Fluorescence v klinické praxi:
molekulární cytogenetika
RNDr. Jan Škoda, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
1
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Osnova
 Fluorescence v klinické praxi – přehled metod
 Molekulární cytogenetika a fluorescence
 Fluorescenční hybridizace in situ (FISH)
 Využití FISH
 Modifikace FISH
• Mnohobarevná FISH (M-FISH) a spektrální karyotypování (SKY)
• Komparativní genomová hybridizace (CGH)
• Array-CGH
2
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Fluorescence v klinické praxi
 využívaná především jako nedestruktivní cesta označení a analýzy
biologických vzorků
 autofluorescence nebo značení s využitím fluorochromů
Přístupy analýzy
 spektrofluorimetr (kyveta/mikrodestička)
 průtokový cytometr/sorter
 fluorescenční mikroskop
3
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Spektrofluorimetrie
 detekce proteinů, toxinů,
biomarkerů
 detekce a měření koncentrace
DNA a RNA
 testy aktivity enzymů
 testy toxicity, proliferace buněk
4
Invitrogen Qubit® 3.0
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Spektrofluorimetr s digitálním mikroskopem
kombinace fluroescenční mikroskopie
(+ světlé pole, fázový kontrast) a čtečky mikrodestiček
(umožňuje snímat i mikroskopická skla, Petriho misky nebo
kultivační láhve)
 možnost využití standardních fluorimetrických
metod současně s automatizovanou analýzou
obrazu
 zobrazení živých buněk, snímání v čase,
fenotypizace, počítání buněk/populací…
5
Biotek Cytation 5
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Průtoková cytometrie a FACS
 klinická imunologie (imunofenotypizace lymfocytů, funkční testy, stanovení
produkce cytokinů, HLA typizace…)
 hematoonkologie (imunotypizace leukémií, stanovení minimální reziduální
nemoci, třídění buněk pro následné analýzy – např. FISH)
 nádorová a molekulární biologie (nádorové markery, proliferace, buněčný
cyklus, apoptóza, léková rezistence…)
Výhody
 rychlost = vysoká frekvence analýzy částic
 citlivost = lze analyzovat velké množství
částic a detekovat i nepočetné populace
Nevýhody
 potřeba buněk v suspenzi (nejčastěji živých)
 nutnost zkušené obsluhy pro nastavení
přístroje i analýzu výsledků (bez intuitivní
vizuální kontroly)
6
Fluorescence activated cell sorting
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Zobrazovací průtoková cytometrie
7
Imaging Flow Cytometry
Amnis ImageStream®X Mark II
 jednotlivé částice (události) jsou snímány při průchodu kapilárou pomocí CCD
kamery → pro každou částici existuje příslušný obraz → obrazová analýza
 kombinace výhod průtokové cytometrie (rychlost, citlivost) a mikroskopie
(morfologie, lokalizace a četnost struktur…)
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Zobrazovací průtoková cytometrie
8
http://www.bioimaging2014.ineb.up.pt/LABS.html Basiji DA et al.Clinics in laboratory
medicine. 2007;27(3):653-viii.
