Fl kli i ké iFl kli i ké iFluorescence v klinické praxi:
molekulární cytogenetika
Fluorescence v klinické praxi:
molekulární cytogenetikay gy g
ŠŠRNDr. Jan Škoda, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
RNDr. Jan Škoda, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
1
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
OsnovaOsnova
 Fluorescence v klinické praxi – přehled metod
M l k lá í t tik fl Molekulární cytogenetika a fluorescence
 Fluorescenční hybridizace in situ (FISH)
 Využití FISH
M difik FISH Modifikace FISH
• Mnohobarevná FISH (M-FISH) a spektrální karyotypování (SKY)
• Komparativní genomová hybridizace (CGH)
A CGH• Array-CGH
2
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Fluorescence v klinické praxiFluorescence v klinické praxi
 využívaná především jako nedestruktivní cesta označení a analýzy
biologických vzorkůbiologických vzorků
 autofluorescence nebo značení s využitím fluorochromů
Přístupy analýzyPřístupy analýzy
 spektrofluorimetr (kyveta/mikrodestička)
 průtokový cytometr/sorter
 fluorescenční mikroskop fluorescenční mikroskop
3
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
SpektrofluorimetrieSpektrofluorimetrie
 detekce proteinů, toxinů,
biomarkerůbiomarkerů
 detekce a měření koncentrace
DNA a RNA
 testy aktivity enzymůtesty aktivity enzymů
 testy toxicity, proliferace buněk
Invitrogen Qubit® 3.0
4
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Spektrofluorimetr s digitálním mikroskopemSpektrofluorimetr s digitálním mikroskopem
kombinace fluroescenční mikroskopie
(+ světlé pole fázový kontrast) a čtečky mikrodestiček(+ světlé pole, fázový kontrast) a čtečky mikrodestiček
(umožňuje snímat i mikroskopická skla, Petriho misky nebo
kultivační láhve)
 možnost využití standardních fluorimetrických
metod současně s automatizovanou analýzou
obrazu
 zobrazení živých buněk snímání v čase
Biotek Cytation 5
 zobrazení živých buněk, snímání v čase,
fenotypizace, počítání buněk/populací…
5
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Průtoková cytometrie a FACSPrůtoková cytometrie a FACS
 klinická imunologie (imunofenotypizace lymfocytů, funkční testy, stanovení
produkce cytokinů HLA typizace )
Fluorescence activated cell sorting
produkce cytokinů, HLA typizace…)
 hematoonkologie (imunotypizace leukémií, stanovení minimální reziduální
nemoci, třídění buněk pro následné analýzy – např. FISH)
 nádorová a molekulární biologie (nádorové markery proliferace buněčnýnádorová a molekulární biologie (nádorové markery, proliferace, buněčný
cyklus, apoptóza, léková rezistence…)
VýhodyVýhody
 rychlost = vysoká frekvence analýzy částic
 citlivost = lze analyzovat velké množství
částic a detekovat i nepočetné populacep p p
Nevýhody
 potřeba buněk v suspenzi (nejčastěji živých)
 nutnost zkušené obsluhy pro nastaveníy p
přístroje i analýzu výsledků (bez intuitivní
vizuální kontroly)
6
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Zobrazovací průtoková cytometrieZobrazovací průtoková cytometrie
Imaging Flow Cytometry
Amnis ImageStream®X Mark II
 jednotlivé částice (události) jsou snímány při průchodu kapilárou pomocí CCD
kamery → pro každou částici existuje příslušný obraz → obrazová analýza
 kombinace výhod průtokové cytometrie (rychlost, citlivost) a mikroskopie
(morfologie, lokalizace a četnost struktur…)
7
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Zobrazovací průtoková cytometrieZobrazovací průtoková cytometrie
Lokalizace transkripčního faktoru NFkB FISH chrom. 8
8
http://www.bioimaging2014.ineb.up.pt/LABS.html Basiji DA et al.Clinics in laboratory
medicine. 2007;27(3):653-viii.
