1 Aplikace genového inženýrství – příprava farmakologicky nebo průmyslově významných látek • Hormony, • Růstové faktory • Vakcíny, • DNA-vakcíny • Protilátky, • Abzymy, • Imunotoxiny • Další biologicky aktivní látky (interferon, krevní srážecí faktory aj) 2 Gen pro inzulin pre-mRNA mRNA pro pre-proinzulin pre-proinzulin preprohormon proinzulin prohormon aktivní inzulin zralý hormon DNA řetězec C řetězec C řetězec C řetězec B řetězec A řetězec A řetězec A řetězec B Enzymové štěpení řetězec B pre-sekvence mRNA ribozom Translace Sestřih Transkripce 3 Vytváření aktivního inzulinu z prekurzorů působením proteáz (v eukaryotických buňkách) Příprava jednořetězcové formy inzulinu v Lactococcus lactis Vytváření jednořetězcového inzulinu v L. lactis. Řetězce A a B jsou spojeny krátkým 6 amk linkerem a některé aminokyseliny byly zaměněny pro dosažení vyšší stability v gastrointestinálním traktu. Exprese se dosáhne přidáním nisinu 4 Příprava lidského inzulinu v bakteriálních buňkách CNBr štěpí peptidovou vazbu následující za metioninem Transformace E. coli Působení kyanbromidem (CNBr) Purifikace řetězců A a B Beta-galaktozidáza Purifikace fúzního proteinu B-gal-inzulín Kultura buněk Aminotermální část zralého řetězce B Vytvoření aktivní formy inzulínu disulfidová vazba Aktivní inzulín řetězec Břetězec A řetězec Břetězec ABakteriální promotor 5 Příprava lidského růstového hormonu (hGH) v bakteriích Met není u přirozeného hGH Příprava formy hGH sekretované v bakteriálních buňkách 6 Příprava tkáňového aktivátoru plazminogenu (tPA) P T Amplifikace genů tPA tPA Štěpení plazminogenu plazmin Degradace fibrinu – rozpouštění krevních sraženin Komerční výroba fibrinolyzin 7 Přehled hlavních typů vakcín A. vakcíny vyrobené tradiční technologií: - živá vakcína -- virulentní (dnes se již nepoužívá) -- heterologní (příbuzný patogen) -- atenuovaná - inaktivovaná vakcína -- celobuněčná -- toxoidová (toxin zbavený toxicity) - subjednotková -- s purifikovaným antigenem -- se syntetickým antigenem -- ribozomální B. rekombinantní vakcíny: - subjednotková -- s deletovaným genem -- vektorová C. DNA vakcíny D. antiidiotypové vakcíny - Vakcína připravená z protilátek, které považují jiné protilátky za antigen a navážou se na ně. Antiidiotypové vakcíny mohou stimulovat organizmus k vytváření protilátky proti nádorovým buňkám 8 Konvenční způsoby vakcinace a DNA-vakcinace Usmrcený nebo atenuovaný patogen Proteinová podjednotka patogena = antigen DNA vakcinace do těla je vnesena DNA, která kóduje tvorbu antigenu 9 Reverzní vakcinologie -Stanovení kompletní sekvence genomu patogena -Vyhledání genů kódujících potenciální antigeny pomocí bioinformatických nástrojů – proteiny s mimobuněčnou lokalizací, signální peptidy, epitopy B-buněk -Příprava produktů těchto genů a jejich testování jako antigenů -Vakcína proti meningitidě (MenB) – 570 ORF - potenciálních antigenů -Streptococcus pneumoniae -Staphylococcus aureus -Chlamydia pneumoniae (Chlamydophila pneumoniae) 10 Příprava podjednotkové vakcíny viru HBV v kvasinkách Infekční částice HBV Plášťový protein Klonovaná DNA viru HBV Izolace sekvence kódující HBsAg Kvasinkový promotor transkripce Vnitřní protein Ligace Počátek replikace pro kvasinky Počátek replikace pro bakterie Kvasinkový expresní vektor Kvasinkový terminátor transkripce Transformace kvasinkových buněk Selekce buněk, které obsahují plazmid Kultura buněk ve fermentoru Shromáždění buněk centrigací Rozbití kvasinkových buněk Purifikace částic HBsAg Výhody: 1. Přesně definovaný antigen 2. Stabilní, skladovatelný 3. Nevyvolává vedlejší účinky Nevýhody 1. Drahá purifikace 2. Odlišná