Klonování genů v kvasinkách Důvody pro klonování genů v eukaryotech A. Funkce charakteristické pro eukaryotické buňky, které se u baktérií nevyskytují: - lokalizace systému regenerujícího ATP v mitochondriích, - uspořádání DNA v chromatinu - způsob dělení buněk, mitoza a meioza - diferenciace buněk, buněčné komunikace, signální dráhy B. Rozdíly v expresi genů u eukaryot oproti bakteriím: - odlišnost regulačních sekvencí pro transkripci, translaci a export - specifické posttranslační modifikace i Výhody kvasinek pro Gl • jednoduchá eukaryota s mikrobiálním charakterem (malý genom se známou sekvencí, krátká generační doba a vysoký počet potomstva, kultivace na definovaných půdách, řada mutant získaných a charakterizovaných klasickou i moderní genetikou • řada genů homologních vyšším eukaryotům, podobná buněčná biochemie a regulace genů • možnost stanovit dominanci a recesivitu alel (na haploidním pozadí) • vysoká frekvence homologní rekombinace - záměny genů • tradiční dobře definovaný a bezpečný biotechnologický organismus, možnost přípravy farmak pro humánní medicínu, • eukaryotické proteiny vytváří v aktivní podobě, lze dosáhnout sekrece do prostředí 2 Životní cyklus kvasinek Zygotic diplophase ©•O tetrádová analýza Dva typy haploidních buněk: a a a Heterotalické kmeny - stabilní Homotalické kmeny - nestabilní, haploidní buňky spontánně revertují na opačný buněčný typ Molekulární struktura kvasinkového 2\x plazmidu (a) D Izomerní formy plazmidu 0 6,3 kb; 50-100 kopií FLP REP - replikace FLP - rekombince STB - rozklad kointegrátu FRT site = FRT recombination target Flp recombinase = flippase Systém Flp/FRT ~ Cre/loxP Chimérické plazmidy vytvořené spojením plazmidu 2ju, a pMB9 štěpených EcoRI, (dále pak vložení genu Ieu2 z kvasinkového chromozomu do místa Pstl na plazmidu) Kyvadlové vektory pro klonování genů v kvasinkách Základní typy kvasinkových vektorů Možnost eliminace bakteriálních sekvencí jejich ohraničením FLP 6 Umělý kvasinkový chromozom (YAC) Transform into ade , ura , trp yeast and select for red, URA+, TRP+ colonies Virům podobné částice odvozené z Ty elementů nesoucích kódující oblast HIV1 TAT Ty-element 30-40 kopií v genomu S. cerevisiae, velikost 5,9 kb LTR - 334 bp, levá funguje jako promotor genů pro RT a integrázu. Pseudovirion (virus like particle, VLP) obsahuje mRNA, dsDNA, RT a integrázu Životní cyklus Tyl Promotor kvasinkových genů pGAL 2nORI — transpozice \ \ \ / Ty transcript \ f^j- P/, amplifikační kazeta začleňující se do mnoha míst genomu kvasinky Transkript vloženého ô " (klonovaného) genu URA 3 Struktura vysokokopiového plazmidu používaná pro začlenění modifikovaného Ty elementu nesoucího klonovaný gen do chromozomu kvasinky. pGAL a P jsou kvasinkové promotory, 8 (delta sekvence ) jsou LTR Použití při přípravě vakcín - fuzní plášťový protein obsahující např. antigény z plazmodií (malárie) 10 Table 13.1 Properties of different yeast vectors \/F KTC") R Transformation Copy no./ non-selective Vector frequency cell medium Disadvantages Advantages integrující se trans form 3 nts per ug DNA Much less than 1 % per generation epizomální (ori 2 jx) replikující se (ars) centromérový umělý chromozom transpoziční Iransformanis per ug DNA Ira-nslPrmantS perug DNA transforms nts per ;,g DNA Depends or vector used 10 introduce Ty into cell 1 % per general Much greater man 1% par generation butcangei chromosomal