Lokalizace transkripčního faktoru NFkB FISH chrom. 8
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Fluorescenční mikroskop
9
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Molekulární cytogenetika a fluorescence
 molekulární cytogenetika představuje spojení mezi klasickou cytogenetikou
a molekulární biologií
 Využívá poznatky molekulární biologie, fluorescence, mikroskopie a počítačové
analýzy obrazu ke studiu struktury a vlastností chromozomů (DNA)
 metody založené na použití specifických fluorescenčně značených DNA sond
 umožňuje analýzy početních i strukturních odchylek chromozomů
neidentifikovatelných klasickými cytogenetickými technikami
 nevyžaduje přítomnost mitóz (I-FISH: možnost analýzy buněk v interfázi)
10
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Historie a milníky lidské cytogenetiky
„Hypotonic Period“
 hypotonizace buněk (KCl), kolchicin - akumulace mitóz (1951)
 fytohemaglutinin (PHA) - stimulace lymfocytů periferní krve (1960)
 stanovení přesného počtu lidských chromozomů – 1956 (Tjio JH, Levan A)
„Trisomy Period“
 trizomie chromozomu 21 (1959)
 první deleční syndrom - „cri du chat“ (1963)
„Banding Area“
 pruhovací techniky barvení chromozomů (1968 – 1970); G-, R-, C-pruhy
„Molecular Area“
 metoda hybridizace in situ (1970), fluorescenční ISH (1986)
 komparativní genomová hybridizace (CGH) (1992)
 spektrální karyotypování (M-FISH, SKY) (1996)
 M-pruhování (2001)
„Molecular karyotyping“
 DNA čipy
11
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Genetická
ambulance
genealogické
vyšetření
chromozomy
cytogenetické vyšetření
pacient
molekulárně-genetické
vyšetření
DNA
klasické molekulárně-
cytogenetické
Molekulární cytogenetika při genetickém vyšetření
12
Cytogenetická
laboratoř
Laboratoř DNA/RNA
diagnostiky
RNA
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
 fluorescenční mikroskop vybavený sadou
fluorescenčních filtrů
 citlivá černobílá CCD kamera
 počítač a specifický software pro metody FISH,
M-FISH, CGH
 skener + software pro analýzu array-CGH čipů
Vybavení molekulárně-cytogenetické laboratoře
13
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Fluorescenční hybridizace in situ (FISH)
 1969 Parduová a Gall – radioaktivní značení
 1986 Pinkel et al. – fluorescenční značení sondy (FISH)
Hybridizace fluorescenčně značené sondy s DNA metafázních chromozomů
nebo interfázních jader na cytogenetickém preparátu
 zhotovení kvalitního preparátu obsahující cílové místo na DNA
(metafázní chromozómy, interfázní jádra, tkáňové preparáty)
 denaturace cílového místa (preparátu)
 denaturace sondy
 hybridizační reakce mezi sondou a cílovým místem
 odstranění nenavázané či nespecificky vázané sondy
 barvení pozadí
 vyhodnocení a zpracování fluorescenčního signálu
14
Fluorescence in situ hybridization
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Příprava
chromozomových
preparátů
Vyhodnocení
na fluorescenčním
mikroskopu
Značená sonda
hybridizovaná
s cílovou sekvencí
Sonda
D e n a t u r a c e
H y b r i d i z a c e
Značení
fluorochromem
Cílová sekvence
Princip FISH
15
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Zdroje DNA pro přípravu sond
 klonované sekvence DNA inkorporované
do vektorů, plazmidů, kosmidů
 chromozomy získané
FACS
 mikrodisekce chromozomů
či jejich součástí
16
Značení – dle způsobu detekce sond
 radioaktivně
 hapteny (biotin, digoxigenin) – nepřímé značení
 enzymy
 fluorochromy (FITC, TRITC, Texas Red, SpectrumGreen,
SpectrumOrange, SpectrumRed, SpectrumBlue, SpectrumGold)
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Fluorescenční barviva v genetice
FLUOROCHROM EXCITAČNÍ MAX. (nm) EMISNÍ MAX. (nm)
BARVA
FLUORESCENCE
a) značení sond
AMCA 350 450 modrá
Fluorescein - FITC 495 515 zelená
Rhodamin 550 575 červená
Rhodamin - TRITC 575 600 červená
Texas red 595 615 červená
Cy3 552 565 červená
SpectrumOrange 559 588 červená
SpectrumGreen 509 538 zelená
SpectrumAqua 433 480 modrá
b) barvení pozadí
DAPI 355 450 modrá
Hoechst 33258 356 465 modrá
Propidium jodid 530 615 červená
17
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
 Lokusově specifické
 Centromerické
 Telomerické
 Celochromozomové
 …
Typy sond dle místa vazby
18
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Lokus SNRPN (Abbott Molecular)
19
 Delece v oblasti 15q11-q13 vedou ke
vzniku mikrodelečních syndromů
 Angelmannův syndrom (maternální
chromozom) a Prader-Willi syndrom
(paternální chromozom)
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
FISH: přítomnost, počet a poloha signálů!
