1 042 519 párů nukleotidů? Průměrná molekulová hmotnost jednoho bp je 650. 2) Kolik molekul chromozómu Chlamydia trachomatis by bylo obsaženo v 1 mg DNA? 3) Jak dlouhý je v lineárním stavu chromozóm Chlamydia trachomatis? Připomeňme si, že vzdálenost mezi dvěma páry bazí je 0,34 nm. 4) Kolik párů nukleotidů bylo nalezeno u Ch. pneumoniae? 5) Kolik strukturních genů bylo popsáno u Chlamydia trachomatis, porovnejte s Ch. pneumoniae? 6) V kolika genech se oba druhy liší/shodují? Detekce Chlamydia trachomatis metodou PCR (end-point) (cvičení č. 5b) Úvodní slovo Souprava, se kterou budete ve cvičení pracovat je určena k detekci chromozomální DNA bakterie Chlamydia trachomatis na principu amplifikace sekvence vícekopiového genu pro 16S RNA metodou polymerázové řetězové reakce. Detekční souprava využívá technologii “hot start”, která minimalizuje nespecifické reakce a zajišťuje maximální citlivost reakce. Součástí MasterMixu je jako stavební komponenta DNA nukleotid dUTP a enzym uracil-DNA-glykosyláza (UDG), který umožňuje odstranění případných kontaminací produkty amplifikace. Souprava obsahuje tzv. “interní kontrolu“, která je komponentou „MasterMixu“; interní kontrola je určena ke kontrole inhibice PCR. Cíl cvičení Provést detekci Chlamydia trachomatis ve vzorcích ze cvičení 5a polymerázovou řetězovou reakci metodou end-point PCR Seznam přístrojů · termocykler · PCR box · sada pipet o objemech 2, 20, 200 a 500 ml · stojánky na zkumavky a PCR zkumavky Vlastní pracovní postup Namíchání reakce Všechny kroky je možno provádět při laboratorní teplotě 1) Nechejte rozpustit MasterMix po dobu asi 5 minut a poté promíchejte několikerým, ale opatrným převracením zkumavky 2) Rozpipetujte MasterMix po 36 µl do PCR zkumavek 3) Přidejte po 4 µl izolované DNA 4) Do samostatné zkumavky přidejte 4 µl pozitivní kontroly 5) Výsledný objem reakčních směsí je 40 µl 6) Uzavřete PCR zkumavky, krátce zcentrifugujte veškerou tekutinu ke dnu, vložte do termocyleru a proveďte amplifikaci Amplifikace Proces Teplota Čas Opracování UDG 37°C 2 min. Aktivace reakce 95°C 15 min. PCR opakovat 45x Denaturace 95°C 20 s Annealing 58°C 20 s Polymerace 72°C 40 s Finalizace Konečná extenze 72°C 2 min. Zchlazení 12°C nekonečno Vyhodnocení Provedete elektroforézou ve 2% agarózovém gelu postupem podle cvičení č. 2a. Specifický amplikon pro Chlamydia trachomatis má velikost 300 bp, interní kontrola pak 600 bp. Specifický amplikon Interní kontrola Výsledek Pozitivní kontrola ANO ANO POZITIVNÍ ANO NE POZITIVNÍ Negativní kontrola NE ANO NEGATIVNÍ Vzorek ANO ANO POZITIVNÍ ANO NE POZITIVNÍ NE ANO NEGATIVNÍ NE NE NEHODNOTITELNÝ V protokolu řádně popište elektroforetický záznam a vypracujte tabulku, ve které uvedete výsledky pro jednotlivé vzorky Další informace k této problematice najdete v následující literatuře Persing (2011): Molecular Microbiology - second edition, ASM Press , Washington, D.C. Manuál dodavatele detekční soupravy Kontrolní otázky a příklady 1) Limit detekce DNA na transluminátoru je přibližně 5 ng. Kolik cyklů PCR musí proběhnout, aby bylo možno detekovat amplifikační produkt o délce 300 bp, jestliže na počátku reakce máte ve směsi pouze jedinou kopii genu pro 16S Chlamydia trachomatis? 