integration L=ss than 1% per generation Depends on length: the longer the YAC the more stable Stable, since integrated 1 Low transformation frequency 2 Can only be recovered from yeast by cutting chromosomal DNA with restriction endonudsase which does, not cleave original vector confining cloned gene Kovet recombinant generated in i/ivo by recombination with enöogenous 2-jim plasmid Instability of Iransformants Low copy number makes recovery from yeas! more difficult than that of YEp or YRp vectors Difficult 10 map by standard techniques Needs to be introduced into cell in another vector 1 Of all vectors, this kind give most stable maintenance of cfoned genes 2 An integrated Yip plasmid behaves as an ordinary genetic marker, e.g. a diploid heterozygous for an integrated plasmid segregates the plasmid in a Mendelian fashion 3 Most useful for surrogate genetics of yeast eg. can be used to introduce deletions, inversions and transpositions (see Bolstein & Davis 1962) 1 Readity recovered from yeast 2 High copy number 3 High transformation frequency 4 Very useful for complementation sludges 1 Readily recovered from yeast 2 High copy number. Note that the copy number is usuaily less than that Of YEp vectors but this may be useful it cloning gene wftCSO product is deleterious to the cell if produced in excess 3 High transformation frequency 4 Very useful for complementation sludges 5 Can integrate into Ihe cfiromosome 1 Low copy number is useful if product of cloned gene is deleterious to cell 2 High transformation frequency 3 Very useful lor complementation studies 4 At meiosis generally shows Mendelian segregation 1 High-capaciry cloning system permitting DNA molecules greater than 40kb to be cloned 2 Can amplify large DNA molecules in a simple genetic background Get amplification following chromosomal integration 11 Selektovatelné markery u kvasinek Gen Enzym Selekce HIS3 Imidazole glycerolphosphate dehydratase histidine LEU2 (3-lsopropylmalate dehydrogenase leucine LYS2 a-Aminoadipate reductase lysine TRP1 N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate isomerase tryptophan U R A3 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase uracil Pozitivní selekce na mediu bez příslušného faktoru G418 - rezistence k geneticinu (KanR) 12 Využití genu LEU2 jako selekčního markeru (a) Kvasinka Ieu2 Kolonie Ieu2' / \. T Chromozomy -bez genu LEU2 (b) Použití LEU2 jako selektivního markeru Médium musí obsahovat leucin LEU2 Transformovat kvasinky Přežívají pouze transformované buňky Vektor - nese správný gen LEU2 Minimální médium - bez leucinu Začleňování epizomálních plazmidů do chromozomu kvasinek YEp13 LEU2 Slouží současně jako selekční marker V leu - Rekombinace Chromozomální DNA kvasinek 14 Výhody dostupnosti různých typů kvasinkových vektorů • Všechny kvasinkové vektory mohou být použity k vytváření částečných diploidů nebo částečných polyploidů, přičemž genové sekvence zavedené do buňky mohou být buď začleněny do chromozomu nebo přetrvávat v extrachromozomálním stavu. • Do klonovaných genů mohou být zaváděny in vitro mutace a pozměněné geny lze pak vrátit do kvasinky a nahradit jimi alely standardního typu. 15 Reportérové geny Gene Protein Size (amino acids) Original source Detection Reference cat Chloramfenikol- 219 E. coli Tn9 Acetylation of (Gorman, Moffat and acetyltransferáza transposon chloroamphenicol using 14C