konformace proteinu 11 Patogeny vyvolávající lidská onemocnění vůči nimž jsou připravovány rekombinantní vakcíny 12 13 Product Company Therapeutic indication Date approved Příklady rekombinantních vakcín (vakcín obsahujících rekombinantní antigeny) 14 Vazba na receptory mukózy vlastní toxin Struktura choleratoxinu Strategie pro vytvoření delece části peptidu A1 choleratoxinu – příprava kandidátního vakcinačního kmene Vyštěpení části sekvence kódující peptid A1 (klonované v plazmidovém vektoru) – vyštěpí se ~ 90% aminokyselin) Cirkularizace vektoru (připojení XbaI-linkeru, štěpení XbaI, ligace) Přenos vektoru do kmene, v němž je uvnitř genu pro A1 začleněn gen pro rezistenci k tetracyklinu (A1 je inaktivován, buňky jsou TetR) – potenciální reverze A1 vyčleněním tetR – proto není vhodný jako vakcína Vektor se po několika generacích spontánně vyředí Selekce buněk TetS, obsahujících deletovanou formu A1 – tyto buňky tvoří složku A2 a B, a jsou proto imunogenní – reverze není možná Vibrio cholerae 15 Příprava podjednotkové vakcíny proti HSV v buňkách CHO (chinese hamster ovary) Glykoprotein D (gD) imunogenní složka HSV HSV – onkogenní virus, sexuálně přenosná onemocnění, encefalitida, infekce oka Membránově vázaná forma, 16 Úprava genu pro plášťový glykoprotein (gD) HSV pro získání rozpustné formy gD Kompletní gen pro gD obsahující C-terminální úsek kódující transmembránovou doménu – tato forma gD je obtížně purifikovatelná V genu pro gD byla oblast kódující transmembránovou doménu deletována, výsledný produkt je rozpustný a lze jej snáze purifikovat Klonování a exprese genu v savčích expresních systémech (CHO) 17 Využití patogenního druhu Shigella flexneri jako živého vektoru k přenosu DNA pro genetickou imunizaci do savčích epiteliálních buněk Exprese klonovaného genu v cytoplazmě (!euk. P), tvorba produktu, imunizace Aspartát β- semialdehyd dehydrogenáza Perorální podání Buňky invadují do epiteliálních buněk, ale nemnoží se – vhodný vektor pro přenos DNA Patogenní bakterie – nelze použít k vnesení imunizační DNA ~ nepatogenní bakterie Bakterie není patogenní, nemnoží se, plazmid přechází do cytoplazmy host. buněk Plazmidová DNA s genem pro antigen Deleční mutant 18 Rekombinantní protilátky A.Terapeutické účely - pasivní imunizace - cílené dopravování léčiv – terapeutické protilátky - protinádorová léčiva – biologická léčba B. Diagnostické účely imunologické analýzy 19 Struktura protilátky Fab (antigen binding fragment) Fc Fv Papain (hydrolýza) 20 Části IgG Fc = interakce s buněčnými receptory a komplementem Fab = obsahuje vazebné místo pro Ag. Řetězce jsou spojeny disulfidickými můstky Fv = část Fab, váže antigen. Řetězce jsou spojeny flexibilním peptidovým linkerem nebo nově vytvořenou disulfidickou vazbou Funkční části protilátky 21 22 Stejný primer pro všechny Kombinace milionů klonů pro těžké a pro lehké řetězce Klonování cDNA pro přípravu rekombinantních protilátek Soubor cDNA pro těžké řetězce Lymfocyty získané z imunizované myši (přeskupené geny) Soubor degenerovaných 5´-primerů klonovaná cDNA pro těžký řetězec, stejným způsobem se klonuje cDNA pro lehký řetězec 23 Příprava specifické protilátky Příprava milionů cDNA nesoucích informaci pro L a H řetězce Amplifikace genů pro L a H řetězce pomocí PCR, klonování do fágového vektoru Každý fág obsahuje náhodnou kombinaci L a H Soubor fágů představující kombinatorickou fágovou knihovnu Překlonování do expresního savčího nebo bakteriálního vektoru Miliony „monoklonálních“ protilátek 24 Příprava kombinatorické knihovny VL- a VH- oblastí protilátek v E. coli ve vektoru lambda Lidské B-lymfocyty PCR cDNA H a