2) Taq polymeráza připojuje nukleotidy rychlostí 150 nukleotidů/sekundu. Jak dlouho trvá tomuto enzymu, než nasyntetizuje fragmenty o délce 300 a 600 bp? 3) Jedna jednotka enzymu Taq polymerázy inkorporuje 10 nmol nukleotidů za 30 minut při teplotě 72 °C. Přepočtěte tuto hodnotu na počet inkorporovaných nukleotidů za minutu. 4) Jestliže frekvence začlenění chybného nukleotidu činí u Taq polymerázy 285 x 10^-6, kolikrát může tento enzym chybovat při syntéze 200 ng amplikonu o délce 600 bp? Co můžete říct o počtu chybných amplikonů v takovém výsledném vzorku DNA? Detekce Chlamydia trachomatis metodou real-time PCR (cvičení č. 6) Úvodní slovo Souprava, se kterou budete ve cvičení, zaciluje stejný gen a má stejné použití jako ta, která byla použita ve cvičení 5b, ale obsahuje kromě sady primerů i TaqMan sondy umožňující detekci produktů PCR v reálném čase. Souprava není určena ke kvantitativnímu stanovení, ale pouze k detekci přítomnosti genomu Chlamydia trachomatis. Přesto je možné na základě získaných hodnot Ct odhadnout množství genomů, které byly přítomny ve vzorku na počátku. Výhodou této metody je, že nevyžaduje žádnou post-PCR detekci, výsledek je hodnotitelný přímo ze záznamu o průběhu reakce. Odpadá tak mimo jiné možnost kontaminace vzorků amplikony z předchozích reakcí, což je častým problémem u metod, kdy detekce amplikonů probíhá po ukončení PCR na elektroforéze. Cíl cvičení 1) Vyhodnotit amplifikaci ze cvičení 5b standardní gelovou elektroforézou 2) Provést detekci Chlamydia trachomatis ve vzorcích ze cvičení 5a polymerázovou řetězovou reakci metodou real-time PCR Seznam přístrojů · termocykler · PCR box · sada pipet o objemech 2, 20, 200 a 500 ml · stojánky na zkumavky a PCR zkumavky Vlastní pracovní postup Namíchání reakce Všechny kroky je možno provádět při laboratorní teplotě 1) Nechejte rozpustit MasterMix po dobu asi 5 minut a poté promíchejte několikerým, ale opatrným převracením zkumavky 2) Rozpipetujte MasterMix po 30 µl do PCR zkumavek 3) Přidejte po 10 µl izolované DNA 4) Do samostatné zkumavky přidejte 10 µl PK 5) Výsledný objem reakčních směsí je 40 µl 6) Uzavřete PCR zkumavky, krátce zcentrifugujte veškerou tekutinu ke dnu, vložte do termocyleru a proveďte amplifikaci Amplifikace Program pro amplifikaci: Proces Teplota Čas Opracování UDG 37°C 2 min. Aktivace reakce 95°C 15 min. PCR opakovat 45x Denaturace 95°C 5 s Annealing 60°C 40 s Polymerace 72°C 20 s Vyhodnocení Kanál FAM/Sybr Kanál JOE/HEX Výsledek Pozitivní kontrola ANO ANO POZITIVNÍ ANO NE POZITIVNÍ Negativní kontrola NE ANO NEGATIVNÍ Vzorek ANO ANO POZITIVNÍ ANO NE POZITIVNÍ NE ANO NEGATIVNÍ NE NE NEHODNOTITELNÝ K protokolu doložte záznam z real-time PCR a vypracujte tabulku s výsledky pro jednotlivé izoláty Další informace k této problematice najdete v následující literatuře Persing (2011): Molecular Microbiology - second edition, ASM Press , Washington, D.C. Manuál dodavatele detekční soupravy Kontrolní otázky a příklady 1) Popište základní princip kvalitativního a kvantitativního stanovení genotypu pomocí real-time PCR Izolace DNA z kvasinek, gelová elektroforéza, PCR ITS regionu pro odlišení komplexu Saccharomyces sensu stricto (cvičení č. 7) Úvodní slovo Identifikace kvasinek, a to nejen rodu Saccharomyces, pomocí běžných mikrobiologických a biochemických testů je často nepřesná a nedostatečná, neboť testy mohou být ovlivněny kultivačními podmínkami a jednotlivé rodu či druhy poskytují shodné či variabilní výsledky. Proto se, jako i u bakterií, stále více používá analýza sekvencí některých evolučně konzervativních genů či oblastí na DNA. U bakterií je to především gen pro 16S rRNA, u kvasinek potom oblast ITS (Internal Transcribed Spacer), která se nachází mezi podjednotkami genů pro rDNA, 18S, 5,8S a 26S. Po gelové elektroforéze rozlišíme rody, případně druhy na základě odlišné délky, případně jiného restrikčního profilu při použití RFLP. V některých případech je analýzy dále nutno doplnit, např. NTS region (Non-Transcribed Spacer), RFLP mtDNA, amplifikace genů charakteristických pouze pro daný rod/druh, atd. Při izolaci DNA u kvasinek je nejprve nutné odstranit buněčnou stěnu, která má odlišné vlastnosti než buněčná stěna bakterií. Metodicky je nejvýhodnější připravit protoplasty nebo sferoplasty. Po jejich narušení - rozbití se již při izolaci DNA postupuje klasickou fenol-chloroformovou metodou. Pro odstranění RNA použijeme enzym RNázu, pro přečištění DNA izopropanol. O čistotě, množství DNA a odstranění RNA se přesvědčíme gelovou elektroforézou (viz. cvičení č. 2a). Pro amplifikaci ITS regionu použijeme naši izolovanou DNA a komerční směs PPP Master-mix (Top-Bio, ČR), která obsahuje komponenty potřebné pro PCR. Produkty PCR ověříme gelovou elektroforézou – 1% gel (viz. cvičení 1 a 2a) a následně přečistíme a můžeme použít pro restrikci enzymem HaeIII či pro sekvenaci. Cíl cvičení Cílem cvičení je osvojit si techniku fenol-chloroformové extrakce DNA, získat čistou DNA v dostatečném množství, která bude následně použita pro PCR. Po přečištění je možné se získanými PCR produkty dále pracovat - sekvenace, RFLP. Seznam přístrojů * termostat * třepačka * sada pipet o objemech 20, 200 a 1000 µl * termocykler * centrifuga * váhy * aparát pro elektroforézu Vlastní pracovní postup 1. Izolace DNA Příprava suspenze kvasinek pro izolaci DNA Do 5 ml YPD bujónu (2 % kvasničný extrakt, 1 % pepton, 2 % dextróza; pH 8,0) ve zkumavkách se zaočkuje 1 kolonie kultury a kultivace probíhá při teplotě 28°C, 48-72 hod za intenzivního třepání. Lyze buněk 1) Centrifugace kultury kvasinek (množství buněk cca 1-2 x 10^8 buněk / ml) 4000 rpm, 4°C, 10 min, pelet následně resuspendujte v 10 ml 0,1 M EDTA (pH 7,5) a poté znovu zcentrifugujte 2) Sediment resuspendujte v 1 ml roztoku pro sféroplasty (0,9 M sorbitol; 0,1 M EDTA; 50 mM dithiothreitol; pH 7,5) 3) Přidejte 50 µl lytikázy (výsledná koncentrace 500 U / ml), suspenze je inkubována při teplotě 