20 1st Sl°nti^e 100 140 0.0 vícerozměrné separacni techniky Pokročilá kapalinová chromatografie IfjOl Jiří Urban, Ustav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz www.tjbiochip.com gelova elektroforeza pH Mr 97kD 66kD ^_ to O 45kD c O E E i_ 30kD SD O 20kD 14kD pH4 * 7 '*. '• r • t • # Commassie Blue Stain bacteria 2D Gel Electrophoresis www.tjbiochip.com bylo nebylo ... „ ...but the two-dimensional chromatogram is especially convenient, in that it shows at a glance information that can be gained otherwise only as the result of numerous experiments AJ.P. Martin Biochem J. 38 (1944) 224. Aminokyseliny z hydrolyzátu vlny První dimenze: 3 dny Druhá dimenze: 27 hodin e. coli digest 1 000 piku za 11 hodin Intens x10( 100 200 300 400 Time (min) 500 600 J. Chromatogr. A,l 217 (201 0) 6610 - 6615. id hplc Pump Autosampler Column Detector 1D Chromatogram První dimenze, ]r\ 2d hplc Pump Pump Auto sampler Column ^1 Detector Valve (optional) (Sampler) n c,2D Column Detector První dimenze, ]r\ Násobné zvýšení pikové kapacity 2D Chromatogram off-line Jednotlivé frakce se sbírají z Dl kolony, zakoncentrují se a dávkují se na D2 kolonu. on-line: heart-cut on-line: heart-cut Analýza nečistot mAU 80 40 o A11 3 4 Jí i [p N 1 1 1 1 1 1 16.2 16.4 16.6 16.8 i i i i i i i i| 17.0 17.2 Main peak with underlying 160-120 80-40-0— Main peak i i i i i i i i i i i i i i i i i 0 0.4 0.8 1.2 1.6 I i i i i I i i i i I i i I I I i I I i I I I i I I i i i i I 16.3 16.5 16.7 rrn Enlarged main peak with underlying impurities Main peak 40- 20 —I Impurity 1 0Í]r——W i i i I i i i i i i i i i i i i i 0 0.4 0.8 1.2 1.G 5-0--5 Main peak Impurity 1 U K—J Impurity 2 i i i I i i i i i i i i i i i i i 0 0.4 0.8 1.2 1.6 6^ 2 -2 -6^ Impurity 1 Main peak Impurity 2 i i i I i i i i i i i i i i i i i 0 0.4 0.8 1.2 1.6 comprehensive 2d-lc „Bezztratova" 2D-LC 1 st |ind j k from 2n d peak U&m 3rd pea k fro m 15tdimeri5iDn 1st dimension 1st dimension comprehensive 2d-lc Complex sample One-Dimensional Separation o0» c o ro Q. 0) c o C 0) T3 C CM Two-Dimensional Separation •o o 1st. dimension seoaration www.laboratory-journal.com ěrná chromatografie J. Chromatogr. A 11 89 (2008) 207-220 19773961 podrobnější o vzorku Sazenice kukuřice First dimension Majoritní složka [mAU] 3000- n-1 25 30 Time [min] Second dimension First dimension Minoritní složky -1— 10 -1-1 15 20 Retention time [s] 15 20 Retention time [s] 8875 zpracovaní dat 1D chromatogram (at first column outlet) I 2 ' 2. Transformation (at second column outlet) 3. Visualization 1) Modulace Kompletní převod Dleluátu do druhé dimenze (D2) 2) Transformace Zpracování dat poskytnutých detektorem druhé dimenze. 