Základy klinické onkologie Úvod do problematiky cílené a personalizované léčby v onkologii Karel Zitterbart Klinika dětské onkologie LF MU a FN Brno Konvenční cytostatika (chemoterapeutika) Klener P, Klener P Jr: Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii 2010 Klener P, Klener P Jr: Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii 2010 Konvenční chemoterapie Chemosensitivita, limity … 0 12 24 36 48 Survival Time 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 CumulativeProportionSurviving ALL ČR 2007 - 2009 4 cycles : - trofosfamide (10 days ; 275 mg/m²/day) - etoposide (10 days ; 225 mg/m²/day) 4 cycles : - trofosfamide (10 days ; 275 mg/m²/day) - idarubicin (10 days ; 45 mg/m²). VS thiotepa (600 mg/m²) + cyclophosphamide (4.5 g/m²) melphalan (120 mg/m²) + etoposide (1.8 g/m²). VS Failure of HDT strategies: -tumor-immunity dysregulation? -reactivation of the angiogenic switch? -other mechanisms? T Traditional view T E Folkman 1970s T E S I “ T u m o r “ Stromal cells Immune / Inflammation system Endothelium Circulating Progenitors Today P Tumor and Host as a Unit We often do not know what the right target is.. (HD, NEJM 12-2014) “ Cell-autonomous Disease ” “ Tissue/developmental disease” Cancer is not only an organ, or single cell disease, but host disease… Prof. Štěrba Human cancers are heterogeneous Meric-Bernstam, F. & Mills, G. B. (2012) Nat. Rev. Clin. Oncol. doi:10.1038/nrclinonc.2012.127 Beltran H et al (2012) Cancer Res DNA-sequencing of aggressive prostate cancers Human cancers are heterogeneous Distinct molecular pathways are deregulated in pediatric HGG (Wu et al Nature Genetics 2014) Adult GBM genomic alterations (TCGA Cell 2013) MOLEKULÁRNÍ KLASIFIKACE MEDULOBLASTOMU (2013) Northcott PA et al, Nat Rev Cancer 2012 SHH meduloblastom (Kool et al . 2014) SHH meduloblastom (Kool et al . 2014) Cavalli et al., 2017, Cancer Cell 31, 737–754 jaderná akumulace beta-cateninu (WNT podskupina) imunohistochemie OS5 = 91,3 % Ellison DW et al. 2005 Gajjar A et al. 2006 OS5 = 100 % SIOP PNET MB 5 Srovnání kumulativních dávek CCGA9961 PNET5 LR PNET5 SR cDDP 600 mg/m2 210 mg/m2 280 mg/m2 CCNU 600 mg/m2 225 mg/m2 300 mg/m2 VCR 48 mg/m2 (včetně 8 x při RT) 13.5 mg/m2 (žádný při RT) 18 mg/m2 (žádný při RT) CPM - 6 g/m2 8 g/m2 CBDCA - - 900 mg/m2 Prediktivní testování : predikce odpovědi na cílenou léčbu Copyright © American Society of Clinical Oncology Amado, R. G. et al. J Clin Oncol; 26:1626-1634 2008 Progression-free survival by treatment within KRAS groups Mutant – 7.4 vs 7.3 weeks Wild type – 12.3 vs. 7.3 weeks P= <0.0001 Cetuximab (Erbitux): chimerická IgG1 MoAb proti extracelulární doméně receptoru EGFR/ERBB1/HER1. 5 x vyšší afinita oproti přirozeným ligandům (EGF, TGFa) Přítomnost aktivačních mutací genu KRAS byla klinickými studiemi prokázána jako významná determinanta rezistence nádoru vůči působení anti-EGFR MoAb / inhibitorů. Pouze u pacientů s tumory, jejichž buňky obsahují wt KRAS lze počítat s terapeutickým úspěchem. Indikace : karcinomy hlavy a krku, metastatický kolorektální karcinom dle Adam, Z. et al., Remedia 2005 Teoretická východiska cílené léčby (targeted therapy) monoklonální protilátky (MoAb) „small drugs“ Ale: v reálném životě neexistuje ani ideální cílené terapeutikum …. Terapeutické monoklonální protilátky Emil Adolf von Behring (1854-1917) • jeden ze zakladatelů imunologie a sérologie, objevitel