Komplexy spojené s transkripcí
DNA-vazebné motivy specifických transkripčních faktorů Obecné TFII komplexy, histon ... a proces transkripce
- velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům oc-šroubovice a má exponované vazebné skupiny
- nejčastěji interaguje Arg (pozitivní náboj + vodíkové vazby)
transcription factors
ofeukaryoticcells
3 This protein complex makes rt easier for RNA polymerase to attach to the promoter and start transcribing a gene.
RNA polymerase
5 MethytatKxi, the addition of a methyl group to the C nucleotides, prevents CTCF from artach ng to the insulator, CTCF ^ turning it off, allowing the
{CCCTC-bfiding factor)     enhancers to bind to the promoter.
Zipper typ Helix-turn-helix Zinkový prst Histon, HMG-box
p-barrel
p-hairpin/ribbon Smíšené oc/p
Velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům oc-šroubovice a má exponované vazebné skupiny
Nejčastěji interaguje Arg (pozitivní náboj + vodíkové vazby)
Průběh transkripce - skládání komplexů
- histony vážou DNA sekvenčně nespecificky
- histonové podjednotky (H2A, H2B, H3, H4) obsahují svazky 3-4 šroubovic skládaných proti sobě (histon fold)
- DNA se obtáčí kolem válcovitého oktameru (2x4 histony)
- šroubovice se vážou na cukrfosfátovou kostru DNA
3 A FA
Sestavování nukleozomu:
klíčová interakce mezi dvěma H3-H4 dimery je zprostředkována histonem H3
Dimery H2A-H2B se vážou následně z obou stran tetrameru (H3-H4)2
Povrch/kontakt tvoří lysiny a argininy
H2B/H2A
two dimers
bindtoH3-H4
tetramer
N N
Figure 4-26 Molecular Ekology of the Cell (© Garland Science 2008)
- H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer
- H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer - vazba na DNA
H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer dimery H2A-H2B (H2A-váže H3)
H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer dimery H2A-H2B (H2A-váže H3)
^) |80° H3/H4 váže jedno vlákno, ale
McGinty a Tan, Chem Rev, 2015
■ H3  Bl-M     H2A      H2B ■ DNA
info o komplexech/PPI (vizuální, typy vazeb) (PDBsum - detailní info)
(krystal lidského nukleosomu - 3AFA)
Go to PDB code:
3afa
go
Top page % Próteu
i DNA/RNA
Metals^^ftp^ro^l % Pores # Links
P rote i n-P rote i n interfaces for 3afa
Interfaces summary for 3afa
JH3
PDB id
3afa
■
Interface statistics
Chains	No of interface residues		Interface area (Á')	No. of salt bridges	No. of disulphide bonds	No. of hydrogen bonds	No of non-bonded contacts
©X©	43	42	2417:2524	-			246
c><@	12	13	692:576	-			47
©H©	11	13	710:671	-			B
©K©	9	9	496:453	-			73
©X<t,	8	7	450:452	-		4	34
©Hit,	4	4	257:238	-			40
©X©	47	52	2522:2530	1		19	296
&L L	47	52	2431:2494	-			262
CH©	13	12	672:708	-			48
©R©	7	7	437:426	-			33
t, HC	3	4	128:136				16
CHC	3	1	52:73	-			7
©R©	4	3	216:247	-			25
© c	50	46	2525:2593	-			271
	9	9	490:458	-			72
1
6J
Postscript version
Key:
Salt bridges
Disulphide bonds
Hydrogen bonds
Non-bonded contacts
Konce histonů
- N- a C-konce histonů vybíhají z jádra nukleosomu a ovlivňují jeho vazbu
- modifikace (napr. acetylace) mohou oslabit interakce s DNA a rozvolnit nukleosom - mohou vázat jiné proteiny (napr. bromodoména)
Konce histonů
- N- a C-konce histonů vybíhají z jádra nukleosomu a ovlivňují jeho vazbu
- modifikace (napr. acetylace,) mohou oslabit/posílit interakce s DNA nukleosom - značky pro vazbu proteinů
■ H3  1H4     H2A  ■ H2B DNA
Modifikace histonů
- napr. acetylace lysinu (změna náboje) oslabí interakci s DNA a rozvolní vazbu oktameru (zpřístupní DNA pro TBP)
- následně se TFIID váže na Ac-H4 (K8, K16) prostřednictvím bromodomény TAF1 proteinu (reader/writer/eraser)
*****
SSRGRQSGKARAKAKTRSSRAGLQFFVGRV-1        5       9       13 15
A H2A
v
k
119
p M
A   IA A     I A
x   it i     i i
pepaksapapkkgskkavtkaq.kkdgkkrk-
1
5
12 1415 2 0 2324
A H2B
120
A        A Am
i P      M   Ti        m    m| p M
aÉtkqtarkstggkaprkqlatkaarksapatggvk-
2   4 910      14    1718 23   262728 36
p   M  A     A        M       A M
sgrgkggkglgkggakrhrkvlrdniqgit-1   3   5      8       12      16 20
79
?
