Luminiscenční spektroskopie
•Fotoluminiscence
–Fluorescence
–Fosforescence
•Chemiluminiscence
–Bioluminiscence
•Elektro-, termo-, radio- aj.
•

Luminiscenční spektroskopie
excitace1
•    k1          k4          k5        k4          k3
•A ®  A*   ®  A*   ®  A+  ®  A+  ® A
•                       k2                                   k3
•              k4
•          A
•hn
•hn
•hn

Základní pojmy
•Stockesův posun – ztráty energie po dobu excitovaného stavu
•nm
•Dl
•F
•Absorpce
•Emise

Základní pojmy
2
•l3
•l2
•l1

Biochemicky významné fluorofory
fluorofory


Instrumentace
schémaflu


Instrumentace
schemafluo


Instrumentace
Shimadzu
•RF-5301PC – spektrofluorimetr Shimadzu

Podmínky fluorescence
polarita1
•Závislost na polaritě
polarita
•Nitrobenzoxadiazol
•Pokles polarity 6 – 1.

Podmínky fluorescence
•Závislost fluorescence na teplotě – též viskozitě
•20                40               °C
•F
•      80
•
•
•
•
•      40

Podmínky fluorescence
•Stabilita fluorescenčního signálu
•chininsulfátu
•40                80              min
•F
•      80
•
•
•
•
•      40

Podmínky fluorescence
•1 Rayleighův rozptyl (Tyndalův rozptyl)
•2 Fluorescenční emise
•3 Ramanův rozptyl
•1
•3
•2
•Excitace 450 nm
•Emisní spektrum
•450 nm
•600 nm
•3

Kvantitativní fluorimetrie
•Závislost intenzity fluorescence na koncentraci látky
•
•F = f (I, e, c, F)
•
•F = Io F [1 – 10-ecd] jestliže c ® 0
•
•F = Io F.2,3.ed.c
•
•F
•c

Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
•Přirozené fluorofory (Tyr, Try) – fluorescence závislá na polaritě prostředí obklopující
• fluorofor
•
•H2O
•
•H2O
•F
•nm
•Emisní spektrum

Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
•t (min)
•F310
•substrát
•
•

>

Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
fluosceinspek fluopH
•Fluorescenční konjugáty
•Karboxyfluorescein –
•(494/520 nm)
•Absorpce/emise
•fluoresceinu
•při pH 9
•CF
•OG
•CF-karboxyfluorescein
•OG oregon green
oregongreen
•Oregon Green - (496/524 nm)
karoxyfluo

Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
dansyl dansylspek benzoxadiazol
•Fluorescenční konjugáty
bezoxadiazolspek
•Dansylchlorid
•Benzoxadiazol –N-sukcinimid

Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
konjugace
•Fluorescenční konjugáty
konjug

Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
•Interakce makromolekul s ligandy
polarita
•F
•koncentrace makromolekuly
•Ligand volný
•Ligand vázaný
•L + M « LM
•
•Kd = [L]f.[Mf ]/[LM]
•

Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
parinar AOC16
•Interakce makromolekul s ligandy
•Použití fluorescenčních analogů
FluorescPL
•Kys. cis-parinarová
•Anthroyloxypalmitát
•Fluorescein-PE

Fluorescenční sondy
•
•
•
•
•
•
•ANS – 1,8-anilinonaftalensulfonát
•(zde kyselina)
•

Vazba ligandu - Scatchardův model
•                    Mf + Lf        ML (= Lb)
•
•Kas = [Lb] / ([Mf] . [Lf])  =   [Lb] / ([Mt](n-n) . [Lf])
•
•[Lb] / [Mt] = n,   [Lb] = n . [Mt],   Kas = n / (n-n) . [Lf])
•
•Kas . (n-n)  =  n / [Lf]    Kas . n - Kas . n  = n/ [Lf]
•

Scatchardův model
•Grafické
•Znázornění
•odpovídá
•nesedí

Použití fluorimetrie ke sledování vazby
•F = Ff + Fb
•
•F = [Lf] .Ff + [Lb].Fb
•
•F = ([Lt] – [Lb]).Ff + [Lb].Fb
•
•F = [Lt].Ff – [Lb].Ff + [Lb].Fb
•
•F = Fo + [Lb].(Fb – Ff)
•
•[Lb] = (F – Fo)/ (Fb – Ff)
•Ff, Fb – fluorescence volné,
•vázané frakce
•Fb, Ff –kvant. výtěžek fluorescence
•vázaného, volného ligandu
•[Lb], [Lf] – koncentrace vázaného, volného ligandu
•[Lt] – celková koncentrace ligandu
•F – celková fluorescence

Použití fluorimetrie ke sledování vazby
•Určení Fb – Ff
•
•F = [Lf] .Ff + [Lb].Fb – pro [Lb] = [Lt], [Lf] = 0
•
•1/F
•1/cM