Definice genového inženýrství Genové inženýrství se zabývá vytvářením pozměněných či nových genů nebo přípravou nových („nepřirozených") kombinací genů a jejich zaváděním do genomu organizmů s cílem rekonstruovat jejich genetickou výbavu a vytvářet tak geneticky modifikované anebo transgenní organismy. Metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro (klonování genů a jejich úpravy) a cílené změny genetické informace prováděné in vivo Aplikace Gl: moderní (molekulární) biotechnologie i Genové inženýrství (sylabus přednášky 2018) 1. Osnova přednášky, definice genového inženýrství a jeho stručná historie, studijní literatura. Mutageneze in vitro (metody založené na restrikčních místech, metody založené na mutagenních oligonukleotidech, kazetová mutageneze, využití modifikovaných tRNA) 2. Optimalizace exprese klonovaných genů (faktory ovlivňující expresi genů v cizích hostitelích; úroveň transkripce, translace, export proteinů) 3. Klonování genů v grampozitivních bakteriích 4. Klonování genů v kvasinkách 5. Klonování genů v rostlinách, příprava transgenních rostlin 6. Klonování genů v živočišných buňkách, vektory pro přenos genů do savčích buněk, selekční markery pro vyhledání klonů obsahujících cizorodou DNA 7. Vnášení genů do zárodečných buněk myší, příprava transgenních savců 8. Cílená exprese cizorodých genů v buňkách a tkáních vyšších organismů 9. Opravy dědičných defektů u zvířat metodami genového inženýrství 10. Editace genomů in vivo, meganukleázy, systémy CRISPR/Cas 11. Příprava farmakologicky významných látek v prokaryotických a eukaryotických organismech. Využití metod rekombinantní DNA k přípravě vakcín a protilátek. Identifikace produktů rekombinatních genů. 12. Pravidla pro práci s geneticky modifikovanými organismy, novelizovaný zákon 78/2004 Sb., rizika přípravy GMO. Povinné školení pro studenty. 2 Doporučená literatura Watson J.D. et al., Recombinant DNA, 2nd ed., W.H.Freeman, New York 1992. Old R.W., Primrose S.B., Principles of gene manipulation. An introduction to genetic engineering. Blackwell Science, 1995. 5. vydání. Strachan T., Read A.P. Human Molecular Genetics, 3. Vydání. Garland Science, London 2004. Glick B.R., Pasternak J.J. Molecular Biotechnology, 3. vydání, ASM Press, Washington 2003. Reece R. Analysis of Genes and Genomes. Wiley 2004 Primrose S.B.,Twyman R.M. Principles of gene manipulation and genomics. Blackwell Publ., 2006, 7. vydání. Snustad D.P., Simmons M.J.: Genetika (překlad originálu Principles of Genetics), MU Brno, 2009, 2017 Kun, L.Y.: Microbial biotechnology, principles and applications. 3rd Edition,World Scientific, Singapore, 2013. Základní metody: Šmarda J. a kol.: Metody molekulární biologie, Brno, 2005. Internetové zdroje, přehledové články IS muni.cz 3 Využití genového inženýrství Ve výzkumu: studium struktury, funkce a exprese genů (genomů) V praxi (Moderní biotechnologie): 1. Příprava látek významných v lékařství, zemědělství a průmyslu • vnášení cizorodých genů do nepříbuzných organizmů a získávání produktů ve velkém množství - překonání reprodukčních barier 2. Příprava látek s novými vlastnostmi pozměňováním stávajících genů nebo vytvářením nových genů - enzymy, protilátky, vakcíny aj. 3. Pozměňování a zlepšování vlastností organizmů - vytváření geneticky modifikovaných n. transgenních organismů (GMO) • příprava mikroorganizmů pro biotechnologie, • zvyšování výnosů kulturních rostlin a užitkovosti hosp. zvířat (odolnost