L řetězců mají odlišná místa pro různé RE, což umožňuje jejich oddělené klonování Mnoho různých kombinací – každý „kombinatorický vektor“ obsahuje jednu kombinaci. selekce Využití v diagnostice/terapii Překlonování vybraných kombinací do plazmidu (fág buňky lyzuje a není možné získat větší množství produktu) 25 Konstrukce kombinatorické knihovny Fv ve vektoru bakteriofága lambda cDNA řetězců L a H separátně klonované ve vektorech lambda (knihovny L-řetězců a H-řetězců) Ligace jednotlivých L a H řetězců a jejich klonování v lambda vektoru 26 Vytvoření kombinatorické knihovny Fv protilátek ve vektoru fága M13 (fágemidech) Klonováním do genu 3 vzniká fúzní protein, který je lokalizován na povrchu fága Spojovací peptid Selekce (ELISA-like) 27 • Lidské chromozomy v hybridomech vytvořených po fúzi lidských lymfocytů s myšími myelomovými buňkami jsou nestabilní, takže se takové hybridomy produkující monoklonální protilátky vytvářejí jen vzácně • Nejsou k dispozici linie lidských myelomových buněk, které by mohly nahradit myší myelomové buňky při tvorbě hybridomů • I kdyby bylo možné vytvářet lidské hybridomové buněčné linie, bylo by to proti lékařským etickým zásadám (injikování specifických antigenů do člověk za účelem jiným než terapeutickým, a odběr části sleziny pro získání lymfocytů) Transgenní myši s geny pro lidské imunoglobuliny v YAC (jejich vlastní geny pro Ig knokautovány, pak imunizace, např. tetanotoxinem – tvoří lidské protilátky) Důvod pro přípravu humanizovaných protilátek: obtížná příprava lidských monoklonálních protilátek konvenční hybridomovou technologií 28 Příprava humanizovaných protilátek Myší protilátka Chimerická protilátka Humanizovaná protilátka Variabilní, konstantní a hypervariabilní oblasti jsou z protilátek myši Konstantní oblast je z lidské protilátky, variabilní a hypervariabilní oblasti jsou z myši Hypervariabilní oblasti jsou z myších protilátek, ostatní jsou lidské – zvýšení specifity mutacemi CDR CDRs -complementarity determining regions 65% lidské 95% lidské 29 Lidské protilátky Human monoclonal antibodies (umab) Jsou připravovány z transgenních myší, do jejichž genomu jsou přeneseny lidské geny pro imunoglobuliny. Tyto myši jsou následně imunizovány požadovaným antigenem a produkují pak monoklonální protilátky. Ty jsou pak in vitro použity k přípravě plně humánních protilátek. 30 Protilátka vázající se na antigeny na povrchu tumorových buněk Protilátka vázající se na antigen na povrchu T buněk manipulace na úrovni cDNA rekombinace protilátka s dvojí specifitou Tumorová buňka T buňka T buňka usmrcuje tumorovou buňku Protilátka s dvojí specifitou 31 Mechansimus působení bispecifické monoklonální protilátky Buňka adenokarcinomu Cytotoxická T buňka Makrofág, NK nebo dendritická buňka 32 Mechanismus působení bispecifické monoklonální protilátky Buňka adenokarcinomu Cytotoxická T buňka Makrofág, NK nebo dendritická buňka Catumaxomab (obchodní označení Removab) je hybridní monoklonální protilátka používaná k léčbě maligního ascitu u pacientů s metastázujícími nádory. Váže se na antigeny CD3 přítomné na cytotoxických T-buňkách a současně na antigeny EpCAM na nádorových buňkách. Je používána v EU a klinicky testována v USA. 33 34 scFv - single chain antibody variable region fragments (SCA) scFv – terapeutické agents – nové vazebné schopnosti, nižší imunogenicita v důsledku chybění Fc domény, snadnější penetrace do cílového místa (pevné nádory atp). Linker je nutný pro vytvoření konformace schopné vázat antigen Disulfidické můstky (glycin4serin)3 a) b) c) 35 Schematické znázornění struktury „single-chain“ Fv imunotoxinů (scFv) Záměna peptidového linkeru za disulfidický můstek několikanásobně zvyšuje stabilitu scFv a tím zlepšuje jeho terapeutické využití - exotoxin A Pseudomonas - difterický toxin - ricin Protinádorové působení (vazba na receptory a povrchové proteiny nádorových buněk) Např. fúzní protein HER2-Ig + exotoxin Pseudomonas Pbs21 (plasmodium) + Shiva-1 A B human epidermal growth factor receptor 2 -Approximately 30% of breast cancers have an amplification of the HER2/neu gene or overexpression of its protein product. 