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Fluorescenční mikroskopFluorescenční mikroskop
9
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Molekulární cytogenetika a fluorescenceMolekulární cytogenetika a fluorescence
 molekulární cytogenetika představuje spojení mezi klasickou cytogenetikou
a molekulární biologiía molekulární biologií
 Využívá poznatky molekulární biologie, fluorescence, mikroskopie a počítačové
analýzy obrazu ke studiu struktury a vlastností chromozomů (DNA)
 metody založené na použití specifických fluorescenčně značených DNA sondmetody založené na použití specifických fluorescenčně značených DNA sond
 umožňuje analýzy početních i strukturních odchylek chromozomů
neidentifikovatelných klasickými cytogenetickými technikami
 nevyžaduje přítomnost mitóz (I-FISH: možnost analýzy buněk v interfázi)y j p ( ý y )
10
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Historie a milníky lidské cytogenetikyHistorie a milníky lidské cytogenetiky
„Hypotonic Period“
 hypotonizace buněk (KCl), kolchicin - akumulace mitóz (1951)hypotonizace buněk (KCl), kolchicin akumulace mitóz (1951)
 fytohemaglutinin (PHA) - stimulace lymfocytů periferní krve (1960)
 stanovení přesného počtu lidských chromozomů – 1956 (Tjio JH, Levan A)
„Trisomy Period“
 trizomie chromozomu 21 (1959) trizomie chromozomu 21 (1959)
 první deleční syndrom - „cri du chat“ (1963)
„Banding Area“
 pruhovací techniky barvení chromozomů (1968 – 1970); G-, R-, C-pruhy
M l l A “„Molecular Area“
 metoda hybridizace in situ (1970), fluorescenční ISH (1986)
 komparativní genomová hybridizace (CGH) (1992)
k ál í k á í (M FISH SKY) (1996) spektrální karyotypování (M-FISH, SKY) (1996)
 M-pruhování (2001)
„Molecular karyotyping“
 DNA čipy
11
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Molekulární cytogenetika při genetickém vyšetření
Genetická
Molekulární cytogenetika při genetickém vyšetření
Cytogenetická Laboratoř DNA/RNAGenetická
ambulance
zomy
nt
Cytogenetická
laboratoř
Laboratoř DNA/RNA
diagnostiky
chromoz
pacie
DNA RNA
genealogické
vyšetření
cytogenetické vyšetření molekulárně-genetické
vyšetření
l k lá ěklasické molekulárně-
cytogenetické
12
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Vybavení molekulárně cytogenetické laboratoře
 fluorescenční mikroskop vybavený sadou
fluorescenčních filtrů
Vybavení molekulárně-cytogenetické laboratoře
fluorescenčních filtrů
 citlivá černobílá CCD kamera
 počítač a specifický software pro metody FISH,
M-FISH, CGHM FISH, CGH
 skener + software pro analýzu array-CGH čipů
13
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Fluorescenční hybridizace in situ (FISH)Fluorescenční hybridizace in situ (FISH)
 1969 Parduová a Gall – radioaktivní značení
1986 Pi k l t l fl č í č í d (FISH)
Fluorescence in situ hybridization
 1986 Pinkel et al. – fluorescenční značení sondy (FISH)
Hybridizace fluorescenčně značené sondy s DNA metafázních chromozomů
nebo interfázních jader na cytogenetickém preparátunebo interfázních jader na cytogenetickém preparátu
 zhotovení kvalitního preparátu obsahující cílové místo na DNA
(metafázní chromozómy, interfázní jádra, tkáňové preparáty)
 denaturace cílového místa (preparátu)denaturace cílového místa (preparátu)
 denaturace sondy
 hybridizační reakce mezi sondou a cílovým místem
 odstranění nenavázané či nespecificky vázané sondyodstranění nenavázané či nespecificky vázané sondy
 barvení pozadí
