Jan Šmarda Ústav experimentální biologie, PřF MU Přednáška kurzu Bi4010 Základy molekulární biologie, 2018/19 Programovaná buněčná smrt 2 Programovaná zprostředkovaná specifickým buněčným signálním systémem prospěšná pro organismus, jehož je umírající buňka součástí Neprogramovaná nastává neregulovaně z vnějších příčin (insult) 3 každý den v našem těle odumře 50-70 miliard buněk složení těla se obměňuje zdravá buňka je vždy připravena zemřít, sebedestrukční mechanismus se spustí pouhou absencí signálů „pro-survival“ 4 apoptóza (zprostředkovaná kaspázami během vývoje, stárnutí nebo jako odezva na specifické podněty) autofagie (rozklad buněčných složek v lysozomech) excitotoxicita (smrt nervových buněk v důsledku přílišné aktivace receptorů pro nervové přenašeče) anoikis (důsledek poruchy interakcí, které buňku ukotvují v matrix) nekróza (indukovaná nespecifickým traumatem) nekroptóza (programovaná forma nekrózy, závislá na aktivitě specifických kináz RIP, bez dominantní účasti kaspáz) fyziologický proces odumírání buňky popsána u živočichů i rostlin probíhá řízeně podle speciálního programu destrukci buňky zajišťují speciální enzymy - kaspázy výsledkem je rychlá fragmentace a fagocytóza buňky nástroj udržování homeostáze Proč? stresové podněty z okolního prostředí nevratné poškození DNA vývojové procesy reakce na viry/patogeny 5 protiváha nadměrné proliferace buněk podíl na formování a tvarování orgánů a tkání („sculpting“) eliminace přestárlých buněk eliminace poškozených nebo geneticky aberantních buněk (neopravitelné poškození DNA, extrémní kyslíková deprivace, významná signální nerovnováha, apod.) Apoptóza - úloha 6 název z řečtiny (opadávání květů nebo listů) provázena charakteristickými morfologickými změnami Apoptóza 7 Morfologické projevy 8 zmenšování buněk kondenzace a fragmentace jádra řízená fragmentace chromozomální DNA v konečné fázi se fragmentuje celá buňka do malých kompaktních tělísek, které podléhají fagocytóze nedojde ke vzniku zánětu Nežádoucí projevy nadbytek i nedostatek apoptózy je nežádoucí přílišná apoptóza poškozuje tkáně (degenerativní procesy) nedostatečná apoptóza buňky predisponuje k hromadění genetických poruch a tvorbě nádorů změny v apoptóze zaznamenány u autoimunitních chorob, AIDS, rakoviny, neurodegenerativních chorob (Huntington, Alzheimer), mrtvice, infarktu snahy indukovat apoptózu u nádorových buněk snahy redukovat apoptózu v případě odumírání mozkových buněk po mrtvici 9 apoptózou jsou během morfogeneze odstraňovány nežádoucí buňky – tvorba funkčních a řádně tvarovaných tkání a orgánů spolu s migrací, proliferací a diferenciací buněk jde o klíčový proces doprovázející vývoj organismů geneticky pozměněné myši, které postrádají klíčové složky apoptotického aparátu vykazují vývojové poruchy: nadbytek neuronů v mozku, obličejové abnormality, poruchy formování prstů, atd. Apoptóza a formování tkání 10 11 Vývoj končetiny buňky odumírají v prostoru mezi formujícími se prsty Příklady apoptózy u člověka Příklady apoptózy 13 Apoptóza aktivní proces přesný harmonogram kondenzace chromatinu rozpad jádra odbourání cytoskeletu („zhroucení“ buňky) fragmentace chromozomální DNA mitochondrie dlouho intaktní výběžky buněčné membrány fagocytóza pozůstatků buňky Apoptóza versus nekróza 14 15 Nekróza pasivní smrt postihuje skupiny buněk vyvolaná neléčitelným zraněním (nedostatek kyslíku, extrémní