Sorex_G2 MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 PF_72_100_grey_tr ubz_cz_black_transparent http://image.tutorvista.com/content/heredity-and-evolution/chromosome-types.jpeg http://www.intl-pag.org/icons/telomere.gif http://www.vet.cam.ac.uk/cytogenetics/harlequin.jpg FISHchip http://media.wiley.com/mrw_images/els/articles/a0005002/image_n/nfgz003.gif •analýza mikroskopické struktury chromozomů •pojem „chromosom“ – 1888 Wilhelm Waldeyer •chromozomální teorie dědičnosti: 1. pol. 20. stol. - Theodore Boveri, Walter S. Sutton, Thomas H. Morgan •studium chromozomů: karyologie, cytogenetika •karyotyp = uspořádaný obraz sady chromozomů v buňce MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 PF_72_100_grey_tr ubz_cz_black_transparent chromosom Struktura metafázního chromozomu Klasifikace typu chromozomů podle polohy centromery: metacentrický submetacentrický (subtelocentrický) akrocentrický telocentrický http://image.tutorvista.com/content/heredity-and-evolution/chromosome-types.jpeg Mus1 •role významných technologických inovací - v moderní éře 4-5 takových průlomových momentů: 1objev hypotonického působení ® rozprostření metafázních chromozomů 2kultivace leukocytů periferní krve a fibroblastů 3metody proužkování chromozomů 4metody hybridizace in situ (ISH) 5využití imunochemických metod spolu s ISH ® možnost neradioizotopové detekce hybridizovaných sond (NISH) pomocí různých fluorochromů („chromosome painting“) Historie cytogenetiky •1. Výběr tkáně s vysokou mitotickou aktivitou •kořenová čepička, embrya, larvy, regenerující tkáně •dospělí obratlovci: kostní dřeň, ledviny, slezina, gonády, intersticiální epitelium, epitelium rohovky •někdy stimulace subkutánní, nebo intraperitoneální injekcí fytohemaglutininu, výtažku z líčidla amerického (pokeweed, Phytolacca americana) nebo aktivované suspenze kvasinek Příprava mitotických preparátů •2. Zastavení mitotického dělení in vivo nebo in vitro •cytostatikum: kolchicin, kolcemid, vinblastin •in vivo: výhoda: levnější, jednodušší • nevýhoda: nutnost usmrcení organismu •in vitro: kultivace periferní krve (krátkodobá) a fibroblastů (dlouhodobá) • výhoda: možnost synchronizace dělení ® snížení variability v kondenzaci chromozomů, zvýšení kvality preparátu, snížení spotřeby cytostatika • nevýhoda: větší pracnost, finanční a časová náročnost, méně chromozomů • Příprava mitotických preparátů •3. Hypotonizace buněk •0,075 M roztok KCl, může i destilovaná voda • •4. Fixace • •„Carnoyova směs“ = metanol : kyselina octová (ledová) 3:1 •několkrát vyměnit •pro skvašové preparáty místo metanolu etanol Příprava mitotických preparátů •5. Zhotovení preparátu •v zásadě 2 základní techniky: •skvaš („squash“ = rozmačkání): macerace nebo jemné rozemletí kousků tkáně na podložním skle a rozmáčknutí silikonovým krycím sklem •nakapání („splash“): buněčná suspenze nakapána Pasteurovou pipetou z výšky na podložní sklo ® roztáhnutí chromozomů povrchovým napětím; po nakapání buď vyschnutí na vzduchu („air-dried“), nebo zapálení suspenze („flame-dried“) Příprava mitotických preparátů kultivace Kultivace krve •testes, pylové matečné buňky •hypotonizace citronanem sodným, postup obdobný jako u mitotických preparátů •průběh meiózy a význam jednotlivých stadií; synaptonemální komplexy (SC), štětkovité (lampbrush) chromozomy Příprava meiotických preparátů •Q-proužkování (quinacrine): • •diferenciální excitace a extinkce fluorochromu v závislosti na zastoupení AT bází •barvení chinakrinem, UV světlo Þ krátká doba viditelnosti Proužkování chromozomů („banding“) mechowi_Q http://media.wiley.com/mrw_images/els/articles/a0005777/image_n/nfgz001.gif mechowi_G •G-proužkování (Giemsa, GTG-banding): • •účinek denaturačních činidel na stabilitu proteinových a nukleových složek chromatinu •pozitivní (tmavé) proužky » oblasti bohaté na AT báze (izochory) •působení trypsinu (chymotrypsin, NaOH) •barvení Giemsou Proužkování chromozomů („banding“) rypoš obří (Fukomys mechowi) Sorex_G2 rejsek obecný (Sorex araneus) Anicka_G Homo sapiens Lemur catta_R •R-proužkování (reverse banding): • •denaturace při alkalickém působení za vysoké teploty (80-90°C) a následná renaturace DNA •tmavé proužky » izochory bohaté na GC báze •barvení Giemsou nebo akridinovou oranží Proužkování chromozomů („banding“) Lemur catta •C-proužkování (constitutive heterochromatin): • •postupné působení silné kyseliny (1M HCl) a zásady (Ba(OH)2) a renaturaci heterochromatinu v solném pufru (2´SSC) za vysoké teploty (60°C) •rozpuštění euchromatinu •barvení Giemsou (vizualizace satelitní DNA) Proužkování chromozomů („banding“) myvalovec_C psík mývalovitý (Nyctereutes procyonides) kolčava a hranostaj mechowi_C mechowi_G rypoš obří (Fukomys mechowi) lasice_C •Ag-NOR: • •želatina + kyselina mravenčí, barvení AgNO3 •barvení organizátorů jadérek (pouze aktivní) Proužkování chromozomů („banding“) kolčava rypoš obří (Fukomys mechowi) kolcava_NOR mechowi_NOR •BrdU: • •replikace za přítomnosti umělého prekurzoru (5-bromo-2´-deoxyuridin) ® sledování výměn sesterských chromatid • Proužkování chromozomů („banding“) 2_11 hybridizace chromozomů in situ se značenou sondou možnost použití i několika sond současně vizualizace: protilátky specifické pro biotin (avidin, streptavidin), které jsou konjugovány buď s fluorochromem (např. fluorescein izothiokyanát, FITC), nebo s enzymatickými činidly (např. alkalinfosfatáza, peroxidáza), reakce se specifickým substrátem Fluorescenční hybridizace in situ (FISH) CISS, chromosome in situ supression hybridization PRINS, primed in situ labelling GISH, whole genome in situ hybridization FACS, fluorescence activated cell sorting vybarvování chromozomů = „chromosome painting“ Fluorescenční hybridizace in situ (FISH) 799px-FISH_(Fluorescent_In_Situ_Hybridization) FISH_(technique) Urovysion_on_Duet Bcrablmet FISHchip Mikrodisekce MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 PF_72_100_grey_tr ubz_cz_black_transparent http://web.siumed.edu/~bbartholomew/images/chapter6/F06-21.jpg http://www.science-house.com/images/Tarsons/ElectrophoresisSubMidi.jpg http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch20/20_09bGelElectrophoresis-L.jpg •elektroforéza: z řečtiny = transport pomocí elektřiny obecně = pohyb nabitých částic v médiu vlivem el. pole • •do konce 50. let genetická proměnlivost v populacích studována pouze na základě mendelovských morfologických znaků nebo polytenních chromozomů ® otázka, do jaké míry tyto jevy reprezentují skutečnou míru genetické proměnlivosti v přírodě • •substituce aminokyselin můžeme