79
J L
J
N-terminal tails
globular domains
M methylation      P phosphorylation     A acetylation      u ubiquitylation
Molecular Bioioav of the Cell (€> Garland Science 2008)
H3
H4
(B)
bromodomain    subunit of TFIID
\ /
historie H4 tail
- AP-1/IRF-3/IRF-7/NF-kB pokrývá sekvenci -102 až -47 básí upstream od TSS = tj. mezi nukleosomy (nukleosom-free oblast)
- nukleosom downstream zakrývá TATA-box
- všechny podjednotky (TA domény) enhanceosomu interagují s CBP/p300 acetylásou a acetylace nukleosomu vede k jeho remodelaci/přemístění a uvolnění TATA-boxu
- uvolní se TATA-box pro vazbu TBP/TFIID a RNA polvmerasy II
sekvence DNA může být zcela zakryta nukleosomem nebo může být přístupná nebo může být v oblasti mezi nukleosomy
(a)
Inaccessible GR binding site
(b)
Histone-DNA contact sites
5 bp DNA insert
Accessible GR binding site
Transkripční faktory NF-Y
(podjednotky B a C ) obsahují histon-fold a vážou se sekvenčně nespecificky na cukrfosfátovou kostru jako histony
- DNA se v důsledku vazby ohýbá podobně jako v nukleosomech
- NF-YA podjednotka rozeznává CCAAT sekvenci pomocí oc-šroubovice (interkalace do MŽ)
H2B/H2A NF-YB/NF-YC
Nardini et al., Cell, 2013
NF-YA
A1A2-Imker
NF-YA podjednotka rozeznävä CCAAT sekvenci pomoci oc-sroubovice (interkalace do MZ)
ü
ü <D
Q.
(/> ><D
c
>ü c CD >
o ü
0> Q.