37°C přibližně 60 min (do vzniku viskózní a projasněné suspenze). Asi po 10 min. suspenzi protřepávejte 4) Přidejte 240 µl 0,5 M EDTA (pH 8) a 25 µl proteinázy K (výsledná koncentrace EDTA 0,1 M a proteinázy K 0,2 mg / ml), následuje inkubace 5 min při teplotě 37°C 5) Pro dokončení lyze buněk se k suspenzi přidá 150 µl 10 % SDS; inkubace při teplotě 37°C/10 min Purifikace chromozomální DNA 1) Buněčný lyzát smíchejte se 750 µl nasyceného a neutralizovaného fenolu, promíchávejte 10 min 2) Přidejte 750 µl směsi chloroform/izoamylalkohol (24:1) a míchejte 5 min 3) Centrifugace 4000 rpm, 4°C, 10 min - oddělení vodné a organické fáze se zbytky buněk 4) Horní vodnou fázi, obsahující nukleové kyseliny, odpipetujte plastovou špičkou s ustřihlým okrajem do nové zkumavky. Přidejte 1,5 ml směsi chloroform/izoamylalkohol a směs míchejte po dobu 5 min 5) Po centrifugaci (4000 rpmm, 4°C, 10 min), opět zkrácenou špičkou, odeberte horní vodnou vrstvu (hrubý extrakt nukleových kyselin) do nové zkumavky 6) Jako kontrolní vzorek odeberte 20 µl a smíchejte s 5 µl vkládacího pufru 7) Přidejte 20 µl RNázy A do směsi nukleových kyselin a inkubujte 15 min při teplotě 37°C 8) Odeberte 20 µl vzorku, smíchejte s 5 µl vkládacího pufru (kontrola odstranění RNA) Přesrážení hrubého extraktu DNA 1) K hrubému extraktu DNA přidejte izopropanol (v poměru 1:0,7; např. 900 µl extraktu + 630 µl izopropanolu), směs inkubujte 10 min při teplotě ‑20°C 2) Centrifugace 12000 rpm, 4°C, 10 min; opatrně odpipetujte supernatant 3) DNA na dně zkumavky je vysušena při pokojové teplotě, poté přidejte 50 µl TE pufru. Takto se nechá přes noc rozpouštět v chladničce (4°C), kde je DNA i dále uchovávána 2. Gelová elektroforéza (kontrola DNA, odstranění RNA) 1) Připravte 1 % agarózový gel (viz. Cvičení 2a) 2) Na gel naneste 5 μl DNA markeru (Gene Ruler DNA Ladder Mix 100 – 10 000bp, Fermetas), 10 μl hrubého lyzátu před a po přidání RNázy a 2 µl čisté DNA 3) Gel se vzorky vložte do elektroforetické vany a zalijte TAE pufrem tak, aby byl ponořen zhruba 3 mm 4) Nastavte stálé napětí 90 V, separace bude probíhat cca 45 min 5) Gel se barví v roztoku ethidiumbromidu (0,05 μl/ml) po dobu nejméně 1 hodiny PRACUJTE V RUKAVICÍCH!!!! 6) Pozorujte gel na transluminátoru pod UV světlem o vlnové délce 302 nm a zdokumentujte 3. PCR (ITS region) 1) Použijte DNA izolovanou metodou fenol-chloroform. Pro ověření, že kmeny patří do skupiny Saccharomyces sensu stricto, použijte primery ITS1 a ITS4 (Valente et al. 1996 - pokud je velikost amplifikovaného produktu větší než 800 bp, patří kmen do skupiny sesu stricto) Primery ITS1 - TCC GTA GGT GAA CCT GCG G ITS4 - TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC PCR směs (celkový objem 50 μl): Master Mix Combi PPP 25 μl PCR voda 22 μl primer I 1 μl primer II 1 μl DNA matrice 1 μl PCR program: Krok Teplota Čas 1 95°C 3 min 2 95°C 45 sec 3 55°C 30 sec 4 72°C 45 sec 5 Go to 2 33x 6 72°C 7 min 7 4°C ∞ 4 . Gelová elektroforéza (ověření PCR produktu) 1) Připravte 1 % agarózový gel (viz. Cvičení 2a) 2) Na gel naneste 5 μl DNA markeru (Gene Ruler DNA Ladder Mix 100 – 10 000bp, Fermetas) a následně 5 μl každého PCR produktu 3) Gel se vzorky vložte do elektroforetické vany a zalijte TAE pufrem tak, aby byl ponořen zhruba 3 mm 4) Nastavte stálé napětí 90 V, separace bude probíhat cca 45 min 5) Gel se barví v roztoku ethidiumbromidu (0,05 μl/ml) po dobu nejméně 1 hodiny PRACUJTE V RUKAVICÍCH!!!! 