Howard, 1982) acetyl-CoA lacZ ß-galactosidase 1024 E. colt Conversion of colourless ONPG to a yellow product; XGal blue-white screening (Norton and Coffin, 1985) gusA ^-glucuronidase 603 E. coli Conversion of MUG in a fluorometric assay; XGluc blue-white screening (Jefferson et al., 1986) lue Luciferase 550 Photinus pyralis (firefly) Oxidation of luciferin to produce light (deWetef al,, 1987) GFP Green fluorescent protein 238 Aequoria victoria (jellyfish) Emits green fluorescence when exposed to blue or UV light (Chalfie etal, 1994) ONPG - o-nitrophenyl-iS-D-galactopyranoside- XGal - 5-bromo-4-chioro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside. MUG - 4-methylumbelliferyl ^-D-glucuronide. XGluc - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-/S-D-glucuronide. 16 Exprese genů v kvasinkách • Pro účinnou expresi je žádoucí, aby klonované sekvence byly pod kontrolou kvasinkových promotorů - ty mají určitá specifika. Vektory proto mají promotory z kvasinek. • Poločas mRNA (1-100 min) je silně ovlivněn netranslatovanými sekvencemi na 5'a 3'konci - jejich odstranění poločas zvýší • Kvasinky mají jiné využívání kodonů než bakterie nebo vyšší eukaryota. Při chemické syntéze genů je třeba volit kodony, které jsou čteny (96% aminokyselin v kvasinkových proteinech je kódováno jen 25-ti z 61 možných kodonů) • Exkrece proteinů: signální sekvence jsou dlouhé 20-90 aa. Přesná pravidla nejsou známa - u některých proteinů se exkrece nedaří. Sekrece zabrání rozkladu proteinu v cytoplazmě - proteolýze lze zabránit též změnou aa na N-konci (zábrana ubiquitace) 17 Exprese genů v kvasinkách - pokrač. • Glykozylace - dochází ke glykozylaci cizích proteinů, ale struktura a sekvence oligosacharidů připojovaných na proteiny je odlišná než v přirozených hostitelích - to může mít důsledky pro stabilitu, imunogenitu a výslednou lokalizaci v tkáních (např. při terapeutickém používání) • Stabilita proteinů. Rychlá degradace proteinů po jejich syntéze nebo po rozbití buněk a purifikaci endoproteinázami, karboxypeptidázami a aminopeptidázami přítomnými ve vakuolách. Byla zkonstruována řada mutantních kmenů s pozměněnou aktivitou těchto enzymů. • Sestřih. Introny mají obecné rysy (5' GU - AG 3') a další konsenzuální sekvence. U kvasinek je před 3'místem sestřihu sekvence, která chybí u vyšších eukaryot. 18 Struktura kvasinkového promotoru 4 elementy: 1. TC(G/A)A a PuPuPyPuPu jsou u více než poloviny známých kvasinkových promotorů. Tyto sekvence nejsou u vyšších eukaryot, což ukazuje na rozdílný mechanismus jejich transkripčního aparátu. 2. TATA box, oblast 20-120 nukleotidů před místem iniciace. 3. Sekvence umístěné proti směru transkripce podílející se na regulaci genů: A. sekvence aktivující transkripci (UAS) - vazba pozitivního regulačního proteinu na UAS zvyšuje rychlost transkripce, zatímco delece UAS transkripci potlačí. Důležitým strukturním rysem UAS je přítomnost jedné nebo více oblastí s dvojitou symetrií. B. sekvence reprimující transkripci (URS). Vazba negativního regulačního proteinu na URS snižuje rychlost transkripce genů, které jsou regulovány negativně. 