3) Vizualizace Prezentace dat pomocí obrysového nebo prostorového grafu. převod frakcí FROM COLUMN (1st DIMENSION) AUXILIARY PUMP LOOP 1 CD LOOP 2 TO COLUMN (2nd DIMENSION) 11 převod frakcí FROM COLUMN (1st DIMENSION) B AUXILIARY PUMP LOOP 1 LOOP 2 TO COLUMN (2nd DIMENSION) r r* 'f WASTE převod frakcí Dvě 2D kolony detector from column (1st dimension) from column (1st dimension) column (2nd nn j$ V p dimension) i ^ ^ column (2nd dimension) auxiliary pump detector column (2nd dimension) waste waste column |2N0 dimension) auxiliary pump frekvence převodu frakcí [AU] 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 X X 5 6 Time [min] Time [min] i—1—i—1—i—1—i—1—i—1—r 23456789 Time [min] Second dimension [s] A 7- (D) ts = 30 s. N = 4 —i—1—i—1—i—1—i—1—i—1—i—1—i 23456789 First dimension [min] Second dimension [s] 7 fDjfs=60 s.W=2 6 ' 5 4 31—1—i—1—i—1—i—1—i—1—i—1—i—1—i 2 3 4 5 6 7 8 9 First dimension [min] Second dimension [s] 7 (D;ís = 120 s. N= 1 23456789 Time [min] 23456789 First dimension [min] frekvence prevodu frakci U = 0.2 !a Ideal sampling IDO peaks B1 observed peaks U =2'a W=4 100 peaks 37 observed peaks Time Time U = 4 ;a N=2 1 DO peaks 23 observed peaks íi= B 'ff W=1 100 peaks 14 observed peaks Time Time optimalizace složení mobilní fáze ox vyssi signal 800 600 Time (min) Time (min) Valve switch-------- < J. Chromatogr. A 1360 (2014) 164-171. aktivní modulace Snížení eluční síly mobilní fáze (7xlDFJ D Pump Injector ~~l ]-UV Zakoncentrování píků LCxLC Waste D Pump HPLCxUHPLC r/rrr. TP HPLC/axm/UHPLC Analysis Time (min) Dilution Factor 1529 Eluent Volume (mL) 200 800 80 299 120 40 142 78 HILIC x RP Surfaktanty (tristyrylfenol ethoxylátfosphát (TSP)) HILIC: délka etoxylátového řetězce RP: míra substituce (styren, fosfát) d)» #• »iOooööÖCJßÖun»«»' • 10 ~° 8 4 - I 0 5 10 15 20 25 30 35 «0 'O Um* (mm) Anal. Chem. 88 (201 6) 1 785-1 793. ortogon alita Separation axis 2 Separation axis 2 Separation axis 2 ortogon alita Úplná korelace Částečná korelace Ortogonální separace Separation axis 2 Separation axis 2 Separation axis 2 Žádná přidaná informace Nejlepší pokrytí prostoru kvantifikace i Second dimension time [min] c i o 0 o 0 u c 'a 0 c cP o d 0 i , •p O 3 t o 0 3 o 8C > o C 5 c g. o 8 □ n % 0 } 0 0 Cis 45 o c c í > d ř Q J "i c 8 O o O 1*1 0 c o c CO £ r> D 8 0 o < 3 S J } - i 0 0.7 : G c 1 0 o ) ) 1 krers = D i c C 0 s 0 5 10 15 20 25 30 First dimension time [min] D6+4D typy 2d-lc separací Teorie Shluky Normalized second dimension retention 1.0 0.8 0.6 D.4 0.2 0 ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ A ♦ ♦ ♦ ♦ Normalized second dimension retention 1.0- 0.8 0.6 0.4 0.2 r a* 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Normalized first dimension retention 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Normalized first dimension retention „Bananagrams" Normalized second dimension retention 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 B ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ * ♦ ♦ ♦ * ♦ * > i* ♦ ♦ ♦ * ♦ ? 