6) Pozorujte gel na transluminátoru pod UV světlem o vlnové délce 302 nm a zdokumentujte 5a. Štěpení PCR produktu (RFLP) 1) Ke štěpení enzymem HaeIII použijte ITS region – buď produkt přečistěte (viz. Cvičení 2b) nebo použijte hrubý PCR produkt, štěpení probíhá min. 2 hod při 37°C 2) Výsledek ověřte gelovou elektroforézou (2% gel), kdy nanesete 8 µl vzorku + 2 µl vkládacího pufru Směs pro štěpení ITS regionu (celkový objem 20 μl): Voda 12,5 μl Pufr pro enzym 2,0 μl PCR produkt/DNA 4,5 μl Enzym HaeIII 1,0 μl 5b. Sekvenace PCR produktu 1) Pro sekvenaci se využije ITS region – produkt se přečistí (viz. cvičení 2b) a zašle na Středisko sekvenování DNA, MBÚ AV ČR (www.biomed.cas.cz/mbu/lab119/index.htm) 2) Výsledkem sekvenační reakce je soubor ve formátu .abi, se kterým můžeme dále pracovat (viz. Cvičení 3b) Další informace k této problematice najdete v následující literatuře: Giudici P., Pulvirenti A. (2002): Molecular methods for identification of wine yeasts. Biodiversity and Biotechnology of Wine Yeast, 35-52, ISBN: 81-7736-120-1. Nguyen Huu-Vang, Lepingle A., Gaillardin C. (2000): Molecular typing demonstrates homogeneity of Saccharomyces uvarum strains and reveals the existence of hybrids between S. uvarum and S. cerevisiae, including the S. bayanus type strain CBS 380. Systém. Appl. Microbiol. 23, 71-85. Valente P., Gouveia F.C., de Lemos G.A., Pimentel D., van Elsas J.D., Mendonca-Hagler L.C., Hagler A.N. (1996): PCR amplification of the rDNA internal transcribed spacer region for differentiation of Saccharomyces cultures. FEMS Microbiol. Lett. 137, 253-256. Kontrolní otázky 1) Jaký je výsledný náboj molekuly DNA? Odkud kam putuje při elektroforéze? 2) Jaké jsou odlišnosti ve stavbě a složení buněčné stěny Gram-negativních, Gram-pozitivních bakterií a kvasinek? 3) Jaký útvar vznikne po odstranění buněčné stěny kvasinek? 4) Proč musíme pracovat s etidiumbromidem v rukavicích? 5) Ve které fázi roztoku (vodné či organické) se nachází DNA při izolování pomocí fenol-chloroformové metody? Informační panel - Základní data o nukleových kyselinách a proteinech Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty (Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4 Počet částic v jednom molu = 6,023 x 10^23 Průměrná molekulová hmotnost páru bazí v DNA = 650 Průměrná molekulová hmotnost bazí v RNA = 360 Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny = 110 Pro dsDNA když A[260 ]= 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace dsDNA = 50 μg/ml = 0,15 mM Pro ssDNA když A[260 ]= 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace ssDNA = 33 μg/ml = 0,10 mM Pro ssRNA když A[260 ]= 