4. Sekvence umístěné uvnitř samotného genu, které se označují jako aktivující sekvence umístěné po směru transkripce (downstream activating sequences, DAS). Nízká množství heterologních proteinů odráží nízké množství mRNA jako důsledek nízkého stupně iniciace transkripce. Např. vložení aktivující sekvence umístěné po směru transkripce genu PGK obnovuje rychlost transkripce mRNA. 19 Struktura typického kvasinkového promotoru TC(GA)A PuPuPyPuPu +- I Initiator Nejsou u vyšších eukaryot UAS URS TATA U regulovaných genů 20-400 bp 100-1400 bp Kódující n sekvence mRNA > 40-120 bp DAS Ovlivňuje rychlost iniciace transkripce I Vložení do sekvence cizího genu Příklady konstitutivních kvasinkových promotorů používaných v expresních vektorech ADHI - alkoholdehydrogenáza PGK - fosfoglycerolkináza PH05 - kyselá fosfatáza alfa-faktor (+ signální sekvence pro exkreci) Promotory S. cerevisiae využívané v expresních vektorech Promotor Podmínky pro expresi Tvorba produktu Acid phosphatase {PH05) Phosphate-deficient medium Inducible Alcohol dehydrogenase I (ADHT) 2-5% Glucose Constitutive Alcohol dehydrogenase II (ADHII) 0.1-0.2% Glucose Inducible Cytochrome q (CYCi) Glucose Repressible Gal-l-P Glc-l-P uridyltransferase Galactose Inducible Galactokinase (GAL1) Galactose Inducible Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD, GAPDH) 2-5% Glucose Constitutive Metallothionein (CUP1) 0.03-0.1 mM copper Inducible Phosphoglycerate kinase (PGK) 2-5% Glucose Constitutive Triose phosphate isomerase (TPl) 2-5% Glucose Constitutive UDP galactose epimerase (GAL10) Galactose Inducible 21 Gal systém S. cerevisiae využitý pro expresi genů GAL1 Gall (galaktokináza) přirozený systém Gal4p + galaktóza (induktor) Transkripční aktivátor Gal1 Gen zájmu P*Gan= syntetický promotor obsahující více vazebných míst pro Gal4p konstrukt na vektorech + galaktóza (induktor) Gal4p Gal1 GAL4 22 Exprese genů indukovaná galaktózou A. Gal4p vytvářený z vlastního promotoru B. Gal4p vytvářený z promotoru GaH 0QGal4p GAL4 nízká hladina Gal4p, málo cílového produktu GAL1 vysoká hladina Gal4p, hodně cílového produktu 23 Sekrece proteinů v kvasinkách Hlavní rysy sekretovaných proteinů: • jsou syntetizovány na endoplazmatickém retikulu • z ER jsou transportovány do Golgiho aparátu, kde jsou upraveny a zabaleny do sekrečních váčků • Fúze sekrečních váčků s plazmatickou membránou se děje konstitutivně nebo jako odpověď na externí signál • Nakonec jsou lokalizovány na buněčném povrchu nebo exportovány z buňky Proteiny přirozeně sekretované do růstového media a) párovací feromony (a-faktor, a-faktor) b) killertoxin (proteinový produkt dsRNA n. dsDNA plazmidu n. VLP; molekuly působící toxicky na jiné kmeny kvasinek). • Polypeptidy určené k sekreci mají hydrofobní N-konec, který je odpovědný za translokaci do endoplazmatického retikula. • N-konec je obvykle tvořen 20 aminokyselinami a odštěpen ze zralého proteinu uvnitř endoplazmatického retikula. Bylo dosaženo sekrece řady ne-kvasinkových polypeptidů z rekombinantních plazmidu, ale pravidla pro sekreci nejsou zcela jasná. 24 Problémy při expresi některých proteinů v S. cerevisiae • nízká exprese klonovaných genů, nízký výtěžek proteinu • hyperglykozylace heterologních proteinů • pozměněný transport sekretovaných proteinů (zadržení v periplazmatickém prostoru) • tvorba vysoké koncentrace alkoholu, který usmrcuje buňky a snižuje výtěžek proteinů 25 Cílení proteinů do jádra Jádro kvasinky obsahuje sadu proteinů, které jsou syntetizovány v cytoplazmě. Pro objasnění mechanismu týkajícího se lokalizace proteinů v buňce byly zkonstruovány hybridní geny fúzí kvasinkového Matalfa genu, kódujícího předpokládaný