vůči chorobám, škůdcům nebo zevním vlivům, produkce cizích látek v tělech rostlin a zvířat) • genové terapie 4 Předpoklady pro cílené genetické manipulace • Identifikovat geny a stanovit jejich funkce • Izolovat geny a cíleně je in vitro (in vivo) pozměňovat • Přenést vhodným způsobem upravené geny do původních nebo jiných (nepříbuzných) organismů a zajistit jejich expresi (heterologní expresní systémy) 5 Etapy vzniku a vývoje genového inženýrství Poznání základních procesů přenosu genetické informace 1970 - izolace prvního restrikčního enzymu 1972 - příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro 1973 - začátek klonování genů 1975 - Asilomarská konference, moratorium NIH (1976) 1976 - první pravidla práce s rekombinantní DNA 1977 - první rekombinované molekuly DNA nesoucí savčí geny 1977 - zavedení metod sekvenování DNA 1978 - příprava lidského inzulínu v bakteriích (od r. 1982 vyráběn komerčně), založení fy Genentech zavedení technik mutageneze in vitro - proteinové inženýrství příprava transgenních organismů (bakterie, kvasinky,rostliny, živočichové) 1980 - první pokusy o genovou terapii 1997 - klonování živočichů -2000: zavedení technik editace genomů 6 Mutageneze in vitro site-directed mutagenesis místně cílená (řízená) mutageneze lokalizovaná mutageneza, řízená evoluce reverzní genetika*, genetika „naruby" klasická genetika DNA (genotyp) =^ fenotyp reverzní genetika * Reverzní genetika - „vypínání genů" navozování nulových mutací genů nebo potlačování jejich exprese (knokauty genů, transpozonová inzertní mutageneze, knockdown - umlčování genů pomocí anti-sense RNA, RNAi, CRISPR/Cas aj). 7 Princip mutageneze in vitro Mutace se vnášejí do vyizolované DNA (= in vitro) Typy mutací: substituce, delece, inzerce Cíle: Výzkum: • Analýza vztahu mezi strukturou a funkcí NK • Objasnění funkce genů a regulačních oblastí Praxe: • Cílené změny aminokyselin v proteinech - příprava proteinů s novými (lepšími) vlastnostmi (proteinové inženýrství) • Příprava geneticky modifikovaných a transgenních organismů 8 Nevýhody klasické mutageneze (chemické, fyzikálni, biologické mutageneze) 1. V organizmu může být zmutován kterýkoliv gen - necílené působení mutagenu; mutaci nelze cílit na konkrétní sekvenci 2. Frekvence mutací v žádaném genu může být nízká - závislost na charakteru působení mutagenu a konkrétní sekvenci 3. Žádaný fenotyp může být výsledkem mutací v různých genech - řada znaků je výsledkem působení více genů Mutageneze in vitro - prístupy Mutageneze in vitro náhodná manipulace s restrikčními místy inzerce linkerů chemická mutageneze in korporace chybných bazí vyhledání genu nebo funkčních oblastí na DNA I ■=■ mutace lil GEN + cílená (zavedení mutace do konkrétního místa) oligonukleotidová mutageneze syntéza genů (kazetová mutageneze) záměny bazí nebo delších sekvencí, změny kodonů, cílené změny struktury a funkce proteinů 10 Obecná strategie při mutagenezi in vitro Alternativa ke klonování genů ve vektorech = PCR AmpR DNA oí inferest - Plasmid DNA In vitro mutagenesis Mutcifion Přenos do E. coli, selekce kolonií AmpR Grow colony Isolate plasmtd DNA A mutant plasmid Skríning nebo selekce a testování funkce 1. Klonování genu (sekvence DNA) určeného k mutagenezi 2. Vlastní proces mutageneze in vitro 3. Selekce klonů obsahujících mutované geny (sekvence) 4. Stanovení pozměněné funkce mutovaných genů 5. Ověření charakteru vnesené mutace (stanovení sekvence) Stanovení sekvence pozměněného