teploty, mechanické poškození, atd.) poškození mitochondrií - vyčerpání ATP poškozenou membránou proniká do buňky voda, buňka se zvětšuje zvětšují se organely celková dezintegrace uvolnění nitrobuněčných komponent vznik zánětu Apoptóza versus nekróza Signály indukující apoptózu 16 vnitřní ze samotné buňky podléhající apoptóze poškození DNA, virová infekce, exprese onkogenů vnější z okolních buněk organismu nebo vnějšího prostředí nedostatek vyživovacích signály (absence signálů „pro-survival“) přítomnost signálů indukujících apoptózu („pro-death“) Průběh apoptózy: dvě fáze 17 fáze latentní následovaná fází exekuční Latentní fáze normální vzhled a fungování buněk podfáze „odsouzení“ – buňka je na dráze směřující k smrti, ale může být zachráněna anti-apoptotickými faktory podfáze „rozhodnutí“ - buňka již nevyhnutelně směřuje k exekuční fázi trvání latentní fáze je variabilní Exekuční fáze 18 zahájení morfologických a fyziologických změn trvání této fáze je velmi rychlé ve srovnání s latentní fází (do 1 hod) konzervativní průběh Protein p53 a apoptóza 19 p53 je transkripční faktor, který funguje jako nádorový supresor v nepoškozené buňce je hladina p53 nízká v důsledku řízené vlastní degradace: p53 aktivuje expresi ubikvitin ligázy Mdm2 Mdm2 připojí ubikvitin k p53 p53 s kovalentně připojeným řetězcem ubikvitinů je degradován v proteazomu v buňce vystavené stresu se p53 fosforyluje a začne aktivovat expresi jiných genů (např. zapojených do kontroly buněčného cyklu a apoptózy) bez aktivace mdm2 se p53 stabilizuje a jeho hladina v buňce rychle stoupá p53 reaguje na různé typy stresu 20 negenotoxické nedostatek růstových faktorů nedostatek ribonukleotidů přítomnost určitých cytokinů genotoxické poškození DNA záření oxidativní stres p53 řídí osud buňky 21 možnosti: indukce apoptózy zastavení buněčného cyklu zahájení opravy DNA diferenciace buněk účinky dány jeho schopností měnit expresi svých cílových genů Genetická analýza apoptózy 22 identifikace klíčových regulátorů využití modelu hlístice Caenorhabditis elegans (Háďátko obecné) Genetická analýza apoptózy 23 pomocí speciální optiky (Nomarski) lze mikroskopií sledovat každou buňku vyvíjejícího se těla C. elegans sestavení mapy původu každé jednotlivé buňky a sledování její historie až k oplozenému vajíčku z 1090 somatických buněk vytvořených během embryogeneze 131 buněk odumírá to místně a časově specificky identifikováno 14 genů ovlivňujících programovanou buněčnou smrt Robert Horvitz John Sulston Sydney Brenner Nobelova cena 2002 V apoptotické signalizaci se uplatňují tři skupiny proteinů regulátory adaptéry efektory 25 ced = cell death abnormal mutants ced-3 a ced-4 jsou pro-apoptotické ced-9 blokuje funkci genů ced-3 a ced-4 (je anti-apoptotický) Geny ced mají své homology u savců Ced-3 patří do rodiny proteáz, zvaných kaspázy kaspázy jsou klíčovými výkonnými účastníky apoptózy cysteinyl aspartát-specifické proteázy (cystein je přítomen v aktivním místě enzymu; kyselina asparagová je přítomna v cílovém místě štěpeného substrátu) syntetizovány jako inaktivní zymogeny – prokaspázy, které se aktivují odštěpením inhibiční prodomény 26 Geny ced mají své homology u savců Ced-4 se podílí na aktivaci kaspáz - savčím protějškem je Apaf-1 („apoptotic protease-activating factor 1“) Ced-9 patří do rodiny Bcl-2 regulátorů buněčné smrti 27 Regulátory apoptózy – rodina Bcl-2 pro- nebo