Zkouška: - test + přednáška
• Úvod - Analýza proteinu
– Domény
• fold-struktura (ss, PDB)
• v PyMolu připravit 3D strukturu
• Interakce (IntAct)
– Komplexy
• Funkce
• Lokalizace
– evoluce
• Konkrétní nová data – článek (< 5 let)
Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat
poznatky z přednášek …
- komplexy podílející se na replikaci DNA
- komplexy účastnící se přepisu informace
- komplexy opravující poškozenou DNA
TFIIB
Rpb4/7
RNA pol II
TFIIE
TFIIF TFIIH
kvasinkový PIC komplex
Gibbons et al, PNAS, 2012
TBP
TFIIA
TRANSKRIPCE
- komplexy podílející se na replikaci DNA
- komplexy účastnící se přepisu informace
- komplexy opravující poškozenou DNA
- komplexy vytvářející strukturu chromosomu
- samotný chromosom je obrovským dynamickým
nukleoproteinovým komplexem (nikoli holá DNA)
TRANSKRIPCE
OPRAVA DNA
Co zde schází??
Chromatin = histony …
- Samotný chromosom je obrovským dynamickým
nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi
- DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými
komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený řetězec 1chromosomu cca 4cm!!)
Average human chromosome:
DNA molecule: ~4 cm
Mitotic chromosome ~4 µm
10 000x
Genome sizes:
human 3 billion bp 2 m
field bean 13 billion bp 9 m
trumpet lilly 90 billion bp 60 m
salamander <120 billion bp 80 m
- Samotný chromosom je obrovským dynamickým
nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi
- DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými
komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený řetězec 1chromosomu cca 4cm!!)
- komplexy vytvářející strukturu chromosomu
- vytváří základní strukturu
- nukleosomy – chaperony, remodelační komplexy
- histon H1, HP1 protein
- vytváří specializované domény
- centromery, telomery
- podílí se na dynamice struktury
- SMC komplexy - kohesin, kondensin a SMC5/6
přednášky prof. Fajkuse:
Struktura a funkce eukaryotických chromozomů (C9041)
Nukleosom
oktamer histonů
H2A, H2B, H3, H4
histon fold
komplexy vytvářející strukturu chromosomu
starý model
30nm coil
Figure 4-72 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
starý model
(hierarchie)
30nm coil
- 146bp – histon fold - centrální část DNA váže tetramer H3-H4
- okraje DNA vážou dimery H2A-H2B
- 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice H3 (acetylovaný K56)
Skládání histonů do nukleosomu
(komplexu)
- 146bp - centrální část DNA váže tetramer H3-H4
- H3 dimerizuje přes postraní šroubovici
- okraje DNA vážou dimery H2A-H2B
- 10bp konce DNA vážou šroubovice H3
(acetylovaný K56)
Ransom et al, Cell, 2010
H3-H4
Figure 4-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Sestavování nukleozomu:
- Silnější je interakce mezi H3-H4
- H3 dimerizuje přes postraní šroubovici a
vytváří tetramer který asociuje s DNA
- dimery H2A-H2B se vážou následně z obou
stran tetrameru (H3-H4)2
- při uvolňování odpadají nejdříve dimery H2A-
H2B
- H2A a H3 existují ve více variantách, které
mohou být zaměněny v nukleosomu
Ransom et al, Cell, 2010
Nabalování a rozbalování histonů
(opačné barvy)
H3-H4
ASF1
(antisilencing function)
interferuje s
tetramerizačním
povrchem
skládání (assembly i
disassembly)
Wang et al, Prot Cell, 2015
PDB: 5C3I
H3-H4
H3-H4
ASF1 (antisilencing function) interferuje s tetramerizačním povrchem
CAF-1
(chromatin assembly
factor)
interferuje s vazbou k
DNA
skládání (assembly i
disassembly)
Song et al, G&D, 2008
PDB: 3C9C
H3-H4
CAF-1 (chromatin assembly factor) interferuje s vazbou k DNA
FACT (facilitates chromatin transcription)
složen ze 2 podjednotek (Spt16 a Pob3/SSRP1)
interferuje s vazbou H2A/H2B na DNA …
Hondele et al., Nature, 2013
Kemble et al, Mol Cell, 2015
PDB: 4KHA
FACT (facilitates chromatin transcription)
složen ze 2 podjednotek (Spt16 a Pob3/SSRP1)
interferuje s vazbou H2A/H2B na DNA i s H3/H4 interakcí
Hondele et al., Nature, 2013
Kemble et al, Mol Cell, 2015
-10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice H3 (acetylovaný K56)
- nově syntetizované H3 (replikace) jsou acetylované na K56 – jsou specificky
rozeznávány a zainkorporovávány CAF-1 komplexem - acetylace K56
(šroubovice) interferuje s vazbou na DNA (cca 8x slabší)
Ransom et al, Cell, 2010
Histon chaperony - replikace
- na ssDNA nukleosomy nejsou: replikace, transkripce, oprava DNA ...