(0 CD
c
>o c >ü c (1) >
(0
PQBT AJ <«)
NUCPLOT
i   [ *ttT7 h
r rr^ iJ
XL ü
«c ü
CD Q. W 0)
c
><D C
>ü
c
(1) >
(1)
«3
Nardini et al., Cell, 2013
Promoter
Inactive
PotE<m
Activ«
NF-Y } QNA «mplqi
- nevytváří oktamer, ale NF-YA/YB/YC trimer
- NF-Y se váže přes histon-fold a nahrazuje nukleosom
Tfanscflpllon
▼ MtHiuUü
\
r
Nardini et al., Cell, 2013
TBP-associated factors = TAF (podjednotky TFIID komplexu mají histon-fold (HF), ale nevytváří oktamery)
Core:
Histon-fold doména se neváže na DNA (podílí se C-konec)   Shao et ai, mcb, 2005
- TAF4, 6, 9 a 12 obsahují histon-fold a jsou ve dvou kopiích (nikoli v dimerech) v „core" části TFIID komplexu
- TFIID komplex a TBP jsou klíčové pro rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení transkripčního systému
Bieniossek et al., Nature, 2013      spekulativní (viz Louder et al, Nature, 2016)
Velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům oc-šroubovice a má exponované H-vazebné skupiny
Nejčastěji interaguje Arg (pozitivní náboj + vodíkové vazby)
Další vazebné motivy (p-listy, hydrofobní AMK, malý žlábek)
Zipper typ Helix-turn-helix Zinkový prst Histon, HMG-box
p-barrel
p-hairpin/ribbon Smíšené oc/p
histon
Bend
HMG
Kink
- HMGB (HMG-box) obsahuje 3 šroubovice uskupené ve tvaru L -1. a 2. šroubovice váže cukrfosfátovou kostru a báze v MŽ
- interkalace aromatických AMK způsobuje ohnutí DNA
H Mike
A T-hook region
HMGA
HMGB
lis  n i
+ + + +
HMG-box
- ohyb a rozvolnění párování dsDNA může napomáhat procesům replikace, transkripce a r e ko m b i n ace/o p r a vy poškozené DNA
- ohyb napomáhá přiblížení vzdálených míst nebo zpřístupňuje DNA pro transkripční faktory
Stros, BBA, 2010
HMG-D (1E7J)
Aromatické aminokyseliny se interkalují do MŽ a vytváří kink
-1. a 2. šroubovice váže cukrfosfátovou kostru a báze v MŽ - interkalace Phe (aromatický kruh) způsobuje ohnutí DNA
Current Opinion in Genetics & Development
- ohyb napomáhá rozvolnění struktury chromatinu tj. moduluje pozici nukleosomů
- ohyb může pomáhat TBP a iniciaci transkripce
- pomáhá zpřístupnit DNA pro transkripční regulátory
AP-1
NF-kB
3   ftTF-2Yc-JunllRF-3A;lSF-7B IRF-3Í^
5' TAJ 11 T-
vxnzv
IFN-p enhanceosom
* "TTTTi::.:.TTTc::-^CTTCA-7TTTC"-':c-.":r
▲ A
3BDT
HMGA-1
transkripce
- HMGAla se váže na 4 místa a (ohýbá DNA) napomáhá sestavení enhanceosomu
- není ale součástí finálního komplexu - AP-1/IRF-3/IRF-7/NF-kB, který se váže na nukleosom-free oblast
- všechny podjednotky (TA domény) enhanceosomu interagují se SÁGA (obsahuje acetyltransferásu a TFIID - sestavení komplexu iniciace transkripce) a CBP/p300 acetyltransferásami, které acetylují sousední nukleosomy - jejich remodeling/přemístění uvolní TATA-box pro vazbu TBP/TFIID a RNA polymerasy II a iniciuje transkripci
Pol II Holoenzyme
viz dále iniciace transkripce
nzyme
^m Poi I
J        0r Holoenzv
6WI/SMF
Pol II Holoenzyme
Agalioto et al, Cell, 2000
Panně, CO in SB, 2008
TFT3D
Motivy DNA vazebných domén
Zipper typ
- Leucinový zip
- Helix-loop-helix
Helix-otáčka-helix
- Winged helix
Zinkový prst
- (3(3a zinc-finger
- Hormon-receptor
- Loop-sheet-helix
- Gal4
Histon, HMG-box
(3-hairpin/ribbon p- barrel Enzymy