jaderný protein, a genu lacZ z E. coli. Segment genového produktu MATalfa, který byl 13 aminokyselin dlouhý, byl schopen usměrnit (3-galaktozidázovou aktivitu do jádra. To bylo potvrzeno imunofluoroscencí. Podobné sekvence byly zjištěny u jiných proteinů a označeny jako nuclear localization signals (sequences) (NLS) Podle současného modelu pro import jaderných proteinů jsou proteiny obsahující NLS rozpoznány specifickými receptory (nuclear transport receptors) v cytoplazmě. Komplex NLS-receptor se pohybuje k jaderným pórům, které otvírá reakcí vyžadující ATP a dovoluje, aby protein vstoupil do jádra. 26 Klonování kvasinkových genů v buňkách E. coli s využitím komplementace 30 % genů kvasinek se exprimuje v E. coli Získávání nových ř kvasinkových selekčních markerů Genová knihovna kvasinky Přenos do mutantních kmenů E. coli hledaný gen 2i Klonování kvasinkových genů na základě genetické komplementace Xts recipient: kvasinkový kmen nesoucí ts mutaci v genu X a mutaci v genu Ieu2 -roste jen při 30*0 Příp. ztráta nějakého znaku při vyšších teplotách 8 © Leu" Plasmid library Š)./íj Yeast transforniafion Příprava genové knihovny z kvasinkového kmene s genem X(wt) ve vektoru obsahujícím jako selekční marker LEU2 Plate onto medium lacking leucine Incubate at 30°C (permissive temperature] All cells grow Only cells that contain plasmid with wild-type gene X will grow ai37°C izolace klonu X+ Determine DNA sequence of gene X Translate to obtain "^sequence 28 Začleňování genů homologní rekombinací Left half Right half OÍURA3 YFG pUC °* URA3 I_I / Left hall Right half of YFG URA3 pUC ofVFS / / / une cnromosome conrams YFG integrated at URA3 locus YFG = gen zájmu, jehož funkci sledujeme (~>ne chromosome contains U£A3gene intergrated a( YFG 29 Linearizace plazmidu v místě homologie zvyšuje frekvenci začlenění asi 100x Vnášení genů do chromozomu kvasinek pomocí integrativních vektorů Ampr gene orifc Restriction endonuclease I H ~H . r-T~1 Transformation Chromosome Recombination ■{v !—I I—| y-;:../.... y : |—| |-Chromosome Kyvadlový vektor připravený v E. coli GOI = gen zájmu AI, A2 = nesenciální geny 30 Vyprošťovací replikující se vektor Amp" leuZ ARS I 1 k I I Ľ Linearizovaný plazmid se nereplikuje II Xho\ i Xhoí mutovaná alela chromozóm kvasinky Část genu mat je vyštěpena, hraniční sekvence jsou ponechány AmpH plazmid nesoucí MAT* se m02a replikovat v kvasince II ■I transformací* E. cell a vyhledaní plazmidú nesoucích inzert a MAT Homologní rekombinace a cirkularizace plazmidů, jejich izolace a přenos do E. coli, studium mutantní alely MAT' 31 Rekonstrukce plazmidu homologní rekombinací v kvasinkové buňce Vložení nového selekčního markem do plazmidu, překlonování genu zájmu do jiného typu vektoru Plazmid, který se v kvasince nereplikuje společně přeneseny do kvasinky transformací Plazmid, který se v kvasince replikuje | Recombination Selekce klonů na HIS3, případně na UR A3 32 Vytěsnění a záměna plazmidů Piasmid shuffie Studium funkce mutantních a cizích genů Trojnásobný mutant TPK1-, TPK2-, TPK3- ura+, his+, trp+, ade-, leu- Myší cAMP dependentní PK Umožňuje růst na mediu bez adeninu Zajišťuje životaschopnost buňky Selekce buněk obsahujících oba plazmidy - půda bez ade a leu Kultivace buněk za neselektivních podmínek Buňka si musí alespoň jeden z plazmidů s PK podržet Závěr: Gen pro myší proteinkinázu může nahradit gen TPK1- Dvouhybridní