- před těmito procesy se musí histony odstranit a poté zase nabalit …
(feedback: inhibice chromatin assembly inhibuje disassembly nukleosomů)
- ASF1 (váže MCM, disassembly) + CAF1 (váže PCNA, assembly) pro H3H4,
FACT (váže MCM - disassembly)
250-300bp – cca nukleosom
H3K56Ac
-10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice H3 (acetylovaný K56)
-pozice nukleosomu je náhodná a následně je „upravená“ pomocí
remodelačních komplexů (a teprve poté je H3 K56 deacetylován a stabilizován)
Histon chaperony
- nově syntetizované H3 (replikace) jsou acetylované na K56 – jsou specificky
rozeznávány a zainkorporovávány CAF-1 komplexem
- acetylace K56 (šroubovice) interferuje s vazbou na DNA (cca 8x slabší)
- pozice nukleosomu je náhodná a následně je „upravená“ pomocí
remodelačních komplexů (a teprve poté je H3 K56 deacetylován a stabilizován)
- pozdější acetylace (Gcn5-HAT) rozvolňuje nukleosomy v místech transkripce
Figure 4-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Histonové varianty
(u kvasinek H2A
fosforylovaný H2A)
Variantní histony mohou vyznačovat hranice chromozomálních domén.
(A) Typický chromozom vykazující doménové členění. (B) V kvasinkách
brání H2A.Z šíření umlčeného chromatinu do sousedních oblastí…
(D) Centromerické nucleozómy obsahují centromerickou variantu H3.
Variantní histony
- CenH3/CENP-A … specificky v centromerách
- H2A.Z - v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu
(integrita centromer a telomer)
Figure 4-48 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
specifický chromatin s CENP-A histonem kotví kinetochory tah
mikrotubulů (a kohesiny) zajišťují správnou segregaci v
anafázi
Repetitivní sekvence vytvářející
specifický chromatin – CENP-A
histon, který kotví kinetochoru
(kolem je pericentromerický
heterochromatin a SMC
komplexy)
tah mikrotubulů a kohesiny
zajišťují správnou segregaci v
anafázi
Centromery
Ransom et al, Cell, 2010
- poškozená DNA signalizuje/spouští
„DNA damage checkpoint“ - kinasy
- H2A.X varianta je fosforylována (v
okolí poškození ~50kb během 15min;
H2A u kvasinek)
- po opravě poškození je H2A.X
vyměněn FACT komplexem za
nefosforylovaný H2A.X (a H2A)
- nefosforylovaný H2A.X je chráněn
před FACT ribosylací (PARP1)
- H2A.Z varianta je zainkorporována v
okolí poškození (SWR a Chz1) a
pomáhá resekci DNA
- ukončení opravy je signalizováno až
dokončením chromatinového vlákna
Oprava poškozené DNA – H2A histony
Tsabar & Haber, CO in GD, 2013 H3K56Ac - positioning
Oprava poškozené DNA - chromatin
Upravené z Tatum & Li, 2011
- na ssDNA nukleosomy nejsou … oprava DNA
- před těmito procesy se musí histony odstranit a poté zase nabalit …
- pro malá poškození (NER, BER) postačí menší změny chromatinu zatímco
pro větší (DSB - resekce DNA tj. vznik ssDNA) musí nukleosomy odstranit
- NER (BER) doprovázeno acetylací histonů a remodelací (posuvem)
- při DSB musí být odstraněny nukleosomy pomocí ASF1, CAF-1 a FACT,
aby mohlo dojít k účinné resekci (patrně fyzicky spojené procesy)
- po opravě poškozené DNA jsou nukleosomy uloženy zpět (díky interakci
PCNA s ASF1 a CAF-1 – i zde je H3 K56 acetylován)
- Sgs1/BLM interaguje s CAF-1 a reguluje jeho funkci
- až kompletní reassembly chromatinu signalizuje dokončení opravy!