a-šroubovice
33. Integration host factor (1 ihf)
p-listy
- Inzerce Pro mezi baze a ohyb 31. Met repressor (1 cma) DNA
Motivy DNA vazebných domén
Zipper typ
- Leucinový zip
- Helix-loop-helix
Helix-otáčka-helix
- Winged helix
Zinkový prst
- (3(3a zinc-finger
- Hormon-receptor
- Loop-sheet-helix
- Gal4
Histon, HMG-box (3-hairpin/ribbon p- barrel
oc-šroubovice
p-listy
OB-fold
(oligonucleotide/oligosacharide
binding)
- 4-5 anti-paralelních p-listů (p-barel) zakončeno oc-šroubovicí (kompaktní)
- vytváří úzkou jamku pro jednořetězcovou ssDNA (RNA, oligosacharidy)
- váže 2-5 nukleotidů (báze, cukry i fosfáty)
- SSB/RP-A a TRF proteiny (replikace, HR, telomery ... Dr. Kolesár)
Více OB - RPA70 (A+B) vytváří prodlouženou lineární kapsu
rpa
cst
atrip, rad9, MRE11, p53   - oprava DNA
N
dbd-adbd-b dbd-c
nespecifická vazba
dbd-d^
tm
r
pot1-tpp1
rpa70
rpa32
rpa14
- protein-proteinové interakce (integrita komplexu + interakce s dalšími proteiny/komplexy)
- Dr. Spirek
OB1 OB2
OB3
m:
ob1 ob2
TTAGGGTTAG-specifická vazba
CTC1 (edd 3 v kvasinkách)
STN1 CST komplex (RPA-like) - regulace telomer teni (obsahují ssDNA)
; 9
pot1
tpp1
Telomerase
- část komplexu SHELTERIN
- chrání telomery (aby nebyly považovány za DSB, reguluje přístup telomerásy)
Flynn a Zou, CR in BMB, 2010
rpa32n
RPA32
RPA7Ü
vfřYM dbd-d |v)rpa32c|
43 m 4171 2Ü5—57(
RľA70N\/DBD-A v
I
110    181   290 301   4ľľ Mo
:pai4|
17o - protein-proteinové interakce (integrita komplexu)
- celý komplex ~30nt
Centrální část RPA komplexu (1L10) a model celého komplexu
Bochkareva et al, EMBO J, 2002 Flynn a Zou, CR in BMB, 2010
TATA-box vážící protein (TBP)
klíčový pro sestavení preiniciačního komplexu (PIC)
start of transcription
10 anti-paralelních p-listů pokrývá MŽ
Interkalují se postranní řetězce Phe (hydrofobní v.)
vytváří ohyb (kink) a rozplétá dsDNA \
Konsensní sekvence: TATA( A/T) A( A/T) (A/G)
TBP a TFIIA (ß-barrel - neovlivní DNA strukturu) inh2
- TFIIA (2 podjednotky) komplex interaguje s TBP a DNA a zajišťuje jeho správnou pozici
- brání represorům v inhibici vazby TBP na TATA-box (ko-aktivátor některých sekvenčně specifických trans, faktorů)
- p-barrel váže DNA (neovlivňuje strukturu)
Liljas a
Začátek/iniciace transkripce -TFIID (nukleace komplexů^
Figure 6-16 Molecular Biology of the Cell
o a
u
V)
2
St
Irt l_
i
I
r. li
0
1
u
Table 6-3 The General Transcription Factors Needed for Transcription Initiation by Eucaryotic RNA Polymerase II
ROLES IN TRANSITION INITIATION
HI
TFIID TBP subunit TAF subunits
TFIIB
TFIIF TFIIE TFIIH
NUMBER Oi SUBUNITS
1
13
3 2 9
recognizes TATA box
recognizes other DNA sequences near the transcription start point; regulates DNA-binding by TBP
recognizes BRE element in promoters; accurately positions RNA polymerase at the start site of transcription
stabilizes RNA polymerase interaction with TBP and TFIIB; helps attract TFIIE and TFIIH attracts and regulates TFIIH
unwinds DNA at the transcription start point, phosphorylates SerS of the RNA polymerase CTD; releases RNA polymerase from the promoter
■
TFIID is composed of TBP and -11 additional subunits called TAFs (TBP-associated factors); CTD, C-terminal domain.