systém ke studiu interakce proteinů (a) X 'GÍÍ4J DBD> UASr (b) mmmm UASr DNA binding domain Ěr Activation domain Hybridní protein Gal4p-X se váže na promotor, ale není schopen aktivovat transkripci reportérového genu Hybridní protein Gal4p-Y se není schopen vázat na promotor a tudíž není schopen aktivovat transkripci (c) UASr Interakce hybridních proteinů Gal4p-X::Gal4p-Y aktivuje transkripci 34 Plazmidy určené k vytváření fúzních proteinů s doménami Gal4p (DBD a AD) Selekce plazmidu Vyhledání genů, jejichž produkty interagují SNF1 a SNF4 asociují za vzniku produktu s protein-kinázovou aktivitou Genetický důkaz funkce U2 snRNA U2 snRNA , (a) Wild-type strain (strain A) a |b) Mutant strain (strain B) (c) Mutant strain (strain BJ Cells make their own histidine and grow his4 mRNA spficed Pokus prokazuje, že U2 RNA se při sestřihu páruje přímo s intronem. / Wild-type U2 gene / m A ($4 gene ^ Wild-type U2 gene Mutant ŕt/*s4 c ■iSJáUAGl LA] íOA^ř„ Muíant iniron III I II Wild-type U2 snRNA / Mismatch destabilizes RNA hybrid Plote Medium lacking Cells fail to grow histidine hh4 mRNA not spliced Introduce plosmid into cells by transformation r Plasmid with mutant Ml gene 0" UACAAľO-, ' Mufont inlron I I II l_l _ I__ Mutant strain con now make histidine hh4 mRNA spliced C?I Studium funkce genu po jeho inaktivovaci selekčním markerem pučné YFG = your favourable gene \JRA3 gene Disrupted gsne replaces wild-iype^ans in pni thracriDsome UHAS / YFG Other tkramůsoíň* iioriTirj Hüte onto mediím lacki[»g YFG = gen zájmu, jehož funkci sledujeme, inaktivovaný genem URA3 Speculate Buňky obsahují jednu funkční a jednu nefunkční alelu YFG Dissect tet rods Cíiaŕadanse haploid edit 38 Tetrádová analýza: sporulací dochází k separaci mutantní a standardní alely Spory se nechají klíčit a růst, aby se vytvořily kolonie. Ze čtyř spor dvě ponesou alely standardního typu (YFG) a dvě budou mít alelu YFG přerušenou integrovaným genem URA3. Pokud je knokautovaný gen esenciální pro růst, vyrostou ze čtyř spor z každé tetrády do kolonií jen dvě, a žádná z nich nebude schopna růst na plotnách 39 bez uracilu (protože gen URA3 je pouze v knokautované alele). Rekombinantní proteiny vytvářené v expresních systémech S. cereviasiae VACCINES Hepatitis B virus surface antigen Malaria circumsporozoite protein HIV-1 envelope protein DIAGNOSTICS Hepatitis C virus protein HIV-1 antigens HUMAN THERAPEUTIC AGENTS Epidermal growth factor Insulin Insulin-1 ike growth factor Platelet-derived growth factor Proinsulin Fibroblast growth factor Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor a-\ antitrypsin Blood coagulation factor XHIa Hirudin Human growth factor Human serum albumin 40 Kvasinka Pichia pastoris Má schopnost metabolizovat metanol jako jediný zdroj uhlíku a energie Metabolismus metylotrofů umožňuje vytvářet „single-cell" proteiny - krmivo pro dobytek bohaté na proteiny Heterologní exprese proteinů v metylotrofní kvasince - Pich i a pastoris Další druhy: Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha 1. Jednoduché techniky pro genetickou manipulaci u Pichia, podobné jako u S. cerevisiae. 2. Kultivace za definovaných podmínek včetně velkokapacitní kultivace 3. Schopnost tvořit proteiny ve velkém množství, buď intra- nebo extracelulárně (samy tvoří jen málo vlastních exkretovaných proteinů) 4. Schopnost provádět eukaryotické posttranslační modifikace (glykozylace, tvorba disulfidických můstků a proteolytický procesing). 