 vyhodnocení a zpracování fluorescenčního signálu
14
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Příprava
Princip FISH Příprava
chromozomových
preparátů
S dCíl á k
Princip FISH
Sonda
D e n a t u r a c e
Značení
fluorochromem
Cílová sekvence
Z č á d
H y b r i d i z a c e
Značená sonda
hybridizovaná
s cílovou sekvencí
Vyhodnocení
na fluorescenčním
mikroskopu
15
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Zdroje DNA pro přípravu sondZdroje DNA pro přípravu sond
 klonované sekvence DNA inkorporované
do vektorů plazmidů kosmidůdo vektorů, plazmidů, kosmidů
 chromozomy získané
FACS
 mikrodisekce chromozomůmikrodisekce chromozomů
či jejich součástí
Z č í dl ů b d t k dZnačení – dle způsobu detekce sond
 radioaktivně
h t (bi ti di i i ) ří é č í hapteny (biotin, digoxigenin) – nepřímé značení
 enzymy
 fluorochromy (FITC, TRITC, Texas Red, SpectrumGreen,
SpectrumOrange, SpectrumRed, SpectrumBlue, SpectrumGold)
16
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Fluorescenční barviva v geneticeFluorescenční barviva v genetice
BARVA
FLUOROCHROM EXCITAČNÍ MAX. (nm) EMISNÍ MAX. (nm)
BARVA
FLUORESCENCE
a) značení sond
AMCA 350 450 modrá
Fluorescein - FITC 495 515 zelená
Rhodamin 550 575 červená
Rhodamin - TRITC 575 600 červená
Texas red 595 615 červená
Cy3 552 565 červená
SpectrumOrange 559 588 červenáSpectrumOrange 559 588 červená
SpectrumGreen 509 538 zelená
SpectrumAqua 433 480 modrá
b) barvení pozadí
DAPI 355 450 d áDAPI 355 450 modrá
Hoechst 33258 356 465 modrá
Propidium jodid 530 615 červená
17
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Typy sond dle místa vazby
 Lokusově specifické
C t i ké
Typy sond dle místa vazby
 Centromerické
 Telomerické
 Celochromozomové
 …
18
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Lokus SNRPN (Abbott Molecular)Lokus SNRPN (Abbott Molecular)
 Delece v oblasti 15q11-q13 vedou ke
vzniku mikrodelečních syndromůvzniku mikrodelečních syndromů
 Angelmannův syndrom (maternální
chromozom) a Prader-Willi syndrom
(paternální chromozom)(p )
19
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
FISH: přítomnost počet a poloha signálů!FISH: přítomnost, počet a poloha signálů!
20
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Cytogenetika interfázeCytogenetika interfáze
21
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Cytogenetika interfáze
22
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Cytogenetika interfáze – vyšetřování translokacíy g y
v onkogenetice
Fil d lf kýFiladelfský
chromozom
 t(9;22)(q34;q11)
 gen pro kinázu Abl gen pro kinázu Abl
se translokuje do
oblasti genu BCR
→ expresí vzniká
fúzní protein,
konstitutivní
kinázová aktivita
→ deregulace→ deregulace
buněčného dělení
a dalších procesů
23
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Translokace BCR/ABL interfázeTranslokace BCR/ABL – interfáze
24
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Translokace SS18 split sondaTranslokace SS18 – split sonda
 Translokace genu SS18 asociována se synoviálním sarkomem – diagnostika
S čá t l k lá ě t l i kéh š tř í tkáň é ř Součást molekulárně patologického vyšetření – tkáňové řezy
25
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
FISHFISH
Výhody
ž d j řít t itó (
Nevýhody
k t j l ý hl d nevyžaduje přítomnost mitóz (ve
většině případů) – lze analyzovat
buňky v interfázi i tkáňové řezy
 rychlé (relativně) zhodnocení
 neposkytuje celogenomový pohled
 není vhodná pro analýzu
neznámých aberací
rychlé (relativně) zhodnocení