20
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Cytogenetika interfáze
21
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Cytogenetika interfáze
22
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Cytogenetika interfáze – vyšetřování translokací
v onkogenetice
23
Filadelfský
chromozom
 t(9;22)(q34;q11)
 gen pro kinázu Abl
se translokuje do
oblasti genu BCR
→ expresí vzniká
fúzní protein,
konstitutivní
kinázová aktivita
→ deregulace
buněčného dělení
a dalších procesů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Translokace BCR/ABL – interfáze
24
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Translokace SS18 – split sonda
 Translokace genu SS18 asociována se synoviálním sarkomem – diagnostika
 Součást molekulárně patologického vyšetření – tkáňové řezy
25
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
FISH
Výhody
 nevyžaduje přítomnost mitóz (ve
většině případů) – lze analyzovat
buňky v interfázi i tkáňové řezy
 rychlé (relativně) zhodnocení
velkého počtu buněk
26
Nevýhody
 neposkytuje celogenomový pohled
 není vhodná pro analýzu
neznámých aberací
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
FISH a její modifikace
 Fiber FISH
 RxFISH
 ZOO-FISH
 Mnohobarevná FISH (M-FISH)
 Spektrální karyotypování (SKY)
 Mnohobarevné pruhování (M-banding)
 Komparativní genomová hybridizace (CGH)
 Technologie array-CGH
27
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Fiber FISH
28
Princip
 extrakce vláken DNA z jádra →
roztěr na mikroskopické sklo →
jednotlivá natažená vlákna
DNA
 jednotlivé geny jsou viditelné
na základě fluorescenčních
signálů
 rozlišení kolem 1 kb
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Technika RxFISH
 hybridizace lidských chromozomů s celogenomovou DNA sondou odvozenou
z genomu gibona (x = cross species)
 DNA člověka – DNA gibona: 98 % sekvenční homologie, avšak u gibona se
vyskytují mnohonásobné přestavby chromozomů
Výsledek:
 18 párů s mnohobarevným vzorem (R = rainbow of colors)
 6 párů v jedné barvě
 můžeme detekovat intrachromozomové přestavby
29
Cross-species color banding
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
30
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
FISH v komparativní cytogenetice – ZOO FISH
 komparativní cytogenetika – studium evoluce
lidského karyotypu
 založena na použití celochromozomových DNA
sond, které jsou hybridizovány na chromozomy
jiného druhu
 např. chromozom 2 u lidí – fúze chromozomu 12 a
13 u šimpanze
 ZOO-FISH: hybridizace DNA různých živočišných
druhů
31
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Mnohobarevná FISH (M-FISH) a spektrální
karyotypování (SKY)
 Speicher et al., 1996 (M-FISH), Schröck et al., 1996 (SKY)
 vícebarevné FISH techniky – detekce více značených sond na jednom
preparátu
 v jedné hybridizační reakci simultánní vizualizace všech 22 autozomů
a chromosomů X a Y v odlišných barvách
 kombinatorní značení –
2 fluorochromy 3 sondy (= chromozomy)
3 fluorochromy 7 sond
4 fluorochromy 15 sond
Počet kombinací: 2N - 1
32
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
 hybridizace preparátu se směsí
24 chromozomově specifických
celochromozomových sond
vzniklých kombinatorním značením
(5 fluorochromů)
 každá sonda je charakterizovaná
emisním spektrem, které umožňuje
identifikaci chromozomu
M-FISH a SKY
33
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
M-FISH
Mikroskop vybavený:
 6 fluorescenčními úzkopásmovými
filtry (pro 5 fluorochromů + DAPI)
 citlivou CCD kamerou
 specializovaným softwarem pro
analýzu obrazu (např. Lucia MFISH,
MetaSystems Isis mFISH…)
Postup
 snímání jednotlivých fluorochromů
 složení obrazu
 počítačová analýza – dle kombinace
fluorochromů přiřazení pseudobarev
 vyhodnocení
34
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
M-FISH
35
Snímání jednotlivých fluorochromů, složení obrazu
http://www.lucia.cz/cs/front-page/lucia-mfish
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
M-FISH
36
Počítačová analýza – přiřazení pseudobarev, vyhodnocení
http://www.lucia.cz/cs/front-page/lucia-mfish
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Spektrální karyotypování (SKY)
 mikroskop vybavený filtrem pro DAPI a specializovaným systémem
(interferometr) pro měření spektra emitovaného světla (GenASIs
HyperSpectral)
37
GenASIs HyperSpectral (Applied Spectral Imaging )
 emise fluorochromů (Spectrum
Orange, Spectrum Green, TexasRed,
Cy5, Cy5.5) snímána najednou
(rozdíl oproti M-FISH)
 systém měří spektrum pro každý pixel
obrazu
 speciální počítačový program přiřadí
na základě měření vlnových délek
každému páru chromozomů barvu, ty
se označují jako pseudobarvy
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Display Image Classified Image
7
7
12 12
7
7
12 12
Analýza obrazu pomocí software HiSKY
38
Software automaticky rozliší chromosomy dle změřeného spektra a zobrazí je
v odpovídajících pseudobarvách – lze snadno rozlišit chromozomové páry
a případné chromozomální aberace. Automaticky sestaví karyotyp…
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
 Pacientovi diagnostikován neuroblastom. Pomocí SKY detekována translokace
t(11;22) specifická pro Ewingův sarkom → změna diagnózy a léčebného
protokolu.