Plus TFIIA
- TFIID (SÁGA) komplex s TBP jsou klíčové pro rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení transkripčního systému (nukleace PIC)
TATA box f
start of transcription
Pol II Holoenzyme
TBP TFIID
TFIIB
- po připojení všech podjednotek TFIID komplexu včetně TBP vzniká funkční holokomplex - TAFs vážou transkripční faktory, epigenetické značky ... např.tafi
se váže na Ac-H4
(B) TAF1 bromodomain    subunit of
8
16 /
histone H4tail
- TFIID (1 MDa, TAFs) komplex a TBP jsou klíčové pro rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení transkripčního systému (nukleace PIC) Bieniosseketai.,Nature,2oi3
Preinitiation complex
- jádro komplexu (symetrické) tvoří
TAF4, 5, 6, 9 a 12 - PO připojení VŠeCh start of transcription
podjednotek TFIID komplexu včetně TBP vzniká funkční (asymetrický) holokomplex (PIC)
- footprint analýza ukázala jak se TFIIA-TFIID/TBP komplex společně váže na DNA (TFIIA pomáhá vázat TATA box)
pro další postup transkripce je klíčový TFIIB - propojuje TFIID-TFIIAs RNApol II
0 50 100 150 200 250 300
TFIIB
- TFIIB (C-konec = CTD1 a CTD2) váže TBP a 6-7bp up- a downstream od ohybu DNA přes cukrfosfátovou kostru (blízko TATA boxu)
- TFIIB (N-konec) váže RNA polymerasu II a orientuje TFIID-TFIIA-DNA komplex na pol II (do jeho aktivního centra/cleft)
- Zn-ribbon s dock, B-finger/reader s RNA tunelem
- B-ribbon s dock, B-finger/reader s RNA tunelem, B-core/CTD1 s wall, B-linker s CC clamp
- umístění TFIIB determinuje pozici počátku transkripce
- pozice B-reader (v RNA tunelu) limituje iniciační krok (12nt RNA)
- po dosažení 12nt RNA dochází k disociaci TFIIB (elongace...)
TFIIB propojuje RNApol II s již sestaveným TBP/TFIID+TFIIA
(postupným odhalováním detailů struktur, mutagenezí podjednotek, funkčními testy (in vitro a in vivo) byly identifikovány všechny TFII a určeno pořadí jejich působení)
TATA box
start of transcription
(A)
TBP TFIID
(B)
TFIIB
—)-90° MTE DPE
Lobe B
- cryoEM komplexu TBP(bez TFIID) + TFIIA + TFIIB + RNApol II
- po navázání pol II disociuje TAF1/2 ...
He et al, Nature, 2013
(O
r"Tn
\   TFII F  other factors
UTP,ATP CTP,GTP
HELICASE ACTIVITY
AND CTD PHOSPHORYLATION
DISASSEMBLY OF MOST - GENERAL TRANSCRIPTION FACTORS
bez TFIID
TRANSCRIPTION
33Eu TATA 3REd
- TBP - IIA - IIB
INF
II
Rekonstrukce celého PIC
- biotin-DNA navázána na streptavidinové kuličky - na DNA nachytány in vitro sestavené komplexy - odštěpeno Sa/l a cryoEM - postupně rekonstituován celý PIC
TATA box
start of transcription
(A)
TBP TFIID
(B)
TFIIB
a
■
He et al, Nature, 2013
+59
-Biotin
(C)
TFIIE TFMH
BREu TATA B R Ed
->TFIID(TBP)—►TFIIA TBP(bezTFIID) +
+ TFIIB + RNApol II
TFIIF  other factors RNA polymerase II
TFlIB
tfiif
-41
+1
hi
He et al, Nature, 2013
+59
■B con
BREu TATA B R Ed
TFIID(TBP) —* TFIIA
INR Sail
*■ TFIIB -»Pol ll/TFIIF—» TRIE—
- TFIIF (navázaný na pol II) stabilizuje DNA v prohlubni/cleft pol II a pomáhá TFIIB s nastavením startu (WH D z RAP30 podjednotky váže přímo DNA: BREdownstream) - váže TFIIE a pomáhá tak stabilizaci komplexu
400
Dimerizace
WHD
Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012
He et al, Nature, 2013