velkého počtu buněk
26
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
FISH a její modifikaceFISH a její modifikace
 Fiber FISH
R FISH RxFISH
 ZOO-FISH
M h b á FISH (M FISH) Mnohobarevná FISH (M-FISH)
 Spektrální karyotypování (SKY)
 Mnohobarevné pruhování (M-banding)
 Komparativní genomová hybridizace (CGH)
 Technologie array-CGH
27
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Fiber FISHFiber FISH
Princip
t k lák DNA jád extrakce vláken DNA z jádra →
roztěr na mikroskopické sklo →
jednotlivá natažená vlákna
DNA
 jednotlivé geny jsou viditelné
na základě fluorescenčních
signálů
 rozlišení kolem 1 kb
28
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Technika RxFISHTechnika RxFISH
 hybridizace lidských chromozomů s celogenomovou DNA sondou odvozenou
z genomu gibona (x = cross species)
Cross-species color banding
z genomu gibona (x = cross species)
 DNA člověka – DNA gibona: 98 % sekvenční homologie, avšak u gibona se
vyskytují mnohonásobné přestavby chromozomůvyskytují mnohonásobné přestavby chromozomů
Výsledek:
 18 párů s mnohobarevným vzorem (R = rainbow of colors)18 párů s mnohobarevným vzorem (R = rainbow of colors)
 6 párů v jedné barvě
 můžeme detekovat intrachromozomové přestavby
29
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
30
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
FISH v komparativní cytogenetice ZOO FISHFISH v komparativní cytogenetice – ZOO FISH
 komparativní cytogenetika – studium evoluce
lidského karyotypulidského karyotypu
 založena na použití celochromozomových DNA
sond, které jsou hybridizovány na chromozomy
jiného druhuj
 např. chromozom 2 u lidí – fúze chromozomu 12 a
13 u šimpanze
 ZOO-FISH: hybridizace DNA různých živočišných
druhů
31
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Mnohobarevná FISH (M-FISH) a spektrální( ) p
karyotypování (SKY)
 Speicher et al., 1996 (M-FISH), Schröck et al., 1996 (SKY)
 vícebarevné FISH techniky – detekce více značených sond na jednomvícebarevné FISH techniky detekce více značených sond na jednom
preparátu
 v jedné hybridizační reakci simultánní vizualizace všech 22 autozomů
a chromosomů X a Y v odlišných barvácha chromosomů X a Y v odlišných barvách
 kombinatorní značení –
2 fluorochromy 3 sondy (= chromozomy)
3 fl h 7 d3 fluorochromy 7 sond
4 fluorochromy 15 sond
Počet kombinací: 2N - 1
32
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
M FISH a SKY
 hybridizace preparátu se směsí
24 chromozomově specifických
M-FISH a SKY
24 chromozomově specifických
celochromozomových sond
vzniklých kombinatorním značením
(5 fluorochromů)
 každá sonda je charakterizovaná
emisním spektrem, které umožňuje
identifikaci chromozomu
33
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
M FISHM-FISH
Mikroskop vybavený:
6 fl č í i ú k á ý i 6 fluorescenčními úzkopásmovými
filtry (pro 5 fluorochromů + DAPI)
 citlivou CCD kamerou
 specializovaným softwarem pro specializovaným softwarem pro
analýzu obrazu (např. Lucia MFISH,
MetaSystems Isis mFISH…)
Postup
 snímání jednotlivých fluorochromů
 složení obrazu
 počítačová analýza – dle kombinace
fluorochromů přiřazení pseudobarev
 vyhodnocení
34
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
M FISHM-FISH
Snímání jednotlivých fluorochromů, složení obrazu
http://www.lucia.cz/cs/front-page/lucia-mfish
35
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
M FISHM-FISH
Počítačová analýza – přiřazení pseudobarev, vyhodnocení