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace ssRNA = 40 μg/ml = 0,11 mM Molekulová hmotnost dsDNA = (počet bp) x 650 Počet molů konců dsDNA = 2 x (hmotnost DNA v gramech) / (molekulová hmotnost) Počet molů konců vytvořených restrikčním štěpení a) kružnicová DNA = 2 x (moly DNA) x (počet štěpných míst) b) lineární DNA = 2 x (moly DNA) x (počet štěpných míst) + 2 x (moly DNA) 1μg DNA o délce 1 000 bp = 1,5 pmol = 9,1 x 10^11 molekul 1μg DNA plasmidu pUC18/19 (délka 2 686 bp) = 0,57 pmol = 3,4 x 10^11 molekul 1μg DNA plasmidu pBR322 (délka 4 361 bp) = 0,35 pmol = 2,1 x 10^11 molekul 1μg DNA fága M13mp18/19 (délka 7 249 bp) = 0,21 pmol = 1,3 x 10^11 molekul 1μg DNA fága λ (délka 48 502 bp) = 0,03 pmol = 1,8 x 10^10 molekul 1 pmol DNA o délce 1 000 bp = 0,66 μg 1 pmol DNA plasmidu pUC18/19 (délka 2 686 bp) = 1,77 μg 1 pmol DNA plasmidu pBR322 (délka 4 361 bp) = 2,88 μg 1 pmol DNA fága M13mp18/19 (délka 7 249 bp) = 4,78 μg 1 pmol DNA fága λ (délka 48 502 bp) = 32,01 μg DNA o délce 1,0 kb má kódovací kapacitu 333 aminokyselin = protein o M = 37 000 Protein o M = 10 000 může být kódován DNA o velikosti 270 bp Protein o M = 50 000 může být kódován DNA o velikosti 1,55 kbp Informační panel - Vzorce užitečné pro design PCR Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty (Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4 Přepočty koncentrací Pro oligonukleotid platí, když A[260 ]= 1,0 v 1 cm kyvetě, pak jeho koncentrace = 20-30 μg/ml Molekulová hmotnost (M) M = (N[A] x 312,2) + (N[G] x 328,2) +(N[C] x 288,2) +(N[T] x 303,2) + P kde Nx = počet specifických nukleotidů (A, T, C nebo G) v oligonukleotidu P = + 17 pro fosforylované oligonukleotidy P = - 61 pro defosforylované oligonukleotidy Přepočet µg na pmol pmol oligonukleotidu = µg (oligonukleotidu) x (10^6 pg/ 1 µg) x (1 pmol/330 pg) x (1/N) = = [µg (oligonukleotidu) x 3,030] /N kde N = počet nukleotidů v oligonukleotidu např. 1 µg oligonukleotidu o délce 20 bazí je přibližně 151,5 pmol Přepočet pmol na µg µg oligonukleotidu = pmol (oligonukleotidu) x (330 pg/ 1 pmol) x (1 µg/10^6 pg) x (N) = = pmol (oligonukleotidu) x N x 3,3 . 10^-4 kde N = počet nukleotidů v oligonukleotidu např. 1 pmol oligonukleotidu o délce 20 bazí je přibližně 0,0066 µg Přepočet µM na pmol 1 µl X µM roztoku primeru obsahuje X pmol primeru např. 1 µl 2,5 µM roztoku primeru obsahuje 2,5 pmol primeru Přepočet pmol na µM 1 µl roztoku primeru o koncentraci X pmol/µl má koncentraci primerů X uM např. 1 µl roztoku primeru o koncentraci 20 pmol/µl má koncentraci primerů 20 µM Informační panel - informace užitečné pro práci s PCR Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty (Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4 Zkratky používané pro označení bází v nukleotidech používá se např. při objednávání oligonukleotidů pro PCR Kód Značí Kód Značí A adenin K keto (T a G) T thymin M amino (C a A) G guanin D všechny kromě C C cytosin V všechny kromě T Y pyrimidiny (C a T) H všechny kromě G R puriny (A a G) B všechny kromě A W „weak“ (A a T) N všechny S „strong“ (G a