séra proti záškrtu (1890) • 1901: první nositel Nobelovy ceny za fyziologii a medicínu Paul Ehrlich (1854- 1915) Seitenkettentheorie (1897) • „toxiny a antitoxiny“ jako chemické substance • koncept "magic bullet„ • autoimunita jako “horror autotoxicus” • Nobelova cena v roce 1908 Gerald Edelman and Rodney Porter objev chemické struktury protilátek (1961-1969) (Nobelova cena , 1972) Jerne, Koehler, and Milstein hybridomová technologie (1975) (Nobelova cena , 1984) Muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3, výrobce Janssen-Cilag) Myší monoklonální protilátka anti-CD3 --> deplece T-lymfocytů 1986 - schválení U.S. Food and Drug Administration (FDA) k léčbě nemocných s akutní rejekcí transplantátů ledvin, srdce nebo jater Historie MoAbs Protilátky proti membránovým antigenům leukocytů (1) Rituximab (Mabthera, Rituxan) : • Chimerická myší-lidská anti-CD20 MoAb • 1997 - 1. schválení MoAb k terapii maligních onemocnění • Mechanismus účinku komplexní povahy • CD20 exprimován na zralých B-lymfocytech a u zralých B-hematoonkologických malignit (folikulární lymfom, B-CLL, Burkittův lymfom, difuzní velkobuněčný B-lymfom (DLBCL), • Hematoonkologické indikace ( např. lymfomy plášťové zóny (mantel cell lymfoma) • neonkologické indikacíe např. refrakterní = na léčbu špatně reagující = ITP či AIHA (autoimunitní trombocytopenie či autoimunitní hemolytická anémie) Rituximab v léčbě maligního lymfomů Rituximab je indikován pro léčbu folikulárního lymfomu v 1. linii v kombinaci s chemoterapií (CVP, CHOP), dále pro léčbu CD20 pozitivního difúzního B-velkobuněčného lymfomu v kombinaci s chemoterapií CHOP (celkem 8 dávek) nebo v kombinaci s chemoterapií (ICE, ESHAP) v relapsu difúzního B-velkobuněčného lymfomu. Dále pak pro udržovací léčbu folikulárního lymfomu v 1. linii i v relapsu onemocnění pro nemocné, u kterých indukční terapií bylo dosaženo minimálně parciální remise nebo lepší klinické odpovědi. Po indukční léčbě 1. linie je rituximab podáván 1× za 2 měsíce po dobu 2 let (tedy 12 dávek), po indukční terapii relapsu folikulárního lymfomu pak 1× za 3 měsíce po dobu 2 let (tedy 8 dávek). Další indikací je monoterapie folikulárního lymfomu v relapsu onemocnění. Podání rituximabu v registrovaných indikacích je možné ve zdravotnických zařízeních se zvláštní smlouvou zahrnujících Centra intenzivní hematologické péče a Komplexní onkologická centra. Rituximab dále prokázal v rámci klinických studií prospěch ve smyslu prodloužení doby do progrese či celkového přežití u dalších CD20 pozitivních lymfoproliferativních chorob: lymfom z plášťových buněk (MCL), lymfom z malých lymfocytů (SLL), Burkittův lymfom, MALT lymfomy, další CD20 pozitivní lymfomy a chronická B-lymfatická leukémie. Podání rituximabu v těchto indikacích je možné pouze v Centrech intenzivní hematologické péče (CIHP). Nežádoucí účinky rituximabu: Relativně časté, zřídka však závažné Během a bezprostředně po aplikaci léků- horečka, třes, hypotenze, bronchospazmus, angioedém … Riziko reaktivace chronické hepatitidy B, proto před nasazením léku vždy vyšetření sérologické vyšetření na HBV Vzácně těžká alergické reakce , srdeční zástava, syndrom akutní lýzy nádoru Imunosuprese: Deplece B-lymfocytů v délce měsíců ( fyziologických i autoreaktivních ), repopulace cca v 9-12 měsíci po iniciální depleci rituximab (Mabthera, fy Roche) -anti-CD20 chimerická IgG1 MoAb - 1997: 1. schválená MoAb k terapii