http://www.lucia.cz/cs/front-page/lucia-mfish
36
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Spektrální karyotypování (SKY)Spektrální karyotypování (SKY)
 mikroskop vybavený filtrem pro DAPI a specializovaným systémem
(interferometr) pro měření spektra emitovaného světla (GenASIs(interferometr) pro měření spektra emitovaného světla (GenASIs
HyperSpectral)
 emise fluorochromů (Spectrum
Orange, Spectrum Green, TexasRed,
Cy5, Cy5.5) snímána najednou
(rozdíl oproti M-FISH)
 systém měří spektrum pro každý pixel systém měří spektrum pro každý pixel
obrazu
 speciální počítačový program přiřadí
na základě měření vlnových délek
GenASIs HyperSpectral (Applied Spectral Imaging )
ý
každému páru chromozomů barvu, ty
se označují jako pseudobarvy
37
yp p ( pp p g g )
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Analýza obrazu pomocí software HiSKYAnalýza obrazu pomocí software HiSKY
7
7
7
12 12
7
7
12 12
Display Image Classified Image
Software automaticky rozliší chromosomy dle změřeného spektra a zobrazí je
38
v odpovídajících pseudobarvách – lze snadno rozlišit chromozomové páry
a případné chromozomální aberace. Automaticky sestaví karyotyp…
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
 Pacientovi diagnostikován neuroblastom. Pomocí SKY detekována translokace
t(11;22) specifická pro Ewingův sarkom → změna diagnózy a léčebnéhot(11;22) specifická pro Ewingův sarkom → změna diagnózy a léčebného
protokolu.
39
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
M FISH a SKYM-FISH a SKY
Výhody
dh l í b l ý h ř t b odhalení balancovaných přestaveb
 detekce aberací v jednom kroku
• kryptické translokace a inzerce
k h• marker chromozomy
• nadbytečný materiál neznámého původu
• komplexní přestavby
Nevýhody
 vyžaduje kvalitní mitózy – vhodný materiál, metodicky a časově náročné
 úspěšná hybridizace
 finančně nákladné
 nelze detekovat inverze, duplikace/delece menšího rozsahu
40
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Mnohobarevné pruhování
iál í l í d ifi ký h bl tí
Mnohobarevné pruhování
(M-banding)
 parciální malovací sondy ze specifických oblastí
chromozomů
 fluorescenční signály jednotlivých sond se podél
sledovaného chromozomu částečně překrývají asledovaného chromozomu částečně překrývají a
dochází k jejich kombinaci
41
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Mnohobarevné pruhování (M banding)Mnohobarevné pruhování (M-banding)
42
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Ch 5
 charakterizace místa zlomu
Chromozom 5
charakterizace místa zlomu
 rozlišení intrachromozomových přestaveb
43
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Komparativní genomová hybridizace (CGH)
H b idi t d l ž á t h i FISH
Komparativní genomová hybridizace (CGH)
Comparative genomic hybridisation
Hybridizace: metoda založená na technice FISH
Genomová: umožňuje v jedné hybridizační reakci detekovat nebalancované
změny v celém genomu; stanovit chromozomové změny vedoucí ke ztrátámzměny v celém genomu; stanovit chromozomové změny vedoucí ke ztrátám
(monozomie, delece) či zmnožení (zisky, amplifikace) sekvencí DNA
Komparativní: založená na porovnávání dvou genomůKomparativní: založená na porovnávání dvou genomů
44
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Vývoj CGH byl podnícen snahou o rozvoj cytogenetikyý j y p j y g y
solidních nádorů
Kallioniemi et al. 1992
CGH nevyžaduje mitotickou aktivitu zkoumaných
45
buněk – materiál pro CGH je DNA!