10-25 aa 36 Terapeutické protilátky Aktivace plazminogenu na plazmin, degradace fibrinu Figure 10.16 Structure of an immunotherapeutic thrombolytic agent. Antifibrin antibody, a monoclonal antibody that is specific for the fibrin found in blood clots, is coupled to plasminogen activator (PA). After the complex binds to the fibrin of a blood clot, the plasminogen activator causes plasmin to accumulate in the vicinity of the clot. The plasmin then degrades the clot. Struktura imunoterapeutické trombolytické protilátky. Antifibrinová protilátka (monoklonální protilátka specifická pro fibrin, který se nachází v krevní sraženině) je vázána s aktivátorem plazminogenu (PA). Když se protilátka naváže na fibrin, PA vede k tvorbě a akumulaci plazminu v blízkosti sraženiny. Plazmin (proteáza fibrinolyzin) pak degraduje krevní sraženinu. 37 Date of approval Type of antibody Company Therapeutic use Some therapeutic monoclonal antibodies that have been approved for human use in either the United States or European Union 38 -omab = myší; -ximab, -zumab = chimerická, humanizovaná; -umab = humánní Příklady schválených terapeutických monoklonálních protilátek 39 40 B = vazebná doména; T = translokační doména; A = doména s aktivitou Toxiny používané pro přípravi imunotoxinů PE DT 41 1. generace: toxin připojen chemicky disulfidickými vazbami 2. Generace: toxiny zbaveny domény pro vazbu na normální endoteliální buňky 3. Generace: Rekombinantní imunotoxiny. scFv. Vzhledem k aktivitě toxinu na eukaryotické buňky musí být připravovány v bakteriích (E. coli) Etapy vývoje imunotoxinů CRM (cross-reacting material) – mutantní forma DT s nízkou afinitou k receptorům – vazbu k cílové buňce zajišťuje protilátka 42 Generace imunotoxinů 43 Rekombinantní imunotoxin se váže na antigeny na povrchu nádorové buňky, endocytózou se dostavá dovnitř, kde toxin zasáhne životně důležité funkce. Endocytóza imunotoxinu a jeho působení na nádorové buňky 44 Pathways of binding, internalization, and processing by immunotoxins leading to the killing of target cells. Shown are ricin-, Pseudomonas- and diphtheria-based immunotoxins. Immunotoxins bind the target antigen, are internalized via clathrin-coated pits, and are processed within endosomal compartments. Ricin and Pseudomonas toxin derivatives must traffic through the endoplasmic reticulum to the cytosol where they enzymatically inactivate protein synthesis. Pseudomonas exotoxin A ADP-ribosylates EF2, while ricin depurinates ribosomal RNA. Diphtheria-based toxins are internalized to endosomes where the A chain of the toxin translocates directly to the cytosol and ADP-ribosylates EF2. Cell death follows inhibition of protein synthesis. dgA: deglycosylated ricin A chain; EF2: elongation factor 2. 