maligních onemocnění (B-NHL) -CD20 exprimován na zralých B-lymfocytech a na více než 90 % buněk B-NHL - po vazbě nedochází k internalizaci komplexu Udržovací léčba rituximabem (tzv. maintenance) Protilátky proti membránovým antigenům leukocytů (2) Ofatumumab (Arzerra) : • čistě lidská anti-CD20 MoAb • odlišný epitop než rituximab • stálejší vazba na receptor, ADCC stejné intenzity jako rituximab, ale intenzivnější indukce CDC • téměř neindukuju tvorba autoprotilátek HAHA • statut orphan drug k léčbě chronické lymfatické leukémie (CLL) • klinické studie u nehodgkinských lymfomů (NHL) Veltuzumab : humanizovaná anti-CD20 MoAb IgG1 stejný epitop jako rituximab subkutánní podání Protilátky proti membránovým antigenům leukocytů (3) Alembuzumab (MabCampath): • humanizovaná anti-CD52 MoAb • povrchový glykoprotein přítomný u maligních i normálních T- a Blymfocytů, ale též monocytů/makrofágů • deplece CD4+ i CD8+ T-lymfocytů • vysoké riziko oportunních infekcí (CMV, herpesvirosy, Pneumocystis jiroveci) • léčba chronické lymfatické leukémie (CLL) • četné NÚ včetně pancytopenie, těžké postinfuzní reakce, syndrom nádorového rozpadu Tvorba neutralizačních protilátek při aplikaci (human anti-mouse antibody, HAMA,); není optimální vazba imunokompetent -ních buněk na myší Fc fragment (ADCC) příklad: anti-CD20 ibritumomab tiuxetan (konjugát s 90Ytrium, beta zářič) (Zevalin) tositumomab (Bexxar) (konjugát s 131-I, beta i gama zářič) anti-EGFR panitumumab (Vectibix) anti-CD20 ofatumumab (Arzerra) Pozn. Phase 2 studie ve FN Brno, u pacientů s chronickou lymfocytární leukémií (CLL) Myší, chimerické, humanizované a čistě lidské MoAb Mechanismus účinku MoAbs ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity (= buňkami zprostředkovaná cytotoxicita závislá na protilátkách) CDC: complement dependent cytotoxicity Přímý cytostatický účinek protilátek Engineered Fc properties and applications http://www.invivogen.com/ Pozn. ADEPT : Antibody-directed enzyme prodrug therapy 1 monospecific antibodies: fragment antigen-binding, F(ab')2 fragment, Fab' fragment, single-chain variable fragment, di-scFv, single domain antibody) bispecific antibodies : trifunctional antibody, chemically linked F(ab')2, bi-specific Tcell engager) Monospecifické protilátky: Bispecifické protilátky Příklad bispecifické trifunkční protilátky: např. catumaxomab (Removab ®) EpCAM = Epithelial cell adhesion molecule (CD326) Used for treatment of malignant ascites in patients with EpCAM-positive cancer if a standard therapy is not available Klener P, Klener P Jr: Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii 2010 Klener P, Klener P Jr: Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii 2010 http://www.mycancergenome.org/ Protilátky proti receptorovým kinázám(1) Klener P, Klener P Jr: Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii 2010 Protilátky proti receptorovým kinázám (2) EGFR/ERBB/HER Protilátky proti receptorovým kinázám Cetuximab (Erbitux): chimerická IgG1 MoAb proti extracelulární doméně receptoru EGFR/ERBB1/HER1. 