39
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
M-FISH a SKY
Výhody
 odhalení balancovaných přestaveb
 detekce aberací v jednom kroku
• kryptické translokace a inzerce
• marker chromozomy
• nadbytečný materiál neznámého původu
• komplexní přestavby
Nevýhody
 vyžaduje kvalitní mitózy – vhodný materiál, metodicky a časově náročné
 úspěšná hybridizace
 finančně nákladné
 nelze detekovat inverze, duplikace/delece menšího rozsahu
40
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
 parciální malovací sondy ze specifických oblastí
chromozomů
 fluorescenční signály jednotlivých sond se podél
sledovaného chromozomu částečně překrývají a
dochází k jejich kombinaci
Mnohobarevné pruhování
(M-banding)
41
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Mnohobarevné pruhování (M-banding)
42
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Chromozom 5
 charakterizace místa zlomu
 rozlišení intrachromozomových přestaveb
43
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Hybridizace: metoda založená na technice FISH
Genomová: umožňuje v jedné hybridizační reakci detekovat nebalancované
změny v celém genomu; stanovit chromozomové změny vedoucí ke ztrátám
(monozomie, delece) či zmnožení (zisky, amplifikace) sekvencí DNA
Komparativní: založená na porovnávání dvou genomů
Komparativní genomová hybridizace (CGH)
44
Comparative genomic hybridisation
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Kallioniemi et al. 1992
Vývoj CGH byl podnícen snahou o rozvoj cytogenetiky
solidních nádorů
45
CGH nevyžaduje mitotickou aktivitu zkoumaných
buněk – materiál pro CGH je DNA!
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Jednotlivé kroky metody CGH
 příprava normálních metafázních chromozomů (od zdravého jedince)
 izolace DNA z nádoru, periferní krve, kostní dřeně (2–3 µg)
 značení testované a referenční (normální) DNA rozdílnými fluorochromy
(nick-translace, fragmenty 600 – 2000 bp)
 denaturace, hybridizace značené DNA na normální metafázní chromozomy
 snímaní metafáz (10-20) citlivou CCD kamerou pod jednotlivými filtry
 karyotypování chromozomů nabarvených DAPI
 statistické zpracování a počítačové vyhodnocení poměrů intenzit
fluorescence podél jednotlivých chromozómů pomocí speciálního
programu
 místa s vyšší či nižší intenzitou fluorescence odpovídají oblastem zisků a ztrát
sekvencí DNA – profily
46
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Princip CGH
Izolace a kvantifikace genomové
DNA
 v následujících krocích použito
stejné množství testované a
referenční DNA
Značení (nick-translace) vzorků
DNA odlišnými fluorochromy
 obvykle testovaná zeleně a
referenční červeně
Smíchání ekvivalentních
množství DNA a aplikace směsi
na metafázní chromozomy →
hybridizace
 sondou je celogenomová DNA
47
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Princip CGH
Ve směsi využita Cot-1 DNA
 připravena z placentální DNA
 potlačuje hybridizaci Alu a
dalších repetitivních sekvencí
Fragmentace značené DNA
 optimalizace hybridizace na
metafázní chromozomy
48
ReferenReferenččnnáá DNADNA CotCot––11 TestTestovanovanáá DNADNA
CotCot––11 potlapotlaččujeuje
hybridizhybridizááciuciu
repetitivnýchrepetitivných sekvencisekvenciíí
ReferenReferenččnnáá DNADNA CotCot––11 TestTestovanovanáá DNADNA
CotCot––11 potlapotlaččujeuje
hybridizhybridizááciuciu
repetitivnýchrepetitivných sekvencisekvenciíí
… následuje 48–72 h hybridizace, odmytí nenavázané sondy, podbarvení
chromozomů pomocí DAPI a snímaní pod fluorescenčním mikroskopem.