zjistit sekvenováním – pokud to není možné, lze nahradit elektroforézou proteinů •z 20 AA 3 nesou kladný náboj (Arg, Lys, His), 2 záporný náboj (Asp, Glu) • •kromě náboje i velikost a konformace makromolekuly (-S-S- můstky, van der Waalsovy síly, vodíkové vazby, elektrostatické síly); pH pufru • •stabilizace el. náboje → specifický pufr s vysokou iontovou silou a pH co nerozdílnější od pI daného proteinu: pH 3-10, nejčastěji 6,5-9,5 • •náboj většiny proteinů při pH 8-9 záporný ® migrace k anodě •Princip ELFO znám již od konce 19. stol. • •1937 - Thisselius: metoda „pohyblivého rozhraní“ • •1949 - Linus Pauling: papírový nosič - abnormální Hb srpkovité anémie • •1955 - O. Smithies: škrob • •1957 - Hunter a Moeller: užití katalytických shopností enzymů (histochemické barvení) • •1966 - aplikace ELFO na přírodní populace: Harry Harris (člověk), Richard Lewontin a John Hubby (octomilka) • • •Nosiče (média): •škrob (starch gel el., SGE): velikost molekuly + velikost náboje •celulózoacetát (CAGE): náboj •agar, agaróza (AGE): náboj •polyakrylamid (PAGE): velikost molekuly + náboj Metody elektroforézy •horizontální •vertikální •kapilárová • • 3_1 3_2 •1. ELFO v kontinuálním pufru • •2. ELFO v diskontinuálním pufru (multifázická ELFO): •2 gely o různých koncentracích - koncentrující a separující •na rozhraní „sendvičování“ proteinů mezi „vedoucím“ a „taženým“ iontem; pokud jen tento krok = izotachoforéza Metody elektroforézy http://web.siumed.edu/~bbartholomew/images/chapter6/F06-21.jpg •3. Izoelektrická fokusace (isoelectric focusing, IEF): •v gelu syntetické polyamino polykarbonátové skupiny = nosné amfolyty s rozsahem pI •připojením el. pole ® stabilní gradient pH; amfolyty drženy v gelu silnou kyselinou při anodě a silnou zásadou při katodě • Metody elektroforézy http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/documents/image/ucm059972.jpg http://www.channelwolf.com/lvv/sem6/index_files/image1749.jpg •4. ELFO v močovině a SDS: •SDS = sodium dodecyl sulphate (= aniontový detergent): schopnost rozpouštět některé proteiny a štěpit některé polymery SDS způsobuje silný záporný náboj proteinů, migrace jen podle hmotnosti molekuly •močovina: podobně jako SDS, ale náboj proteinů normální - migrace podle celkového náboje •(podobně možnost tepelné denaturace proteinů a následná ELFO) • •5. Dvousměrná (2-D) ELFO: •připojení el. pole postupně ve dvou na sebe kolmých směrech např. 1. fáze = IEF, 2. fáze = SDS ELFO - kombinace pI a molekulové hmotnosti Metody elektroforézy •Schopnost separace proteinů krevní plazmy: • •CAGE: 5 pruhů •SGE: 15 •PAGE: 19 •IEF > 30 •2-D ELFO ca. 300 skvrn ~ 75-100 polypeptidů Metody elektroforézy http://www.prlog.org/10827617-2d-gel-electrophoresis.jpg 3_6 •nespecifická: amidočerň, Coomassie Brilliant Blue R •specifická: barviva pro glykoproteiny, lipoproteiny histochemické barvení enzymů: spřažení katalýzy přeměny specifického substrátu s barvicí reakcí - nitrotetrazoliové soli (MTT, NBT) + PMS (phenazin methosulfát); Fast Blue RR; Fast Garnett GBC, Fast Black K - redukce NAD+, NADP+ - někdy nutno dodat další enzymy Detekce proteinů obarvený gel = obecně elektroforetogram, jestliže obarveny enzymy = zymogram (enzymogram) proužky = „elektromorfy“, „alely“, „alelomorfy“ izozymy, alozymy 3_8 3_9