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Jednotlivé kroky metody CGHJednotlivé kroky metody CGH
 příprava normálních metafázních chromozomů (od zdravého jedince)
i l DNA ád if í k k t í dř ě (2 3 ) izolace DNA z nádoru, periferní krve, kostní dřeně (2–3 µg)
 značení testované a referenční (normální) DNA rozdílnými fluorochromy
(nick-translace, fragmenty 600 – 2000 bp)
 denaturace hybridizace značené DNA na normální metafázní chromozomy denaturace, hybridizace značené DNA na normální metafázní chromozomy
 snímaní metafáz (10-20) citlivou CCD kamerou pod jednotlivými filtry
 karyotypování chromozomů nabarvených DAPI
 statistické zpracování a počítačové vyhodnocení poměrů intenzit statistické zpracování a počítačové vyhodnocení poměrů intenzit
fluorescence podél jednotlivých chromozómů pomocí speciálního
programu
 místa s vyšší či nižší intenzitou fluorescence odpovídají oblastem zisků a ztráty p j
sekvencí DNA – profily
46
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Princip CGHPrincip CGH
Izolace a kvantifikace genomové
DNADNA
 v následujících krocích použito
stejné množství testované a
referenční DNA
Značení (nick-translace) vzorků
DNA odlišnými fluorochromy
 obvykle testovaná zeleně a
referenční červeně
Smíchání ekvivalentních
množství DNA a aplikace směsi
na metafázní chromozomy →
hybridizacehybridizace
 sondou je celogenomová DNA
47
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Princip CGHPrincip CGH
Ve směsi využita Cot-1 DNA
ři l tál í DNA
ReferenReferenččnnáá DNADNA CotCot––11 TestTestovanovanáá DNADNAReferenReferenččnnáá DNADNA CotCot––11 TestTestovanovanáá DNADNA
 připravena z placentální DNA
 potlačuje hybridizaci Alu a
dalších repetitivních sekvencí
Fragmentace značené DNA
 optimalizace hybridizace na
metafázní chromozomy
CotCot––11 potlapotlaččujeuje
hybridizhybridizááciuciu
repetitivnýchrepetitivných sekvencisekvenciíí
CotCot––11 potlapotlaččujeuje
hybridizhybridizááciuciu
repetitivnýchrepetitivných sekvencisekvenciíí
metafázní chromozomy
… následuje 48–72 h hybridizace, odmytí nenavázané sondy, podbarvení
chromozomů pomocí DAPI a snímaní pod fluorescenčním mikroskopem.
48
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Nasnímání mitóz citlivou CCD kamerou v
modrém, zeleném a červeném spektru → složený
obraz
ý é b é d h lk č jí řít t výrazné barevné odchylky naznačují přítomnost
chromozomových aberací
49
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Pomocí DAPI podbarvení se na chromozomech vytvoří pseudo G-pruhování
 identifikaci jednotlivých chromozomů – zobrazení jako karyogram
50
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Počítačová analýza obrazu: Zelená s červenouPočítačová analýza obrazu: Zelená s červenou…
Referenční DNA Testovaná DNA
++
51
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
enh  zisky, amplifikace
Interpretace výsledku CGH y, p
dim  ztráty, delece
heterochromatin l á i k
Interpretace výsledku CGH
heterochromatin zelená - zisk červená - ztráta
výsledný poměr
fluorescence
hranice 0,8
hranice 1,2
č. chromozomu
počet hodnocených
hodnota 1
p ý
chromozumů
52
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
rev ish enh (15q)rev ish enh (15q)
rev ish dim (17p,
18q, Y)
Uká k fil CGH éh čít č lý b i tUkázka profilu CGH zpracovaného počítačovou analýzou obrazu u pacienta
s CLL
53
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Sumarizace výsledků z více vzorkůSumarizace výsledků z více vzorků
 Identifikace
markerůmarkerů
onemocnění
 IdentifikaceIdentifikace
kauzálních
aberací
54
Souhrný výsledek CGH u 15 pacientů s neuroblastomem
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Výhody a nevýhody klasické CGH
Výhody
ž d j itó t t ý k
Výhody a nevýhody klasické CGH
 nevyžaduje mitózy pro testovaný vzorek
 poskytuje přehled numerických změn
v celém genomu v jedné hybridizační reakci
Nevýhody
 nemožnost využití u změn, při kterých se nemění
počet sekvencí – balancované aberacepočet sekvencí balancované aberace
(translokace, inverze)
 není vhodná k odlišení ploidie (normalizace)
 možnost identifikovat jenom změny přítomnéj y p
min. v 50 % buněk
 rozlišovací schopnost 10 Mb
 HR-CGH, aCGH
55
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Komparativní genomová hybridizace s vyššímp g y y
rozlišením (HR-CGH)
Kirchhoff et al., 1997
Princip HR-CGH:
l b t í t t j ý j k ří dě CGH laboratorní postup stejný jako v případě CGH
 odlišné vyhodnocování pomocí speciálního software – statistika!