C) X neznámý Výpočty teplot annealingu pro oligonukleotidy dlouhé 14 až 25 nukleotidů Tm = [2 °C x (počet bází A a T)] + [4 °C x (počet bází G a C)] + pro oligonukleotidy delší než 25 nukleotidů Tm = 81,5 °C + 16,6 [Na^+] + 0,41 (% GC) – 0,61 (% for) – 500/N kde [Na^+] = koncentrace Na^+ iontů % GC = podíl nukleotidů G a C v sekvenci % for = podíl formamidu v hybridizačním roztoku Vybrané odkazy na důležité www stránky 1) www.ncbi.nim.nih.gov = databáze sekvencí (Genová banka) a literárních odkazů 2) www.dgb.org = umístění lidských genů, fragmentů DNA, populace, polymorfismy, mapy, mutace 3) www.rebase.neb.com = restrikční enzymy a metylázy 4) www.scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop = klasifikace struktur proteinových domén 5) www.expasy.ch/sprot = databáze proteinových sekvencí SWISS-PROT Informační panel - Tabulka standardního genetického kódu Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty (Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4 kodony první nukleotid druhý nukleotid třetí nukleotid U C A G U Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) U Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) C Leu (L) Ser (S) terminace terminace, SeC Pyr (O) A Leu (L) Ser (S) terminace Trp (W) G C Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) U Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) C Leu (L) Pro (P) Gln (Q) Arg (R) A Leu (L) Pro (P) Gln (Q) Arg (R) G A Ile (I) Thr (T) Asn (N) Ser (S) U Ile (I) Thr (T) Asn (N) Ser (S) C Ile (I) Thr (T) Lys (K) Arg (R) A Met nebo iniciace Thr (T) Lys (K) Arg (R) G G Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) U Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) C Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) A Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) G SeC = selenocystein Pyr = pyrolysin Tučně jsou vyznačeny kodonové rodiny Informační panel- Parametry prokaryotické buňky Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty (Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4 Složení bakteriální buňky Hodnoty platí pro Escherichia coli, případně Salmonella typhimurium Parametr Na buňku Na litr kultury (10^9 buněk/ml) Vlhká hmotnost 950 fg 950 mg Suchá hmotnost 280 fg 280 mg Obsah proteinů 155 fg 155 mg Obsah genomové DNA 17 fg 17 mg Obsah RNA 100 fg 100 mg Objem 1,15 µm^3 = 1 pikolitr Vnitrobuněčná koncentrace proteinů 135 µg/ml Antibiotika používaná v buněčných kulturách Antibiotikum Koncentrace Gram^+ bakterie Gram^- bakterie Mycoplasmata Kvasinky Stabilita při 37°C ampicilin 50-100 mg/ml + + - - 3 dny amfotericin B 0,25-25 µg/ml - - - + 3 dny carbenicilin 100 U/ml + + - - 3 dny ciprofloxacin 10 µg/ml + 5 dnů erythromycin 100 µg/ml + + + - 3 dny gentamycin 5-50 µg/ml + + + + 3 dny kanamycin 100 µg/ml + + +/- - 5 dnů lincomycin 50 µg/ml + - - - 4 dny neomycin 50 µg/ml + + - - 5 dnů nystatin 100 U/ml - - - + 3 dny penicilin G 50-100 U/ml + - - - 3 dny polymixin B 100 U/ml - + - - 5 dnů streptomycin 50-100 µg/ml + + - - 5 dnů tetracyklin 5-10 µg/ml + + + - 3 dny