genu Test for Function using genetic screen or selection 11 Způsoby používané při mutagenezi in vitro 1. Manipulace s restrikčními místy a enzymatické úpravy DNA 2. Oligonukleotidová mutageneze (extenze primeru) 3. Chemická mutageneze 4. Kazetová mutageneze 5. Metody založené na PCR 6. Mutageneze pomocí supresorových tRNA Vytváření mutací v restrikčním místě Štěpení EcoRI S1 nukleáza Exonukleáza Exolll -rozsáhlejší delece i DNA ligáza DNA polymeráza + dNTP í Výběrem konkrétních dNTP lze dosáhnout inzerce pouze určitých bází Delece 4 bp Inzerce 4 bp +dGTP,+dATP,-dCTP, -dTTP ACTCAATCTGA 13 TGAGTTAGA Inzerční mutageneze pomocí linkerů k vyhledání funkčních oblastí transpozonu Soubor náhodně linearizovaných molekul Vložený linker inaktivuje různé geny Transposon AmpR DNase I Mn2+ tons > štěpení rekombinantní DNA na různých místech Introduce into E. coli Test for transposition Připojení EcoRI-linkeru (= vložení inzerce inaktivující zasažený gen) Selekce klonů se ztrátou transpoziční aktivity, např. vyhledání genu pro transponázu (nebo oblasti transpozonu, která je pro transpozici nezbytná) 14 Chemická mutageneze bisulfitem (hydrogensiŕičitan sodný) HírdlN Príprava ssDNA Plazmidová dsDNA Síngle-sfrflnded ONA NH, Urodí O Bísulfile rť c — U T 1 1 1 G A A GC AT Urodí Připojení primeru Proti U je začleněn A Odstranění poškozeného vektoru Vložení inzertů do nového vektoru Knihovna klonů obsahujících mutované inzerty Působení bisulfitem Mixřure qF rTV-dlis-r! DNA polymeráza, dNTP, replikace Vyštěpení mutovaných inzertů (HindlII-EcoRI) 15 Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů 1. Klonování sekvence (genu) do vhodného vektoru (M13, fágemid, fasmid), izolace jednořetězcové formy rekombinantní DNA 2. Příprava syntetického (mutagenního) oligonukleotidů nesoucího žádanou mutaci (jeho sekvence je komplementární ke klonované sekvenci vyjma místa, do něhož má být mutace vnesena) 3. Připojení (přihybridizování) mutagenního oligonukleotidů in vitro 4. Dosyntetizování komplementárního řetězce DNA-polymerázou, spojení DNA-ligázou 5. Transformace buněk E. coli heteroduplexní molekulou DNA, selekce mutantních molekul (příp. selekce in vitro a transformace mutantními molekulami DNA) 6. Pomnožení mutantní molekuly DNA v E. coli, ověření mutace stanovením sekvence DNA 16 Klonování genů ve fágemidech Klonovací vektor (např. Bluescript) DNA insert Recombinant M13 vector (double-stranded DNA) plazmid Transfect E. coli Protein coat DNA core O Recombinant M13 phage Single-stranded DNA Phage are released Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů syntéza druhého řetězce DNA-polymerázou selekce klonů s mutací rekombinantní dsDNA (fragment DNA klonovaný ve vektoru) O O příprava jednořetězcové formy rekombinantní molekuly DNA (rekombinantní ssDNA) mutagenní oligonukleotid obsahující mutaci hybridizační připojení mutagenního oligonukleotidů přenos do buněk E.coli a jejich replikace rodičovský fenotyp stanovení fenotypového projevu mutace Substituce delece inzerce 18 Zvýšení výnosu mutant začlenením uracilu do templátové DNA Přenos do kmene E. coli ung-, dut příprava ssDNA In vitro Přenos do E. coli ung+, selekce AmpR Většina kolonií obsahuje mutantní plazmid Řetězec s mutací (bez U) se replikuje DNA klonovaná do M13 vektoru ung- (uracil-N-glykozidáza-) (rep-) duí- (dUTPáza-) - zvýšení koncentrace U V templátové DNA je začleněn U Připojení mutagenního oligonukleotidu Replikace, ligace Řetězec