45 Abzym (odvozeno z antibody a enzyme) nazývaný také jako catmab (catalytic monoclonal antibody) je monoklonální protilátka vyznačující se katalytickou aktivitou. Abzymy jsou uměle vytvářené konstrukty, nacházejí se ale také přirozeně např. u člověka (anti-vasoactive intestinal peptide autoantibodies), a u pacientů s autoimunitní nemocí lupus erythematosus, u nichž mohou vázat a hydrolyzovat DNA. Abzymy jsou potenciální nástroje pro biotechnologie, např. Pro specifické reakce u DNA. Enzymy fungují tak, že snižují aktivační energii transičního stavu interagujících látek, čímž katalyzují vytváření jinak méně-výhodných molekulárních intermediátů mezi reaktanty a produkty. Pokud se připraví protilátka vůči nějaké stabilní molekule, která se podobá nestabilnímu intermediátu nějaké jiné (případně nepříbuzné) reakce, bude se tato protilátka (abzym) enzymaticky vázat a stabilizovat intermediátový stav a tím katalyzovat reakci. Molekuly, které jsou modifikovány tak, aby se vyznačovaly novými katalytickými aktivitami se nazývají SynZymy. Abzymy – monoklonální protilátky s katalytickou aktivitou 46 Abzym (Ab-enzym) catmab (catalytic monoclonal antibody) Reaction course Energy Hydrolýza esteru Snížení aktivační energie enzymem nebo abzymem Fosfonátový ester 47 Izolace celkové mRNA RT-PCR cDNA Amplifikace variabilních oblastí L a H řetězců Klonování a skríning Příprava protilátky s enzymovou aktivitou (abzymu) Konjugace analogu k nosičovému proteinu 48 Protilátka (abzym) dopraví enzym k receptorům na nádorových buňkách, kde enzym konvertuje netoxický prekurzor (prodrug) na látku, která účinně nádorové buňky usmrcuje. Tím je omezen toxický účinek na normální buňky. Princip Antibody-Directed Abzyme Prodrug Therapy AntibodyDirected Abzyme Prodrug Therapy (ADEPT) The use of abzymes at industrial scale for specific synthesis of molecules is still at the laboratory step, even if some firms like Novartis (Switzerland) or Bristol-Myer Squibb (USA) have shown their interest for using the aldolase abzyme, produced in the Lerner's group, for synthesis of Epothilone A, a new anti-cancer compound. 49 Aplikace: abzym je injikován do pacienta, kde se svou protilátkovou oblastí váže na nádorové buňky. Následně je do krevního řečiště vpraven prekurzor léčiva, který je enzymovou aktivitou abzymu konvertován na aktivní léčivo. To působí jen na nádorovou buňku, na níž je abzym navázán. Tím jsou selektivně destruovány jen nádorové buňky a nikoliv normální buňky, na něž se abzym neváže. Struktura abzymu pro destrukci nádorových buněk Oblast protilátky Oblast s enzymovou aktivitou Vazba na nádorovou buňku Přeměna prekurzoru na aktivní léčivo 50 Antibody-Directed Abzyme Prodrug Therapy (ADEPT) – enzymová aktivita abzymu aktivuje prekurzor léčivé látky a tu pak dopravují do blízkosti nádorové buňky 51 Potenciální léčba AIDS pomocí abzymu Byl připraven abzym degradující vazebnou oblast proteinu gp120 viru HIV. Tato oblast je jediná část viru HIV, která se u jednotlivých kmenů nemění, neboť je nezbytná pro vazbu viru na T- lymfocyty. Abzym působí opakovaně, po inaktivaci jedné virové částice destruuje další (může zničit až tisíce virů) 52 Abzym hydrolyzující kokain (imunofarmakoterapie) Je určen k léčbě při předávkování kokainem nebo pro léčbu závislosti Kokain je malá molekula, vůči níž lidské tělo nevytváří protilátky. Pro vytvoření protilátky vázající kokain byl metabolit kokainu (nor-kokain) konjugován k netoxické podjednotce cholerového toxinu (podjednotka B). Tento komplex je schopný navodit v těle silnou imunitní odpověď, která vede k rychlé tvorbě vysokého množství protilátek. Při aplikaci této protilátky do krevního řečiště pak rychle dochází k její vazbě na kokain a jeho neutralizaci, takže se nedostává do CNS. Podobné protilátky proti heroinu, nikotinu atp. 53 Another example of medical application concerns antibodies that specifically hydrolyze cocaine. A commercialization agreement between Columbia University and Ixsys