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Nasnímání mitóz citlivou CCD kamerou v
modrém, zeleném a červeném spektru → složený
obraz
 výrazné barevné odchylky naznačují přítomnost
chromozomových aberací
49
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Pomocí DAPI podbarvení se na chromozomech vytvoří pseudo G-pruhování
 identifikaci jednotlivých chromozomů – zobrazení jako karyogram
50
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Referenční DNA
Počítačová analýza obrazu: Zelená s červenou…
Testovaná DNA
51
+
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
enh → zisky, amplifikace
dim → ztráty, delece
heterochromatin
hodnota 1
hranice 0,8
hranice 1,2
č. chromozomu
počet hodnocených
chromozumů
zelená - zisk červená - ztráta
výsledný poměr
fluorescence
Interpretace výsledku CGH
52
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
rev ish enh (15q)
rev ish dim (17p,
18q, Y)
Ukázka profilu CGH zpracovaného počítačovou analýzou obrazu u pacienta
s CLL
53
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Sumarizace výsledků z více vzorků
54
Souhrný výsledek CGH u 15 pacientů s neuroblastomem
 Identifikace
markerů
onemocnění
 Identifikace
kauzálních
aberací
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Výhody
 nevyžaduje mitózy pro testovaný vzorek
 poskytuje přehled numerických změn
v celém genomu v jedné hybridizační reakci
Nevýhody
 nemožnost využití u změn, při kterých se nemění
počet sekvencí – balancované aberace
(translokace, inverze)
 není vhodná k odlišení ploidie (normalizace)
 možnost identifikovat jenom změny přítomné
min. v 50 % buněk
 rozlišovací schopnost 10 Mb
→ HR-CGH, aCGH
Výhody a nevýhody klasické CGH
55
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Komparativní genomová hybridizace s vyšším
rozlišením (HR-CGH)
Kirchhoff et al., 1997
Princip HR-CGH:
 laboratorní postup stejný jako v případě CGH
 odlišné vyhodnocování pomocí speciálního software – statistika!
(Laboratory Imaging s r.o., Praha)
 rozlišovací schopnost – 4 Mb
 klonální zastoupení – 30 %
56
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
CGH HR-CGH
rev ish enh (15q)
rev ish dim (17p, 18q, Y)
rev ish enh (15q)
rev ish dim (4p, 9p, 9q12, 13q14,
17p, 18q, Y)
Porovnání výsledku CGH a HR-CGH u pacienta s CLL
57
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
 skládají se z jednotlivých molekul DNA o
známé sekvenci (sondy), které jsou
upevněny ve shlucích (spoty) na pevném
podkladu (sklo, syntetické materiály)
 počet spotů se pohybuje od řádově stovek do
desetitisíců podle typu čipů
 umožňují detekci chromozomových aberací,
mutací a polymorfizmů, sekvenační analýzy
ale i studium genové exprese
 principem metody je hybridizace značené
vyšetřované DNA s imobilizovanými sondami
na čipu
DNA čipy
58
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Analýza genomu
 materiál: genomová DNA
 array-CGH, SNP čipy, resekvenační čipy
Expresní a funkčně specifické studie
 mRNA, proteiny
(např. transkripční faktory)
Epigenetické studie
 ChIP-on-Chip
(vazba proteinu/komplexu
na DNA)
Aplikace DNA čipů
59
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
 Solinas-Toldo et al., 1997
 vychází z principu klasické (chromozomální) CGH
 nahrazení chromozomů separovanými klony (BAC, c-DNA klony,
oligonukleotidy)
 duplikace, delece, amplifikace – CNV(copy number variants)
 nedetekuje balancované přestavby

Array-CGH
60
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Postup
 Izolace DNA
 Kontrola kvality, stanovení kvantity
• Celogenomová amplifikace
 Naštěpení DNA