0.2 0.4 -1-1-1-1-1 0.6 0.8 1.0 Normalized first dimension retention Ideální ortogonalita Normalized second dimension retention 1.0 D 0.8 0.6 0.4 0.2 ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Normalized first dimension retention optimalizace Stationary phase; separation mechanism 1D column i.d. = 1-2mm; length = 10-20 cm; flow-rate = 0.05-0.1 mL/min Selection of columns Eluent with low retention power in 2nd dimension Stationary phase; separation mechanism 2D column i.d. > 2-10 cm; 0.5-5 mL/min; particle size = 1.7-3.5 pm/fused core particles/monolithic column www.chromatographyonline.com/comprehensive-two-dimensional-liquid-chromatography-lcXlc-review 2911 vliv kolony ve druhé Kinetex XB-C18, 50x3.0 mm, 2.6 pm 1.25 E 9 O 0-83 tur aut DUT h£1L "SL _ CM CHL c OJ 0.42 15 30 1st diamension time (min) .E 1.2 E, Q) | | 0.8 '35 c i E re T3 C 45 0.4 Express Phenyl-Hoxyl, 30><3.0 mm, 2.7 pm HA Ml M un aur •Ml ~ MOU mi.- 10 20 30 40 1st diamension time (min) 50 Kmetex PFP, 50*3.0 mm, 2.6 pm £ 1.2 E m E O 0.8 E S 0.4 c OJ c o E S "O C CM ho. -MOC HCU NOl EK '*- CHA 10 20 30 40 1st diamension time (min) 50 .E 1.2 g E Express RP-Amide, 30*3.0 mm, 2.7 pm 0.8 0.4 tariT sr. 10 20 30 40 1st diamension time (min) 50 J. Chromatogr. A 1268 (201 2) 91-101. A0D 99 kompatibilita NPLC RPLC HILIC IEX SEC GFC ^^^^ +++ + ++ + + + + + RPLC + +++ +++ +++ + + + + HILIC + ++ +++ + + + + + IEX - +++ + +++ - + + + ^^^^ +++ + ++ + + + + + GFC + +++ ++ +++ + + + + +++ velmi kompatibilní + možné, ale nesnadné ++ relativně kompatibilní - obtížné NPLC — normální fáze, RPLC — reverzní fáze, HILIC — hydrofilní interakce, IEX — iontová výměna, SEC - size-exclusion, GFC - gelová filtrace 2911 kompatibilita podmí Reverzní fáze (Dl) Zorbax Extend C18 column, 5 \xm, 150 mmx3.3 mm, 50-100% ACN za 1 1 0 min při 0.2 ml/min, 40°C. Normální fáze (D2) Separon SGX Amin, 5 \xm, 150 mm x 1 mm i.d., 5% 2-propanol v hexanu, 0.5 ml/min, 40°C. V f(max) <5\i\ J. Chromatogr. A 1087 (2005) 11 2-1 23. 2911 objem převáděné frakce Kolona ve druhé dimenzi Wexp' ^L z, 5 |iL z, 10 |iL z, 20 |iL Vf(max)' Chromolith Flash RP18-e (25 mm x 4.6 mm) 77 1.27 1.58 2.68 4 Poroshell 120 SB-C18 (30 mm x 3.0 mm, 2.7 um) 49 1.14 - - 4 Ascentis Express C18 (30 mm x 3.0 mm, 2.7 |am) 51 1.17 2.05 - 4 Kinetex2.6|aC18, 100A (50 mm x 3.0 mm, 2.6 um) 33 1.15 1.94 - 4 Kinetex2.6|aXB-C18, 100A (50 mm x 3.0 mm, 2.6 um) 33 1.03 1.67 1.79 5 Kinetex2.6|aXB-C18, 100A (30 mm x 3.0 mm, 2.6 um) 41 1.39 2.58 - 3 Ascentis Express C8 (30 mm x 3.0 mm, 2.7 |am) 48 1.38 - - 4 Kinetex2.6|aPFP, 100A (50 mm x 3.0 mm, 2.6 um) 38 1.16 - - 4 Kinetex2.6|aPFP, 100A (30 mm x 3.0 mm, 2.6 um) 54 1.63 2.61 - 2 Ascentis Express Phenyl-Hexyl (30 mm x 3.0 mm, 2.7 |am) 103 1.17 1.81 - 4 Ascentis Express RP-Amide (30 mm x 3.0 mm, 2.7 |am) 84 1.19 2 - 3 - štěpení píku z < 1.1 z — faktor rozšiřování píku z důvodu nekompatibility J. Chromatogr. A 1 268 (201 2) 91 -1 01. objem převáděné frakce 100n 90- 30- 70- 60- 50- 40 i— sampíe in 50% ACN >-sample in 100% ACN 5 10 T- 15 20 Kinetex C1 8 50 mm x 3 mm I.D., 2.6 |im Rychlé gradienty 0 - 100% acetonitrilu v 1 min při 2.5 mL/min. J. Chromatogr. A 1268 (201 2) 91-101. optimální 2d vnitřní průměr d = 2 3 V, f{max) 4ns0(l + ke) (LH) 4 = 0.98 V, f(max) i 12 (LH) 1 '4 Cent. Eur. J. Chem. 1 0 (201 2) 844-875. 