Inc. could allow to use abzymes for treating cocaine overdose and addiction. Cocaine abuse remains a major public health problem despite ongoing research aimed at developing therapies to counter its harmful effects. Immunopharmacotherapy is one proposed therapy which would block cocaine in the blood stream before it reaches the central nervous system. Cocainebinding antibodies seem likely candidates for soaking up drugs in the blood stream, but their only binding abilities are not sufficient to withstand high concentrations of the drug. What is needed is a monoclonal antibody with high binding characteristics and sufficient catalytic ability to metabolize cocaine. The Wilson and Janda groups at The Scripps Research Institute are hopeful that they have found these properties in 7A1, a catalytic monoclonal antibody that has the ability to regenerate after each new dose of the drug. Aided by x-ray crystallography, their research has revealed for the first time the complete reaction cycle of a 7A1 Fab' antigen binding fragment. The high resolution crystal structures revealed the conformational changes that occur during the antibody's complete catalytic cycle and provided a molecular basis for catalysis. Understanding these significant structural changes of the antibody is a promising step towards the development of a treatment for cocaine addiction. To create a vaccine, the body has to be convinced to generate antibodies against cocaine when it circulates through the bloodstream. Because cocaine is a small molecule, humans do not naturally generate these antibodies. Researchers have had success in generating an antibody response by conjugating a minor metabolite of cocaine (nor-cocaine) to a non-toxic subunit of cholera toxin (subunit B) - which is the protein secreted from the cholera bacteria. Once in the body, this compound is able to generate a very powerful immune response that causes the body to create antibodies quickly and in high levels. Vaccination therefore results in the production of IgG antibodies against cocaine that can rapidly neutralize cocaine as it enters the bloodstream. 54 Potenciální léčba AIDS pomocí abzymu Byl připraven abzym degradující vazebnou oblast proteinu gp120 viru HIV. Tato oblast je jediná část viru HIV, která se u jednotlivých kmenů nemění, neboť je nezbytná pro vazbu viru na T- lymfocyty. Abzym působí opakovaně, po inaktivaci jedné virové částice destruuje další (může zničit až tisíce virů) 55 Přenos DNA: • biolistická metoda: rekombinantní plazmid (E. coli) nesoucí gen pro antigen pod kontrolou virového promotoru je vnesen např. do boltce myši • injekce velkých množství DNA (100 mg rek. plazmidu) přímo do svalů zvířat – účinnost přenosu až 70% • elektroporace Výhody: • Nehrozí reverze: není použit živý nebo oslabený patogen • antigen je správně posttranslačně upraven a není třeba jej purifikovat • na jednom plazmidu mohou být v jednom kroku přeneseny geny pro více antigenů • Snadné skladování, stabilita DNA Nevýhoda: • neznalost osudu přenesené DNA v buňkách, začlenění do genomu hostitele a přerušení genů – proto je výhodnější transientní exprese (extrachromozomální stav) Příklady virových antigenů: chřipka, HIV, bovinní HV, vzteklina, HBV, rotavirus, slintavka a kulhavka, aj. Bakteriální antigeny: Clostridium tetani, Mycobacterium tuberculosis, Genetická imunizace - DNA vakcíny Gen kódující antigen je vnesen do buněk zvířete, v nichž je pak tento antigen produkován a zvíře vytváří protilátky. 