5 x vyšší afinita oproti přirozeným ligandům (EGF, TGFa) Přítomnost aktivačních mutací genu KRAS byla klinickými studiemi prokázána jako významná determinanta rezistence nádoru vůči působení anti-EGFR MoAb. Pouze u pacientů s tumory, jejichž buňky obsahují wt KRAS lze počítat s terapeutickým úspěchem. Indikace : karcinomy hlavy a krku, metastatický kolorektální karcinom bevacizumab (Avastin) neutralizační humanizovaná MoAb proti ligandu VEGF blokáda nádorové neuvaskularizace -- antiangiogenní léčba indikace : metastatický karcinom tlustého střeva, prsu , nemalobuněčný karcinom plic jiný než dlaždicového typu , karcinom ledviny klinické studie : multiformní glioblastom , karcinom pankreatu etc. transtuzumab (Herceptin) humanizovaná MoAb proti ERBB2/HER2/NEU zvýšená exprese u 10-30 % karcinomu prsu, dále u karcinomu ovaria, prostaty , endometria transtuzumab brání dimerizaci s ostatními členy ERBB Inhibitory RTK a PTK Klener P, Klener P Jr: Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii 2010 Příklady: Přehled vybraných „biologik“ a jejich cílů, se schválenou indikací regulačním úřadem FDA (US Food and Drug Administration) Aktualizovaný seznam lze najít např. zde: https://www.mycancergenome.org/content/mole cular-medicine/overview-of-targeted-therapies- for-cancer/ Agent Target(s) FDA-approved indication Ado-trastuzumab emtansine (Kadcyla) HER2 (ERBB2/neu) •Breast cancer (HER2+) Afatinib (Gilotrif) EGFR (HER1/ERBB1), HER2 (ERBB2/neu) •Non-small cell lung cancer (with EGFR exon 19 deletions or exon 21 substitution (L858R) mutations) Aldesleukin (Proleukin) •Renal cell carcinoma •Melanoma Alemtuzumab (Campath) CD52 •B-cell chronic lymphocytic leukemia Axitinib (Inlyta) KIT, PDGFRβ, VEGFR1/2/3 •Renal cell carcinoma Belimumab (Benlysta) BAFF •Lupus erythematosus Bevacizumab (Avastin) VEGF ligand •Colorectal cancer •Glioblastoma •Non-small cell lung cancer •Renal cell carcinoma Bortezomib (Velcade) Proteasome •Multiple myeloma Mantle cell lymphoma Bosutinib (Bosulif) ABL •Chronic myelogenous leukemia (Philadelphia chromosome positive) Brentuximab vedotin (Adcetris) CD30 •Hodgkin lymphoma •Anaplastic large cell lymphoma Cabozantinib (Cometriq) FLT3, KIT, MET, RET, VEGFR2 •Medullary thyroid cancer Canakinumab (Ilaris) IL-1β •Juvenile idiopathic arthritis •Cryopyrin-associated periodic syndromes Carfilzomib (Kyprolis) Proteasome •Multiple myeloma Cetuximab (Erbitux) EGFR (HER1/ERBB1) •Colorectal cancer (KRAS wild type) •Squamous cell cancer of the head and neck Crizotinib (Xalkori) ALK, MET •Non-small cell lung cancer (with ALK fusion) Dabrafenib (Tafinlar) BRAF •Melanoma (with BRAF V600 mutation) Dasatinib (Sprycel) ABL •Chronic myelogenous leukemia (Philadelphia chromosome positive) •Acute lymphoblastic leukemia (Philadelphia chromosome positive) Denosumab (Xgeva) RANKL •Giant cell tumor of the bone Erlotinib (Tarceva) EGFR (HER1/ERBB1) •Non-small cell lung cancer •Pancreatic cancer Everolimus (Afinitor) mTOR •Pancreatic neuroendocrine tumor •Renal cell carcinoma •Nonresectable subependymal giant cell astrocytoma associated with tuberous sclerosis •Breast cancer (HR+, HER2-) Gefitinib (Iressa) EGFR (HER1/ERBB1) •Non-small cell lung cancer with known prior benefit from gefitinib (limited approval) Ibritumomab tiuxetan (Zevalin) CD20 •Non-Hodgkin's lymphoma Ibrutinib (Imbruvica) BTK •Mantle cell lymphoma •Chronic lymphocytic leukemia Imatinib (Gleevec) KIT, PDGFR, ABL •GI stromal tumor (KIT+) •Dermatofibrosarcoma protuberans •Multiple hematologic malignancies including Philadelphia chromosomepositive ALL and CML Ipilimumab (Yervoy) CTLA-4 •Melanoma Lapatinib (Tykerb) HER2 (ERBB2/neu), EGFR (HER1/ERBB1) •Breast cancer (HER2+) Nilotinib (Tasigna) ABL •Chronic myelogenous leukemia (Philadelphia