standardního typu (templátový, mateřský) obsahující U je degradován Ověření mutace stanovením sekvence DNA žádaná mutace 20 Vyhledání mutantních klonů pomocí sondy -tou je značený mutagenní oligonukleotid Nitrocellulose X-ray film Mixture of colonies containing mutant and wild-type plasmids Denafure DNA Neutra lize 32 p , Wash' at higher temperature Radioactive mutagenic oligonucleotide Labeled probe hybridizes at room ' . ■ - temperature to both mutant and wild-type DNA Probe remains bound to mutant DNA Probe dissociates from wild-iype DNA Isolate mutant DNA from colony sonda 21 Master plate Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů ampr pBR322 Afl III G Bglll DNA - Polymeráza DNA - Ligáza ampr Afl III tetr Netransformuje 2. selekce pomocí RE; cílová sekvence = GEN TETR 1 Afl NNACPuPyGTNN Bgl II NNAGATCTNN Připojení dvou primerů 1. Mutantní deleční oligonukleotid 2. Selekční oligonukleotid Bgl II I ampr Bglll ampr Deletovaný plazmid Bglll Transformace E. coli tets Izolace DNA i i Štěpení selekční RE Afl III tets Transformace výsev na AM P vyhledání klonů TETS Komerční soupravy pro snadné vytváření mutací a selekci Metylovaná rodičovská DNA f"% Methyl at ion 1'■■ W ; •:>." Plasmid = i Mutagenní oligonukleotidy V\ JJ } Mutagenesis In vitro recombination reaction Transformation } } Plasmid template PCR Reagents Methyl Transferase fleagents 1. PCR sample 10X Enzyme Mix Reactior buffer Add 1 [jl_ n.S M EDTA to stop the reaction Use 2 uL of recombination reaction sample for transformation Incubate on ice for 15 minutes Heat shock for 30 seconds Add250ui_SOC Recover for 1 hourat37x Methylate plasmid DNA ard amplify the pasmid in a mutagenesis reaction with two overlapping primers containing the taryet [nutation Perform the in vitro recombination reaction, which enhances the colony output 3- to 10-fold Transfo'm the sample into □H5tt™-T1f' competent E. coti. The host eel! circularizes the linear mutated DMA, and McBC en do nuclease in the host cell digests the methylated template DMA, leaving only unmet hylated, mutated product Princip: rodičovská DNA standardního typu je metylována a je štěpena McrBC, zachován je jen mutantní nemetylovaný produkt 23 Modifikace subtilizinu se změněným požadavkem na kofaktory (postupná mutagenze pomocí mutagenních oligonukleotidů) nativní subtilizin vyžadující Ca Vysoká enzymová aktivita Ztráta aktivity po deleci domény vázající Ca Mutantní varianty s nízkou aktivitou Kombinace mutantních variant: vysoká aktivita i bez navázaného Ca Vlastnosti přirozeného lysozymu (wt) a šesti jeho modifikovaných variant připravených oligonukleotidovou mutagezí Enzyme Amino acid at position: No. of -S-S- /o 3 9 21 54 97 142 164 Activity (°C) wt Tle lie Thr Cys Cys Thr Leu 1 100 41.9 pwt lie He Thr Thr Ala Thr Leu 0 100 41.9 A Cys lie Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46,7 B lie Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3 C Tle lie Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52,9 D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6 E lie Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9 F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 0 65.5 25 Kazetová mutageneze Hindi II EcoRI Cleave with Hmdlll and EcoRI Remove srna fragment Two synthetic oligonucleotides. Syntéza genů postupným spojováním kratších oligonukleotidů DNA sequence or amino acid sequence Complementary * synikelie oligonucleotides Heat ot 90° C Slowly