(Laboratory Imaging s r.o., Praha)
 rozlišovací schopnost 4 Mb rozlišovací schopnost – 4 Mb
 klonální zastoupení – 30 %
56
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Porovnání výsledku CGH a HR CGH u pacienta s CLL
CGH HR-CGH
Porovnání výsledku CGH a HR-CGH u pacienta s CLL
rev ish enh (15q)
rev ish dim (17p 18q Y)
rev ish enh (15q)
re ish dim (4p 9p 9q12 13q14rev ish dim (17p, 18q, Y) rev ish dim (4p, 9p, 9q12, 13q14,
17p, 18q, Y)
57
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
DNA čipy
 skládají se z jednotlivých molekul DNA o
známé sekvenci (sondy) které jsou
DNA čipy
známé sekvenci (sondy), které jsou
upevněny ve shlucích (spoty) na pevném
podkladu (sklo, syntetické materiály)
 počet spotů se pohybuje od řádově stovek do počet spotů se pohybuje od řádově stovek do
desetitisíců podle typu čipů
 umožňují detekci chromozomových aberací,
mutací a polymorfizmů sekvenační analýzymutací a polymorfizmů, sekvenační analýzy
ale i studium genové exprese
 principem metody je hybridizace značené
vyšetřované DNA s imobilizovanými sondamivyšetřované DNA s imobilizovanými sondami
na čipu
58
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Aplikace DNA čipů
Analýza genomu
t iál á DNA
Aplikace DNA čipů
 materiál: genomová DNA
 array-CGH, SNP čipy, resekvenační čipy
E í f kč ě ifi ké t diExpresní a funkčně specifické studie
 mRNA, proteiny
(např. transkripční faktory)
Epigenetické studie
 ChIP-on-Chip
(vazba proteinu/komplexu(vazba proteinu/komplexu
na DNA)
59
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Array CGH
 Solinas-Toldo et al., 1997
há í i i kl i ké ( h ál í) CGH
Array-CGH
 vychází z principu klasické (chromozomální) CGH
 nahrazení chromozomů separovanými klony (BAC, c-DNA klony,
oligonukleotidy)
 duplikace delece amplifikace CNV(copy number variants) duplikace, delece, amplifikace – CNV(copy number variants)
 nedetekuje balancované přestavby

60
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Array CGH
Postup
I l DNA
Array-CGH
 Izolace DNA
 Kontrola kvality, stanovení kvantity
• Celogenomová amplifikace
N ště í DNA Naštěpení DNA
 Naznačení DNA - fluorescence
 Hybridizace
Od tí Odmytí
 Skenování
 Analýza dat
61
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Princip array CGHPrincip array-CGH
62
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Příprava DNA čipů pro techniku array CGH
5. Scanning
Příprava DNA čipů pro techniku array-CGH
6. Analysis and
interpretation
www.agilent.com
63
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Vyhodnocování array CGHVyhodnocování array-CGH
aCGH Analytics Software, Agilent Technologies
64
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Celogenomová analýza u pacienta s neuroblastomemg ý p
pomocí aCGH
1p36 delece a
MYCN amplifikace
65
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Rozlišení array CGH
1. Velikost klonů
Rozlišení array-CGH
Úseky genomové DNA vložené do vektorů
 BAC (Bacterial Artificial chromosome) - 50–200 kb
PAC (Ph A tifi i l h ) 75 200 kb PAC (Phage Artificial chromosome) - 75-200 kb
 Rozlišení ~ 1Mb
cDNA - 1-2 kb
P é bl ti Pouze genové oblasti
 Rozlišení - 1-2 kb