chromosome Obinutuzumab (Gazyva) CD20 •Chronic lymphocytic leukemia Ofatumumab (Arzerra, HuMax- CD20) CD20 •Chronic lymphocytic leukemia Panitumumab (Vectibix) EGFR (HER1/ERBB1) •Colorectal cancer (KRAS wild type) Pazopanib (Votrient) VEGFR, PDGFR, KIT •Renal cell carcinoma Pertuzumab (Perjeta) HER2 (ERBB2/neu) •Breast cancer (HER2+) Ponatinib (Iclusig) ABL, FGFR1-3, FLT3, VEGFR2 •Chronic myelogenous leukemia •Acute lymphoblastic leukemia (Philadelphia chromosome positive) Regorafenib (Stivarga) KIT, PDGFRβ, RAF, RET, VEGFR1/2/3 •Colorectal cancer •Gastrointestinal stromal tumors Rituximab (Rituxan, Mabthera) CD20 •Non-Hodgkin’s lymphoma •Chronic lymphocytic leukemia •Rheumatoid arthritis •Granulomatosis with polyangiitis Romidepsin (Istodax) HDAC •Cutaneous T-cell lymphoma •Peripheral T-cell lymphoma Ruxolitinib (Jakafi) JAK1/2 •​Myelofibrosis Sipuleucel-T (Provenge) •Prostate cancer Sorafenib (Nexavar) VEGFR, PDGFR, KIT, RAF •Hepatocellular carcinoma •Renal cell carcinoma •Thyroid carcinoma Temsirolimus (Torisel) mTOR •Renal cell carcinoma Tocilizumab (Actemra) IL-6R •Rheumatoid arthritis •Juvenile idiopathic arthritis Tofacitinib (Xeljanz) JAK3 •Rheumatoid arthritis Tositumomab (Bexxar) CD20 •Non-Hodgkin's lymphoma Trametinib (Mekinist) MEK •Melanoma (with BRAF V600 mutation) Trastuzumab (Herceptin) HER2 (ERBB2/neu) •Breast cancer (HER2+) •Gastric cancer (HER2+) Vandetanib (Caprelsa) EGFR (HER1/ERBB1), RET, VEGFR2 •Medullary thyroid cancer Vemurafenib (Zelboraf) BRAF •Melanoma (with BRAF V600 mutation) Vismodegib (Erivedge) PTCH, Smoothened •Basal cell carcinoma Vorinostat (Zolinza) HDAC •Cutaneous T-cell lymphoma Ziv-aflibercept (Zaltrap) PIGF, VEGFA/B •Colorectal cancer http://www.mycancergenome.org/ some interesting new drugs Midostaurin:multi TK inhibitor PKCα, VEGFR2, C-kit, PDGFR, FLT3 Blinatumomab: novel bispecific construct – reacts simultaneously to normal CD3+ T cells and CD19+ ALL cells, followed by T cell–mediated cytotoxicity (BiTE mechanism) Ponatininb:inhibition of all known variants of the BCR-ABL fusion protein and other TK including FLT3, FGFR, SRC, VEGFR, c-KIT and PDGFR Axitinib:multiple tyrosine kinase inhibitor, more potent inhibitor of VEGF receptors than Avastin, targeting pan-VEGF (R1, R2, R3), PDGFR+cKIT Cabazitaxel: novel taxane, two key advantages - ability to cross the blood-brain-barrier and to overcome drug resistance Crizotinib: tyrosine kinase inhibitor targeting the product of ALK and the product of MET (neuroblastoma, ALCL) Azacitidine: two mechanisms; inhibition of DNA methyltransferase at low doses - hypomethylation of DNA, and direct cytotoxicity in abnormal hematopoietic cells at high doses Vandetanib inhibitor of the tyrosine kinase activity of VEGFR-2, an endothelial cell receptor for VEGF, EGFR and the RET tyrosine kinase. TH-302 nitroimidazole-linked prodrug. Under hypoxic conditions releases bromo-isophosphoramide mustard (Br-IPM), a DNA crosslinking agent Obitunumab – anti CD 20, higher affinity than rituximab Cobimetinib: MEK 1/2 inhibition, Ras/Raf/MEK pathway Many more…> 800 anti-cancer drugs waiting… Prof. Štěrba, personal communication http://www.registry.cz/index.php?pg=registry&cat=30 Registry ČOS monitorující cílenou léčbu zhoubných nádorů: Česká onkologická společnost (ČOS) vede klinické registry pacientů léčených cílenou biologickou léčbou v Komplexních onkologických centrech (KOC). Díky