56 Navázání plazmidové DNA na kationty povrchu polymerových mikročástic Plazmidová DNA je navázána na biodegradovatelné mikročástice polymerů (0,3- 1,5 µm), z nichž se postupně uvolňuje (1. den 35%, 14. den 75%). Průběžně dochází k expresi antigenu – účinnost je vyšší než při injekci volné DNA, stačí zhruba 250x méně DNA). 57 Aptamery = sekvence nukleových kyselin (RNA nebo DNA) o délce 10-50 nts, které se silně vážou k některým oblastem proteinů, aminokyselinám, léčivům a jiným molekulám. Vyznačují se vysoce organizovanou sekundární nebo terciární strukturou. Vážou se na cílové molekuly, čímž je inhibují, a nebo mohou doručovat různé inhibitory k cílovým buňkám. Dosahují stejné specificity vazby k cílovým molekulám jako terapeutické protilátky, ale na rozdíl od nich nejsou imunogenní a snadněji se připravují. 58 Metoda SELEX (systematic evolution of ligands by experimental enrichment) 59 Vazba některých aptamerů na povrch cílové molekuly (ostatní se nevážou) 60 Příklady proteinů, vůči nimž byly aptamery připraveny a síla jejich vazby 61 A. Využití mutageneze in vitro pro záměnu klíčových aminokyselin (bodové mutace) • zvýšení termostability proteinů (lysozym aj) • rezistence proteinů k oxidativnímu stresu • zvýšení bioaktivity proteinů druhá generace farmak s vylepšenou farmakokinetikou, strukturou, stabilitou a biologickou dostupností (inzulin – zvýšení schopnosti absorpce, tkáňový plazminogenový aktivátoru – zvýšení poločasu oběhu) Příklad: Subtilizin – hydrolýza proteinů, např. v detergentech prakticky každá vlastnost této serinové proteázy byla pozměněna/optimalizována: • rychlost katalýzy, • substrátová specifita, • tolerance k pH, • tolerance k oxidačním látkám, • termostabilita. • zvýšená stabilita v org. rozpouštědlech (změna konformace proteinu) Proteinové inženýrství Navrhování, vyvíjení a příprava proteinů s vylepšenými charakteristikami (pozměněné nebo zcela nové proteiny) 62 • Klenowův fragment DNA polymerázy, který postrádá 3´-5´ exonukleázovou aktivitu. • Přidání aminokyselin = stabilizace cizích proteinů v E. coli. • Zvýšení afinity proteinů k iontům kovů vložením sekvence His-X3-His do alfa-helixu – zvýšení rezistence k denaturaci. • Jeden gen je fúzován s druhým za vzniku kompletně nového proteinu. Varianty protilátek – jednořetězcové protilátky (SCA – single chain antibodies) jsou umělé protilátky složené z vazebných oblastí těžkého a lehkého řetězce, které jsou spojeny chemicky a vytvářeny v mikroorganismech pomocí expresních vektorů. • Příprava purifikovaných imunogenních složek v prokaryotických nebo eukaryotických systémech (vakcína proti hepatitidě B ve kvasinkách, vakcína proti Salmonella typhimurium – oslabení kmene vnesením mutace do genomu) • Nepatogenní mikroorganismy použité jako vektory pro expresi cizích genů zodpovědných za imunogenicitu (rekombinantní vakcíny, které stabilně exprimují cizí geny: u Vibrio cholerae byl připraven kmen s delecí v genu pro cholerový toxin – mutace byla vnesena rekombinací do standardního kmene. Výsledný kmen produkoval imunogenní, avšak netoxický „toxin“ (netoxickou B podjednotku toxinu). • viry jako vektory pro expresi imunologicky aktivních proteinů (virus vakcinie – rekombinantní vakcíny proti vzteklině) B. Makromodifikace proteinů Část genu se eliminuje vyštěpením restrikčního fragmentu nebo nahradí chemickou syntézou části genu. 63 • Genetickou úpravou lze připravit bakterii, která by produkovala modré barvivo používané na džínovinu. Výroba barviva by byla mnohem ekologičtější nežli současná chemická syntéza, která ročně produkuje asi 16 000 tun tohoto barviva. • Podle evropské legislativy budou muset být takové džíny na viditelném místě označeny nápisem: "Vyrobeno z geneticky modifikovaných organismů". 64