-41
BREu TATA BREd
+ 1
■ Biotin
INR
Sail
-> TFIID(TBP) —► TFIIA —► TFIIB
/TFIIF—» TFIIE—*-
c
- TFIIF váže TFNEa pomáhá tak stabilizaci komplexu
- tandem 4x WHD uzamyká DNA v RNApol II prohlubni
Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012
lešení/scaffold
XPD
XPB
helikása
- XPB a XPD regulují transkripci vs opravu DNA (NER)
a
-41
+1
n
+59
■ n otin
BREu TATA BREd
INF
Sail
■* TFIID(TBP) —> tfiia —► TFIIB ->       /TFIIF—> TFIIE—»
c d
lidský PIC komplex
He et al, Nature, 2013
- TFIIH (10podjednotek, 450KDa), podkomplex CDK7-cyclin H-MAT1 fosforyluje pol II (Rpb1)
- XPB v kontaktu s DNA rozvíjí dvoušroubovici
Kompletní PIC i S TFIID komplexem Louder et al, Nature, 2016
začátek transkripce - faktory
TABLE 1   Components of the human general transcription machinery
Factor
Protein composition
Function
TFIIA
TFIIB
TFIIF
TFIIH
pol II
p35(«), p19(/3), and p12(7) ^33_
TFIID     TBP + TAFs (TAF1-TAF14)
T F11E      p56 (a) and p34 (0)
RAP30 and RAP74
Dr. Kolesár
P89/XPB, p80/XPD, p62, p52, p44, p40/CDK7, p38/Cyclin H, p34, p32/MAT1, and p8fl"FB5
Dr. Blažek
RPB1-RPB12
(A)
(B)
(C)
Antirepressor; stabilizes TBP-TATA complex; coactivator
Start site selection; stabilize TBP-TATA complex; pol ll/TFIIF recruitment
Core promoter-binding factor Coactivator Protein kinase
Ubiquitin-activating/conjugating activity Histone acetyltransferase
Recruits TFIIH
Facilitates formation of an initiation-compentent pol II Involved in promoter clearance
Binds pol II and facilitates pol II recruitment to the promoter Recruits TFIIE and TFIIH
Functions with TFIIB and pol II in start site selection Facilitates pol II promoter escape Enhances the efficiency of pol II elongation
ATPase activity for transcription initiation and promoter clearance Helicase activity for promoter opening Transcription-coupled nucleotide excision repair Kinase activity for phosphoryfating pol II CTD E3 ubiquitin ligase activity
Transcription initiation, elongation, termination Recruitment of mRNA capping enzymes
TATA box I
start of transcription
TBP TFIID
TFIIB
CyD TFIIF otherfactors
RNA polymerase II
(D)
UTP, ATP CTP.GTP"
HELICASE ACTIVITY
AND CTD PHOSPHORYLATION
DISASSEMBLY OF MOST — GENERAL TRANSCRIPTION FACTORS
TRANSCRIPTION
Transcription-coupled recruitment of splicing and 3' end processing factors CTD phosphorylation, glycosylation, and ubiquitination
RPB1 CTD (heptapeptide YSPTSPS repeat) fosforylace Thomas et ai., cribmb, 2006
- celý mechanismus aktivace transkripce od vazby aktivátoru . uvolnění chromatinové struktury ... zahrnuje ještě další komplexy (jako např. mediator)
Rpb4/7
activator protein
enhancer (binding site for activator protein)
mediator
RNA pol II
TFIIH
Gibbons et al, PNAS, 2012
TATA box
start of
BINDING OF transcription GENERAL TRANSCRIPTION FACTORS, RNA POLYMERASE, MEDIATOR,CHROMATIN REMODELING COMPLEXES, AND HISTONE ACETYLASES
chromatin remodeling complex
histone-modifying enzyme
TRANSCRIPTION BEGINS
capping factors
RNA polymerase \
Příště Dr. Blažek: Úloha Cdk kinás v regulaci transkripce a buněčného cyklu
1 5      5' end of m RNA
splicing
proteins
\
3' end processing proteins