2d klasifikace O 50 100 150 1st dimension time (min) I - polární fenolické kyseliny, II - fenolické kyseliny s dvěma -OH skupinami, III - fenolické kyseliny s jednou -OH skupinou a dvěma metoxy skupinami, IV - aglykosidové flavony, V - glykosidové flavony, VI - ostatní fenolické kyseliny s jednou -OH skupinou, VII - katechiny J. Chromatogr. A 1268 (201 2) 91-101. 2d klasifikace Transťomiation of S.B-carůtcnoids (i-carotene ([í.p—carolcncí Transfrinnatinn nf Hť-camtcnnids u-caroteiie ( B.t-carotc Jie) 1 i^-LTyp[(i.\LinLh:-: i :íui-iu-uI i ^^^^ i" □t-cryptovanth [a {mono-ol) tcivunihm (d.i-t>l) hitem (di-ol) i anlhcraxanlliin (di-ot 5,6-cpo\idc) EuleLn'5hó-epoKÍdír (di-ol 5,ů-epoKÍde) I mutalox&mfiin (di-ol 5,K-ef>oxiiJe) violaxanttiin (di-oL 5,6f5'Hů'-diepo?tide) neoxaníhin (lri-ůl 5r,6r-epoxide) flavoxanttiín {-di-oi 5, B-epoxide) Anal. Chem. 78 (2006) 7743-7750. 9 . ti. www.helloblend.com T6.T 85.3 93.8 IŮ2.3 I1D.S 919.1 I2T.9 136.4 [«.9 153.5 t„ (NP), min »S 17.1 m 31.1 43.6 i 1.2 511 53.! 151 HB3 110.1 II** 131.9 136* 1«.í Lil* tft(NP), min píková kapacita (izokratika gradient) Maximální počet píků, které lze rozdělit v rámci jedné analýzy 012345 012345 Time [min] Time [min] gradient v druhé Second dimension peak capacity 45-1 40-35-30-25-20-15-10-5-0- Re-equilibration time: 2s — 3s —4s Peaks/Second dimension cycle time [s'] 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 10 15 20 25 30 35 40 Second dimension gradient time [s] 5 o 10 15 20 25 30 35 40 Second dimension gradient time [s] 99 A0D gradient v druhé Full in fraction Cent. Eur. J. Chem. 1 0 (201 2) 844-875. A 1st Dimension time (mri) Dl - HS PEG, 1 50x2.1 mm, 5 |im, D2 - Ascentis Express CI 8, 30x3 mm, 2.7 |im, 1 00 |iL sampling loops. A0D gradient v druhé Dl - HS PEG, 1 50x2.1 mm, 5 |im, D2 - Ascentis Express Cl 8, 30x3 mm, 2.7 |im, 1 00 |iL sampling loops. A0D gradient v druhé Segment in fraction Cent. Eur. J. Chem. 10 (201 2) 844-875. 0 20 60 time [min] 100 120 129 if 0.86 : 0 r 1 043 OOQ 25 21 28 30 29-H^ 8 17 -5 20 15-r is-S5-rr 1 si Dimenswi time (min) 15 22 16 9d"S» 17 24 o O 23 18°* 19 ~» «5-Í2T Dl - HS PEG, 1 50x2.1 mm, 5 |am, D2 - Ascentis Express CI 8, 30x3 mm, 2.7 |im, 1 00 p± sampling loops. A0D vícerozměrné separace analýza protilátek 24 o B O. QC Infliximab originator MS SLSLSP Q SLSL3PG O 'o 4v©. NYYGS YDYWGQGTTLTVSSASTK 8 lD, RPLC min 65 24 Infliximab biosimilar MS SLSLSPG V-. i N*¥GS* YDYWGtiGTTLTVSSASTK 1D, RPLC min 65 +1 www.chromatographyonline.com budoucnost 2d lc Sample complexity [# of compounds] 10000 - 1000 - 100- 10- Isocratic 1D-LC 0.1 2D-LC is slower 2D-LC Gradient 1D-LC Gradient is slow 10 100 1000 10000 Analysis time [min] pro zájemce • '■ ■ •' • •• • • • • • • • • ••• • • • ■ • • Peter W. Carr and Dwight R. Stoll TWO-DIMENSIONAL LIQUID CHROMATOGRAPHY i PRINCIPLES. PRACTICAL Agilent 2015 AND APPLICATIONS Primer / http://www.agilent.com/cs/library/ \ / primers/Public/5991 -2359EN.pdf £i Agilent Technologies "Once your mind stretches to a new level it never goes back to its original dimension. " Abdul Kalam