 Naznačení DNA - fluorescence
 Hybridizace
 Odmytí
 Skenování
 Analýza dat
Array-CGH
61
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Princip array-CGH
62
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
5. Scanning
www.agilent.com
6. Analysis and
interpretation
Příprava DNA čipů pro techniku array-CGH
63
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
aCGH Analytics Software, Agilent Technologies
Vyhodnocování array-CGH
64
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
1p36 delece a
MYCN amplifikace
Celogenomová analýza u pacienta s neuroblastomem
pomocí aCGH
65
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
1. Velikost klonů
Úseky genomové DNA vložené do vektorů
 BAC (Bacterial Artificial chromosome) - 50–200 kb
 PAC (Phage Artificial chromosome) - 75-200 kb
 Rozlišení ~ 1Mb
cDNA - 1-2 kb
 Pouze genové oblasti
 Rozlišení - 1-2 kb
Oligonukleotidy - 25-85 bazí
 Rozlišení pod 1 kb
 s krátkymi nebo dlouhými oligonukleotidy
 v současnosti nejrozšířenějším typem, použitelné
pro prakticky všechny aplikace
Rozlišení array-CGH
66
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
2. Rozložení a vzdálenost klonů
Cílená aCGH – vybrané oblasti zájmu, např. mikrodelece, mikroduplikace
Chromozomově-specifická aCGH
Celogenomová aCGH
 sondy v určitých intervalech
 překrývající se – tilling arrays
Davies et al., 2005
Rozlišení array-CGH
67
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Oligo arrays
8x15K custom chip
4x44K 43 kb rozlišení
2x105K 21 kb rozlišení
1x244K 9 Kb rozlišení
Nové typy – Sure Print G3 Human
8x60K 41 Kb rozlišení
4x180K 13 Kb rozlišení
2x400K 5 Kb rozlišení
1x1M 2 Kb rozlišení
HRCGH
negativní
8x15K
negativní
4x44K
del(1)(p36)
2x105K
del(1)(p36)
del(1)(p36), cca 3 Mb
Agilent Human CGH Microarray
68
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Výhody
 přehled numerických změn v celém genomu v jedné hybridizační reakci
 přesná lokalizace změn – vysoké rozlišení
Nevýhody
 neodhalí balancované aberace (translokace, inverze)
 neodhalí změny ploidie (např. tetraploidní nádor)
 časová a finanční náročnost
Array-CGH
69
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Molekulární karyotypování – 1000x citlivější než
klasická cytogenetika
70
! ALE ! Redukuje informaci o heterogenitě
analyzované buněčné populace
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Klinická cytogenetika:
Prenatální cytogenetická diagnostika
Vyšetřovaný materiál
 kultivované i nekultivované buňky plodové vody,
fetální krev, choriové klky
FISH
AneuVysion Assay Kit (Abbott Vysis)
 trizomie chromozomů 13, 18, 21 (Patau, Edward, Down sy)
 vyšetření sestavy a počtu gonozomů (XX, XY)
Mikrodeleční syndromy
 DiGeorge sy (del(22)(q11.2))
Array-CGH:
 Celogenomový screening
71
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
t(13;15)
trizomie
chr. 18Normální
buňky
Prenatální cytogenetická diagnostika
72
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Klinická cytogenetika:
Postnatální cytogenetické analýzy
Vyšetřovaný materiál
 periférní lymfocyty, bukální stěry
 Mikrodeleční syndromy – FISH
• DiGeorge sy, Prader-Willi/Angelman sy, Williams-Beuren sy, 1p36
mikrodeleční sy a další
 Původ marker chromozomů – CGH, SKY, WCP FISH
 Identifikace a specifikace numerických a strukturních chr. aberací – CGH, SKY
 Detekce gonozomálních mosaik – FISH (X/Y sondy)
73
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Postnatální cytogenetické analýzy
SKY: identifikace marker
chromosomu (chr. 11)
FISH: DiGeorge syndrom
74
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
75