cool to room temperature Intermediates DNA ligase Isolate double-stranded DNA molecule Transcriptional terminator fcoRI SomHI Unique restriction sites for cassette mutagenesis Express recombinant protein in £ coli Mutageneze pomocí kazet tvořených mutantními „doped" oligonukleotidy - vytváření náhodných sekvencí DNA synthesizer A g c t bottle bottle bottle bottle / \ / \ f> \ S \ A A _g g c c • A A r g g • cc A t t AtA CAc tCt A A» .A AT m S£s» h!3 „kontaminované" zásobní roztoky nukleotidů Wild-type sequence GGTTACAAÄC7 Mutant oligonucleotides ,gg|t ACAAACT 'g|tTACAAACT 'gg|t a Ha A A C t g g t tacaaact ~gg t t a ca|& c t\ Wild-type ^g g t iacaaa|t /oligonucleotide: Ligate Transform E. coli Skríning např. fágovým displayem r Wild-type plasmids and mutants with multiple substitutions Prepare plasmid DNA from each colony 546 klonů 224 wt 218 - lx subst. 104 - vice subst. Plasmids containing a single nucleotide change Test for function Mutageneze pomocí „doped" oligonukleotidů Oligonukleotid obsahující inosin pro zajištění párování s náhodnými nukleotidy/kodony kodony pro různé aminokyseliny Oligonukleotid obsahující dva náhodné kodony Arg Glu lie CGA GAA ATC -► CTT TAG *** Glu Met *** Glu Ala Val Ser Met NNg GAG ATG NNg GAA GCG GTT AGC ATG •4- III CTC TAC III CTT CGC CAA TC Kazeta s dvěma náhodnými kodony AGCT GTAC Xhol Sphl N = kterýkoliv ze 4 nukleotidů NTG/C = hydrofóbní aminokyseliny (fenylalanin, izoleucin, leucin, methionin a valin) Alternativní způsob nasyntetizování druhého nukleotidu PCR 29 Záměna helixu v represorovém proteinu mutagenezou in vitro (příklad kazetové mutageneze) 43d E expression vector (o) Transcriptional termínolor Transform F. coíi 434 repressor P22 repressor Záměna aminokyselin v doméně represoru zodpovědné za rozpoznání operátoru P22 P22 operator DNA 30 Výhody PCR • jednoduché provedení • možnost vytváření různého typu mutací • není nutná následná selekce pro zvýšení proporce mutant • nezávislost na RE místech • není vždy nutné následné klonování mutovaného genu do vektoru (po PCR je možný přenos amplikonu do buněk transformací) 31 Využití PCR k vytváření mutací in vitro 5' 3' r -X- 3' 5' Místo, do něhož má být vnesena mutace Reakce Primer 2 5' 3' Reakce 2 5' 3' 3' 5' 5' 3' Primer 4 3'— 5' Primer PCR 5' — 3'- »1 Vznik dvou PCR-produktů nesoucích mutaci 5-^3-Primer 3 3' 5' I PCR Primery 2 a 3 = mutagenní primery 3' ^5' 5' 3' 5' Nemůže dojít k prodloužení od 5'konců 5'- klonování 5' 3'' 3' + ^3' Smíchání, denaturace a rehybridizace 3' tzv. neproduktivní spojení 5' produktivní spojení Prodloužení DNA-polymerázou a PCR-amplifikace pomocí primerů 1 a 4 3' 5' 32 Vnášení mutací pomocí PCR mutagenesist ; rr.'jtation Vložená sekvence (extenze primeru na jeho 5'konci) (extenze jsou vzájemně komplementární) PCR #1y changes substituce d insertions PCR -2 the nsertion can be / ;v larger than the overlap ý 0V9r|ap extension^ CD product AD with insertion 5' end of 'c matches here a v t PCR #1^ deletions m \ Y overlap extension V inner segment deleted Deletovaná sekvence (extenze jsou komplementární k sekvenci vedle místa delece) Amplifikace „produktivních" spojení pomocí primerů a a d 33 PCR-mutageneze pomocí megaprimeru Mutagenic primer -3' -5' First PCR First PCR product (megaprimcr) Limited amount of first flanking primer Add second flanking primer -5' Second PCR Megapri mer Restriction digestion and ligation Ý Mutant clone Second PCR product (mutated DNA) Obecně: The