Oligonukleotidy - 25-85 bazí
R liš í d 1 kb Rozlišení pod 1 kb
 s krátkymi nebo dlouhými oligonukleotidy
 v současnosti nejrozšířenějším typem, použitelné
pro prakticky všechny aplikacepro prakticky všechny aplikace
66
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Rozlišení array CGH
2. Rozložení a vzdálenost klonů
Rozlišení array-CGH
Cílená aCGH – vybrané oblasti zájmu, např. mikrodelece, mikroduplikace
Chromozomově-specifická aCGH
C l á CGHCelogenomová aCGH
 sondy v určitých intervalech
 překrývající se – tilling arrays
Davies et al., 2005
67
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Agilent Human CGH Microarray
Oligo arrays
8x15K custom chip
Agilent Human CGH Microarray
4x44K 43 kb rozlišení
2x105K 21 kb rozlišení
1x244K 9 Kb rozlišení
Nové typy Sure Print G3 HumanNové typy – Sure Print G3 Human
8x60K 41 Kb rozlišení
4x180K 13 Kb rozlišení
2x400K 5 Kb rozlišení
1x1M 2 Kb rozlišení
del(1)(p36), cca 3 Mb
HRCGH
negativní
8x15K
negativní
4x44K
del(1)(p36)
2x105K
del(1)(p36)
68
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Array CGH
Výhody
ř hl d i ký h ě lé j d é h b idi č í k i
Array-CGH
 přehled numerických změn v celém genomu v jedné hybridizační reakci
 přesná lokalizace změn – vysoké rozlišení
N ýh dNevýhody
 neodhalí balancované aberace (translokace, inverze)
 neodhalí změny ploidie (např. tetraploidní nádor)
č á fi č í á č t časová a finanční náročnost
69
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Molekulární karyotypování – 1000x citlivější nežy yp j
klasická cytogenetika
! ALE ! Redukuje informaci o heterogenitě
analyzované buněčné populace
70
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Klinická cytogenetika:y g
Prenatální cytogenetická diagnostika
Vyšetřovaný materiál
k lti é i k lti é b ňk l d é d kultivované i nekultivované buňky plodové vody,
fetální krev, choriové klky
FISHFISH
AneuVysion Assay Kit (Abbott Vysis)
 trizomie chromozomů 13, 18, 21 (Patau, Edward, Down sy)
 vyšetření sestavy a počtu gonozomů (XX XY) vyšetření sestavy a počtu gonozomů (XX, XY)
Mikrodeleční syndromy
 DiGeorge sy (del(22)(q11.2))
Array-CGH:
 Celogenomový screening
71
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Prenatální cytogenetická diagnostikaPrenatální cytogenetická diagnostika
t(13;15)
trizomie
chr. 18Normální
buňky
72
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Klinická cytogenetika:y g
Postnatální cytogenetické analýzy
Vyšetřovaný materiál
ifé í l f t b kál í tě periférní lymfocyty, bukální stěry
 Mikrodeleční syndromy – FISH
DiG P d Willi/A l Willi B 1 36• DiGeorge sy, Prader-Willi/Angelman sy, Williams-Beuren sy, 1p36
mikrodeleční sy a další
 Původ marker chromozomů – CGH, SKY, WCP FISH
 Identifikace a specifikace numerických a strukturních chr aberací CGH SKY Identifikace a specifikace numerických a strukturních chr. aberací – CGH, SKY
 Detekce gonozomálních mosaik – FISH (X/Y sondy)
73
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
Postnatální cytogenetické analýzyPostnatální cytogenetické analýzy
SKY: identifikace marker
chromosomu (chr. 11)
FISH: DiGeorge syndrom
74
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika
75