5. Dostupnost tohoto systému pro komerční účely. 42 Vektory pro expresi v Pichia a) jsou kyvadlové (+ E. coli) b) mají markery pro E. coli a pro kvasinky (ura, his, ade atd) c) mají expresní kazetu odvozenou z genu AOX 5'-promotorové sekvence terminátor transkripce mezi promotorem a terminátorem je MCS d) u sekrečních vektorů jsou signály z kyselé fosfatázy (PHO) nebo alfa-MAT (pro transport jsou někdy využívány chaperony) Hostitelské kmeny: nesou auxotrofní mutace pro selekci vektorů jsou proteáza deficientní Expresní vektory jsou často inzertovány do chromozomu Vektory s vícenásobnou kopií cizorodého genu a) kopie genu uspořádány „hlava k patě" b) vektor obsahující gen kanR - amplifikace pomocí G418 43 Metabolizmus metanolu Metanol \ induktor Alkoholoxidáza AOX1 a AOX2 ▼ _ Formaldehyd + peroxid H dehydrogenázy Buněčné komponenty Formát + C02 energie Po indukci metanolem je 5 % transkriptů tvořeno genem pro alkoholoxidázu, která dosahuje až 30 % všech proteinů v buňce. Exprese klonovaných genů se zvýší až 1000x. V přítomnosti jiných substrátů (glukóza, glycerol, etanol) je hlad AOX nízká - promotor je přísně regulován (nepropouští) Expresní vektor P. pastoris gen Geny jsou klonovány za silný metanolem indukovatelný promotor genu alkoholoxidázy (AOX1) vložený do expresních vektorů. Syntéza proteinu je spouštěna přidáním metanolu do média, které neobsahuje jiný zdroj uhlíku - metanol tak tvoří jediný zdroj uhlíku 45 Konstrukce vektorů s kopiemi expresní kazety Inserce fragmentu BglII-BamHI do místa BamHI vektoru pA0816 EcMI (EijtiH BS5I I!) Další selekční marker: rezistence ke kanamycinu (geneticinu) - selekce buněk se zvýšenou rezistencí = spontánní amplifikace kazety, vyšší výtěžky produktu 46 Začlenění genu klonovaného v integračním vektoru do specifického místa chromozomu P. pastoris Integrační vektor 1 xCO GOI = gene of interest romosome 5' AOX1 GOI TT HIS4 2xCO 5' AOX1 GOI TT ■ ■ HIS4 Reštrikční fragment vyčleněný z vektoru ■ Chromosome 5' AOX1 AOX1 3' AOX1 5' AOX1 GOI TT HIS4 3' AOX1 ■ Chromosome 47 Heterologní exprese genů v P. pastor is Selection of host strain: • wild types • protease-deficient strains • auxotrophic strains ■ glyco-engineered strains _Sural A H Swal \1 / Expression cassette Genomic integration: • single-Zmulticopy ■ homologous recombination • ectopic integration Promoter: • constitutive ■ inducible Selectable marker: ■ drug resistance • auxotrophy_ Intracellular protein expression m W V Secretory pathway: ■ secretion signals: S.C. a-MF, P.p. PH01 • proteolytic processing, e.g.: Kex2p, Ste13p • glycosylation: N- orO-linked • membrane-associated proteins • surface display anchors 5'HR, 3'HR- úseky homologie s chromozomem pro začlenění kazety 48 Table 3: Heterologous proteins expressed in P. pastoris Protein Bacteria Bacillus lickeniformis a-amylase Bacillus siearoihermophilus o-alanine carboxypepiidase Bordetella pertussis pertussis pertactin (P69) Clostridium botulinum neurotoxin (BoNT) serotype A and B Clostridium botulinum neurotoxin heavy chain fragment, serotype B Clostridium botulinum neurotoxin serotype A binding domain Clostridium tetani tetanus toxin fragment C Escherichia coli acid phosphatase/phytase (appA2) Escherichia coli 0-galactosidase Escherichia coli ß-lactamase Leishmania major cathepsin B-like protease Staphylococcus