strategies require two rounds of PCR amplification using two flanking primers and one internal mutagenic primer. In the first round of PCR, one of the flanking primers and the internal mutagenic primer (having desired base substitutions) are used to generate a megaprimer. The megaprimer is purified by gel electrophoresis and extraction before being used along with the other flanking primer in the second round of PCR to generate the complete DNA sequence with the desired mutation. Nová modifikace: The first PCR (5 cycles) contains a limiting concentration of the first flanking primer and is followed by a prolonged extension step. The second flanking primer is then added and the entire mutated template is amplified by PCR (25 cycles). The second PCR product is digested with appropriate restriction endonucleases to give desired mutated fragment, which then can be ligated to the expression vector. Vytváření mutací in vitro přímo na plazmidech (QuickChange) E. coli dam+ Smíchání plazmidu s primery nesoucími mutaci, syntéza komplementárních řetězců 1 Přenos do E. coli jako templát je využita dsDNA plazmidu po proběhnutí PCR se vytvoří dva komplementární řetězce nesoucí mutaci ve stejném místě, které jsou schopny se párovat za vzniku kružnice s posunutými zlomy po proběhnutí PCR jsou produkty štěpeny Dpnl, která je schopná štěpit jen metylovanou DNA rodičovské molekuly DNA jsou metylovány, neboť plazmidy byly izolovány z dam+ kmenů E. coli - proto jsou Dpnl rozštěpeny (odstranění rodičovského templátu bez mutace). nově syntetizované molekuly nejsou metylovány a tudíž nejsou štěpeny po transformaci do E. coli dojde k reparaci zlomů a nově nasyntetizované plazmidy obsahující mutaci se replikují Náhrada části genu sekvencí z příbuzného genu Gen A analogie mutagenního oligonukleotidu Sekvence genu A — Denature and hybridize sticky feeť extenze Gen B Single-strand vector Polymerase plus ligase + original vector Část genu B je nahrazena částí genu A TJD" Konstrukce genu pro chimérickou protilátku Light chain Y2b heavy chain CH2 domain YiCH2 domain Expression vector for Y1 heavy chain stranded DNA Does not activate -4 complement Gene for heavy chain (y2b isotype) Sticky foot- Polymerase chain reaction ^ PCR 4 400 bp „ Primers J Of) Make uracil- ii containing single- Activates complement Antibody with chimeric heavy chain II c< __I mar Heat to denature strands Coexpress in mammalian cells with light chain Těžký řetězec typu y2b zodpovídá za lyži buněk závislou na komplementu Protilátka s těžkým řetězcem y1 tuto lyži nenavozuje. Která oblast y2b za tuto vlastnost zodpovídá? Doména CH2 y2b 1 Transform ung+ E. coli Isolate mutant DNA Doména CH2 odpovídá za aktivaci komplementu pro lyzu buněk Chimérický těžký řetězec 37 Vytváření náhodných mutací - „error-prone" PCR % —% • využívají se DNA-polymerázy ^ , t bez korektorské funkce 5; ~5 - 3; (např. Taq-polymeráza) - ne High &—3' Fidelity PCR Enzymes i Error prone 4 PCR reakční podmínky PCR lze změnit I S I tak, aby se počet chyb zvýšil a aby 5; x 3; každý amplifikační produkt 3 ~~ 5 obsahoval jednu mutaci 3'-5' (např. zvýšení Mg++ nebo přidání 5; g 3; Mn++, koncentrace reakčních 3 _ _ 5 složek atp) 5; it 3; ^' r 5 • nevýhoda: převaha určitého typu 3' * 5' mutace (např. transice, zatímco 5'-*-*-37 transverze nevznikají) 3'-k-*-5' 38 Způsoby zavádění změn do proteinů Stand rad ní typ proteinu Náhodná mutageneze nebo error-prone PCR Výsledek (např): - vyšší