Sabarinathan et al, Nature, 2016
- pro malá poškození (NER, BER) postačí menší změny chromatinu zatímco
pro větší (DSB - resekce DNA tj. vznik ssDNA) musí nukleosomy odstranit
- NER (BER) doprovázeno acetylací histonů a remodelací (posuvem)
- nová studie ukazuje, že NER je méně účinný (DNA je méně přístupná) v
místech okupovaných nukleosomy (a transkripčními faktory)
Billon a Cote, BBA, 2012 Bao, Snapshot-Cell, 2010
Remodelovací komplexy
- ATP-dependentní remodelace (SWI2/SNF superrodina)
- „sklouznutí“, rozložení, odstranění nukleosomu nebo „výměna“ histonových
dimerů
SWR komplex specificky zaměňuje (Exchange) H2A-H2B dimer za H2A.Z-H2B
bromodoména
- „sklouznutí“, rozložení, odstranění nukleosomu nebo „výměna“ histonových
dimerů
Bao a Shen, Snapshot in Cell, 2010
- INO80 komplex sliding + zaměňuje H2AZ-H2B dimer zpět za H2A-H2B
RSC remodelovací komplexSNAPSHOT,Cell(144),2011
RSC (SWI/SNF) komplexy obklopí nukleosom (rozvolní se vazba s DNA a posouvá se)
Gerhold a Gasser, TiCB, 2014
- RSC (SWI/SNF) komplexy obklopí
nukleosom (rozvolní se vazba s DNA a
posouvá se)
- nukleosom je zavěšen na SWR-C
komplexu – komplex váže ještě dimer,
který je schopen vyměnit
- nukleosom je uchopen INO80
komplexem (přes podobné složení
podjednotek – fungují odlišně)
Mitotic
chromosome
interphase
chromatin
Chromatinové vlákno
nový model
1.
4.
5.6.
7.
3.
2.
4. Loops make TADs2. string with nucleosomes
1. DNA strand.
3. string makes loops 5. TADs cluster to compartments
chromatin fiber … compartments (hetero- and euchromatin) …
Interphase chromatin fibers in nucleuscondensed mitotic chromosomes in nucleus
cell
cycle
chromosome figure (hetero- and euchromatin) …
nový model
30nm coil
Bednar et al, Mol Cell, 2017
Zhou et al, PNAS, 2013
Cutter a Hayest, FEBS Let, 2015
Woodcock a Ghosh, CSHPB, 2010
Ou a spol, Science, 2017 – cryoEM chromatinu
https://players.brightcove.net/53038991001/Byx2STOH0
_default/index.html?videoId=5522198641001
3. Chromatin fibers – disordered 5-24nm diameter chain
(žádný 30nm coil)