aureus staphyiokinase Streptococcus equislmilis streptokinase Streptomyces subtilisin inhibitor Streptotnyces rtrtdosporus T7A peroxidase, endoglucanase Toxoplasma gondii SAG1 antigen Vibrio cholerae accessory cholera enterotoxin (Acc) Fungi Alternaria Ait I allergen Aspergillus awamori glucoamylase Aspergillus awamori glucoamylase catalytic domain Aspergillus fumigaius catalase L Aspergillusfumigaius dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) Aspergillus fumigaius dipeptidyl peptidase V (DPP V) Aspergillus giganieus et-$arcin ribotoxin Aspergillus niger phyiase (phyA) Candida guillienuondii xylose reductase gene (xyll) Candida rugosa lipase x (CRL) Fusarium sokmi pectate lyase (pelC) Fusarium solum pectate lyase CpelD) Geotrichum candidum lipase isoenzymes i ■ Phytopluhora cryptogea ß-cryptogein Rfuzoptis oryzae lipase Sacchatomyces cerevisiae invert ase Saccharomyces cerevisiae Ktrlp Soccharamyces cerevisiae (a-].2-mannosyltransferase) Schizophyllum commune vitamin B2-aldehyde-forming enzyme Trametes verskofor (white rot fungus) laccase (led) Trichoderma harzianum ß-(l-6)-glucanase Comments: mode, amount, signal sequence 2.5 g P'. SUC2 100 mg l-1, nauve 3 s I-' 78 mg r1 390 us g~' 2.4 mg total 12 gl"1. 28.9 U mg"1 2.0X 10J U mg-1 a-MF SO mg [-', a-MF 77. mg r1. ■ . 2.47 g total protein, a-MF 12 mg I"1', a-MF 7 mg I"1, a-MF a-MF. 400 mg I"', native 400 mg I"', PKOl 2.3 g I"1. PHOI PHOl 0.15 mg I"'. PHOl i mg-1-', synthetic native, PHOl 65 U ml-1, a-MF 0.65 U mg-1; S, 0.1S U mg"', a-MF 150 U ml-1. a-MF 1 mg P1. PHOl native 60 mg l"1 15 mg T1 60 mg H 2.5 a-MF PHOl , a-MF native 400 mg r1; PHOl 40 mg I"1, PHOl 120 mg r1, a-MF native and a-MF 9.3 mg r1 Reference [51,601 [61] [62] [631 [641 [651 (661 [67] m [201 [681 [69] (70] [711 P21 P3J [741 [75] [76] [47]- (77) (781 (791 [43] [801 (SI) (42] [32] [83] (841 [85] (86] [301 [»7] [87] [88] [891 [90] I = intracelulärni, S = sekretovany 49 Table 3: Heterologous proteins expressed in P. pastoris Protein Comments: mode, amount, Reference jquence Protists ..... Chotutrus crispus red alga hexose oxidase I [911 Grctcilariopsls lemaneiformis red alga a-l,4-glucan lyase (GLql) I [92| Plasmodium falciparum merozoite surface protein I (MSP-I) S, 24 rag r , o-MF [93) Plasmodium vivttx apical membrane antigen [ (AMA-1) S, 50 mg I"' , PHOl [94] Retiadomyxa Jilosa (giant freshwater ameba) a2, [52 tubuliq isoforms I, 400 ug g~ [95] Trypanosoma cms! acid a-mannosidase S, 11.5 lis I" \ native (96] Plants AiRum sativum (garlic) alliin lyase J, 2.167 Us -l [97] Arabirtopsis '.haliana r4ADH:nitrate reductase I. 18 ug S~' [98,99] Barley (Nordcuin vatgare) sucrose fruclan 6-fruclosyl transferase S, ct-MF [1001 Barley ct-amylasc 1 S, 50 mg r1 , native [48] Barley tx-amylase 2 S. 1 mg r1. native [4SI Barley aleuronc tissue a-glucosidase S, ct-MF [101] Coffee bean a-galactosidase S. 400 mg 1" a-MF [102] Cyaura cariiuttculus (cacdoon) cyprosin S, 1 mg r", native [103] Cynodon dactylon (Bermuda crass) Cyn d 1 S, 1.5 g I-', PHOl [104.105] Golvitllitts nivalis agglutinin S.'PKA-E [45] Hevea brvsillinsts hydroxynitrile lyase I, 22 11"' [106] Hevea brasifitnsis Hev b 7 palatin-Jike allergen s, io mg r . a-MF [107,108] Maize cylokinin oxidase S, native [109) Oat photochrome A, phA !, 30 |lg g_1 [110.111) Oat phylochrome A. phyA6S apoprotein I, 20 ug g"1 [112] I = intracelulärni, S = sekretovany