aktivita - termostabilita Kombinace oblastí/úseků (tzv. DNA-shuffling) pocházejících z genů genových rodin (interferon) Vytváření hybridních genů kombinací restrikčních fragmentů Start \ \ ^ Stop codon codon \ U I I I I I I J M 14 odlišných hybridních genů vytvořených kombinací restrikčních fragmentů pocházejících ze dvou genů téže genové rodiny Vytváření hybridních DNA kombinací úseků tří genů z jedné genové rodiny - tzv. „molecular breeding" Native genes i Hybrid genes Inzerce abnormálních aminokyselin do proteinu supresí amber mutace in vitro s využitím chemicky modifikovaných tRNA Mutagenesis -> Vytvoření amber kodonu AGC TAG (amber) Transkripce in vitro Translace in vitro Supresorová tRNA s navázanou chemicky modifikovanou aminokyselinou Mutantní forma proteinu (lysozym aktivovaný světlem) 42 Table 4.4 Nonsense Suppressors Employed to Generate Altered Proteins Suppressor A. přirozené Sul (supD) Su2 [supE) SU2-S9 isupE) Su3 (supF) Su5 isupG) Su6 isupP) Su9 Codons recognized Amino acid inserted Efficiency (%) References UAG UAG UAG UAG UAA UAG UAG UGA B. Uměle připravené tRNA cl'a tRNA c'im tRNAcuA tRNASi?AH tRNA Lys CL'A tRNA q!(íA tRNAcuA FTORI 26 UAG UAG UAG UAG UAG UAG UAG UAG UAG Serine Glutamine Glutamine Tyrosine Lysine Leucine Tryptophan Phenylalanine S5% Glutamic acid 15% Glutamine Cysteine Histidine Proline Lysine Alanine Glycine Arginine 6-54 0.8-20 32-60 11-100 0.2-2 6-30* 30-100 0.1-30 48-100 8- 100 17-51 16-100 9- 60 9-29 S-S3 39-67 4-28 4-47* a, b a, b c, h a, b a, b, h h a, e a,f g hi S h, i h,i h, i h,i h,i Příklad: 160 variant genu pro lysozym s amber mutacemi na různých místech poskytlo v supresorových kmenech 2 000 variant lysozymu Vytváření proteinů obsahujících nestandardní aminokyselinu O-metyl-L-tyrozin v geneticky upravených kmenech E. coli ATG TAC TAC AAG TTC TAA ATT Oligonucleotide-directed mutagenesis Translation in wild-type E. coli Truncated protein ATC ATT Transcription AUG U AG UAA Translation in modified £. coli Wild-type gene ATG TAA Mutant gene Mutant mRNA Amino acid analogue Full-length protein Kmen E. coli obsahuje 2 geny z Methanococcus jannaschii: 1. Supresorovou tRNA, která se váže na amber kodon 2. Mutantní tyrozin-tRNA-syntetázu, která na tRNA váže místo tyrozinu O-metyl-L-tyrozin Analogicky lze připravit kmeny, u kterých bude docházet k začleňování jinak modifikovaných aminokyselin 44 RACIONÁLNI DESIGN 1. Počítačové modelování í* 2. Místné cílená mutageneze Samostatný mutovaný gen 3. Transformace 4. Exprese proteinu 5. Purifikace proteinu 6. neníaptikován VYLEPŠENY ENZYM RIZENA EVOLUCE 1. není aplikováno 2. Náhodná mutageneze Knihovna mutovaných genů (>10,000 klonů ) 3. Transformace 4. Exprese proteinu 5. není aplikována 6. Screening a výběr stabilita selektivita afinita aktivita Zkonstruovaný mutantní enzym 7. Biochemické testování Vybrané mutantní enzymy Převzato: J. Damborský: Racionální design a řízená evoluce představují dva koncepčně rozdílné přístupy používané při konstrukci vylepšených enzymů metodami proteinového inženýrství. Dosažení náhodné záměny nukleotidů: - Použití neoptimálních podmínek pro syntézu DNA in vitro (např. změny koncentrace iontů, odlišné koncentrace prekurzorů nukleotidů mají za následek chyby v jejich zařazování do DNA) - Použití DNA-polymerázy bez korektorské funkce Základní problém: dochází ke vzniku většího počtu substitucí a je obtížné určit, která záměna (mutace) zodpovídá za změnu vlastností genu 46 47