heterochromatin protein HP1 - spojuje
Machida a spol, Nmol Cell, 2018
4. Loops make TADs2. string with nucleosomes
1. DNA strand.
3. string makes loops 5. TADs cluster to compartments
nový model
3. Chromatinová vlákna vytváří smyčky – transcription loops – CTCF,
cohesin …
Chromatin loops may cluster in TADs (topologically associated domains hundreds
of kbps) – cohesin – (Schwarzer et al, Nature, 2017; Haarhuis,
EMBO J, 2017)
Bonora et al, CO in GD, 2014
Kohesin interaguje s CTCF …
- CTCF „izoluje“ transkripční
faktory a reguluje trankripci
- interaguje s kohesinem a podílí
se na utváření vyšších
chromatinových struktur
Carlsten et al., TiBS, 2013
… a kohesin interaguje s mediatorem
- mediator interaguje s GTFs a
RNA polymerázou
(zprostředkuje interakce mezi
GTFs a aktivátory transkripce)
- kohesin interaguje s
mediátorem a napomáhá tvorbě
transkripčních smyček
Song et al, Genomics and Informatics, 2017
Bonev a spol, NRG, 2016
Schoborg et al, CMLS, 2014
cohesin (SMC1/3) complex assists in looping (loop extrusion model) of
transcription loop units – interacts with CTCF, mediator … different looping
may result in different transcription outcome (influences cell differentiation)
4. Chromatin loops may cluster in TADs (topologically associated domains) –
cohesin dependent
Bodnar and Specter, Cell, 2013
Phillips-Cremnis et al, Cell, 2013
Schoborg et al, CMLS, 2014
- kohesin se podílí na regulaci
„cell-specific“ transkripce a
chromatinové struktury
(ukazuje se jak úzký vztah
mezi těmito úrovněmi existuje)
- kombinace interakcí kohesinu
s CTCF a mediátorem jsou
klíčové pro „buněčnou
specificitu“ (např. diferenciace
kmenových buněk)
SMC6 SMC5
- SMC jsou nezbytné pro
vytváření chromatinových
smyček
- podílí se na regulaci
segregace chromosomů a
na opravě DSBs
- složení SMC komplexů
- dlouhá ramena SMC,
dimerizace přes hinge,
ATPase heads
přemostěny ATP a
kleisinovou podjednotkou
- SMC proteiny vytváří
kroužky, které drží DNA
Haering and Jessberger, Exp Cell Biol, 2012
Komplexy SMC
Složení:
SMC dimery (homo- a hetero-) - konzervovanější (starší) než histony
non-SMC podjednotky (2 – 6)
Prokaryota Eukaryota (esenciální)
homodimer 2x
Marston AL, Genetics, 2014
Loading přes hinge, exit přes
head dvěma způsoby – štěpením
kleisinu nebo ATP-řízený
- regulace acetylací SMC3
- regulace fosforylací Scc3
Remeseiro & Losada, CO in Cell Biol, 2012
Cohesin makes up chromatin loops and TADs
Raoatal,Cell,2017
CTCF
cohesin loop
5. TADs cluster to compartments - formed by Mbps loops (not cohesin)
Bonev a spol, NRG, 2016
TAD transition to different compartment may result
in different transcription outcome (influences cell
differentiation) – euchromatin vs heterochromatin
Dekker a spol, Nature, 2017
Bonev a spol, NRG, 2016
nucleolus is specialized territory with rDNA repeats
– ribosome assembly …
interphase
nucleus – some
territories visible
euchromatin vs
heterochromatin
6. One chromatin fiber (chromosome) occupies
certain territory – specific territories
One chromatin fiber (chromosome) occupies
certain territory
Dekker a spol, Nature, 2017
Bonev a spol, NRG, 2016
Each chromatin fiber/chromosome occupies certain territory in the interphase
nucleus – then, in mitosis, it condenses to typical chromosome figures –
condensin I and II (SMC2/4)
interphase
nucleus – some
territories visible
prophase nucleus
– condensed
(condensin II)
chromosome figures
Kschonsak a Haering, BioEssays, 2015
Kondensin II vytváří lineární smyčky
(osová komprese), zatímco komplex I
kondensuje laterálněHirano, CSHPB, 2015
Dynamika chromatinuDr. Grobsky
Haeringetal,MolCell,2002
SMC1 Scc1/Rad21
SMC3 Scc3
Losada&Hirano,2005,Gen&Dev
cohesin
Mannini et al, Hum Mut, 2013
Remeseiro & Losada, CO in Cell Biol, 2012
mutace podjednotek kohesinu a jeho
regulačních faktorů způsobují
kohesinopatie (např. Cornelia de Lange
syndrom = transkripční defekt) a různé
typy nádorů (defekt segregační – 95%
nádorů je aneuploidních)