registrům je možno hodnotit přínos a bezpečnost léčby. Zadávání údajů do registrů není povinné, ale přesto v nich jsou zaznamenány informace o více než 90 % pacientů. Registry poskytují dostatek ověřených důkazů o tom, že nákladnou léčbou se v onkologii neplýtvá a je podávána podle hesla „správná léčba správnému pacientovi“. Imunoonkologie - poznámky spouštěče kostimulučaních a inhibičních drah T lymfocytární odpovědi vedoucí k modulaci délky amplitudy imunitní odpovědi a tím k udržení intergrity organismu (self tolerance) T buněčné inhibiční a stimulační receptory a jejich ligandy Anti-PD (programed cell death 1, CD279), Anti PD–L1(CD274), anti PD-L2( CD273), anti-CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CD152) CAVE: irAE (immune related adverse events) pneumonitis, colitis, hepatitis, nephritis, renalní a thyroidální dysfunkce kutaní toxicita autoimunní hypopituitaritidy Check points Check point blockers https://www.hindawi.com/journals/scientifica/2013/857519.fig.001.jpg CTLA 4 cytotoxic T lymphocyte associated antigen inhibiční molekula T lymfocytů ( CD4+, CD8+) interakce s CD80/86 na APC kompetice s CD28 T buněk (CD28 stimulace vs CTLA4 inhibicie) inhibice T lymfocytární proliferace a aktivace Ipilimumab anti CTLA 4 ▪ rekombinantní humánní monoklonální protilátka ▪ stimulace imunitní odpovědi ▪ první FDA schválený check point od r. 2011 (metastatický melanom) ▪ nepřímý antitumorosní efekt posílení T mediované odpovědi Check point blockers http://cancergrace.org/lung/files/2012/06/Slide08.jpg PD1 program cell death receptor transmembránový protein T, B, NK, DC monocytů experse je zvýšena na lymfocytech v mikrosprotředí nádoru inhibice apoptosy maligních buněk přeměna T efektorových na Treg, vyčerpání T efektorových buněk interakce s PD-L1 a PD-L2 anti PD 1 (nivolumab) plně humanizovaná IgG4 anti PD 1 protilátka ▪ blokace PD1-PDL cesty ▪ povolen FDA ▪ kombinace s ipilimumabem nebo monoterapie Check point blockers PD-L1 PD-L2 program cell death receptor ligand ▪ exprese hematopoetické buňky (T, B, NK, DC,monocyty) a buňky tumoru ▪ interakce PD-PDL1/2 ▪ Inhibice T lymfocytární odpovědi, indukce Treg Anti PDL1 atezolizumab ▪ Anti PDL 1 ▪ 5/16 FDA uroteliální carcinom Check point blockers http://c431376.r76.cf2.rackcdn.com/70393/fimmu-04-00417-HTML/image_m/fimmu-04-00417-g004.jpg Medical Tribune XIV, 3, 2018 As of 2017, pembrolizumab (anti-PD1) is used via intravenous infusion to treat inoperable or metastatic melanoma, metastatic non-small cell lung cancer (NSCLC) in certain situations, as a second-line treatment for head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), after platinum-based chemotherapy, and for the treatment of adult and pediatric patients with refractory classic Hodgkin's lymphoma(cHL). For NSCLC, pembrolizumab is a first line treatment if the cancer overexpresses PD-L1, a PD-1 receptor ligand, and the cancer has no mutations in EGFR or in ALK; if chemotherapy has already been administered, then pembrolizumab can be used as a second line treatment but if the cancer has EGFR or ALK mutations, agents targeting those mutations should be used first. Assessment of PD-L1 must be conducted with a validated and approved companion diagnostic. In 2017 the FDA approved it for any unresectable or metastatic solid tumor with certain genetic anomalies (mismatch repair deficiencyor microsatellite instability).[2][10]