anti-apoptotická funkce lidský gen rodiny bcl-2 může funkčně nahradit chybějící gen ced-9 u C. elegans obsahuje strukturně příbuzné proteiny s doménou BH (BCL-homology) doména BH je potřebná pro meziproteinové interakce proteinů Bcl-2 regulátory apoptózy mohou být nebezpečné název bcl-2 odráží souvislost s lymfomy B-buněk (B-cell lymphoma) tento typ rakoviny vzniká v důsledku translokace t(14;18), díky které se gen bcl-2 dostává do intenzivně přepisované oblasti genu kódujícího těžký řetězec imunoglobulinů: hladina Bcl-2 v těchto buňkách proto stoupá, což je důležitým faktorem nádorové transformace bcl-2 je možné považovat za onkogen, který ale neindukuje proliferaci buněk, ale narušuje rovnováhu mezi životem a smrtí buněk buňky s vysokou expresí bcl-2 jsou odolné k induktorům smrti Proteiny Bcl-2 a rakovina 29 Kaspázy po aktivaci degradují klíčové buněčné struktury uplatňují se jako iniciátory i efektory apoptózy dosud známo 13 členů rodiny kaspáz, které se dělí na iniciační, exekuční a zánětové zánětové kaspázy nemají souvislost s apoptózou, ale indukcí zánětlivé reakce (produkcí cytokinů, apod.) Kaspázy - struktura 31 v aktivní formě složené ze 2 velkých a 2 malých podjednotek inaktivní zymogeny obsahují N-koncovou pro-doménu, za kterou následuje velká a malá doména mezi doménami jsou aspartátové zbytky, tj. cíle kaspázového aktivačního štěpení, po kterém vzniká velká a malá podjednotka, které spolu heterodimerizují Iniciační kaspázy kaspázy 2, 8, 9, 10 obsahují velkou pro-doménu na N-konci zajišťující interakci s jinými proteiny fungují jako iniciátory procesů buněčné smrti – aktivují exekuční kaspázy v inaktivní formě mají podobu monomerů při aktivaci jsou adaptérovými molekulami převedeny do podoby dimerů Exekuční kaspázy kaspázy 3, 6, 7 obsahují malou pro-doménu na N-konci aktivují se štěpením iniciačními kaspázami, následkem je zpřístupnění aktivního místa nejsou schopné autoaktivace štěpí různé substráty, které přímo způsobují morfologické a biochemické změny v buňkách 33 Cíle kaspázového štěpení kaspázy jsou selektivní enzymy, štěpí jen omezené spektrum jaderných a cytoplazmatických proteinů štěpeno je několik strukturních proteinů a mnoho proteinů zapojených do buněčných signalizací (např. kináz) kinázy mají často autoregulační domény, díky kterým se zapínají nebo vypínají podle potřeby; tyto domény jsou kaspázami odstraněny: výsledkem jsou konstitutivně aktivní/inaktivní kinázy, které aktivují pro-apoptotické procesy Substráty exekučních kaspáz FAK (focal adhesion kinase): kináza nutná pro adhezi buněk k matrix nebo okolním buňkám (ztráta aktivity při apoptóze) laminin na vnitřním povrchu jaderné membrány (kondenzace chromatinu a pyknóza jádra) aktin, plektin, vimentin, gelsolin (intermediární filamenta): kolaps cytoskeletu a tvorba vychlípenin plazmatické membrány: tvorba apoptotických tělísek inhibitor kaspázou-aktivované DNAázy (ICAD) uvolňuje DNázu CAD (caspase-activated DNase), která pak fragmentuje DNA 35 Účinky kaspázy 3 efektor apoptotické signalizace štěpí různé buněčné proteiny aktivuje specifickou DNázu (CAD – „caspase-activated DNase“) v buňkách je CAD v komplexu se svým inhibitorem ICAD kaspáza 3 v apoptotických buňkách štěpí ICAD a umožňuje tak CAD štěpit DNA mezi nukleozomy Jak jsou kaspázy aktivovány? specifickými induktory: vnitřními podněty: abnormalitami ve struktuře DNA vnějšími podněty: absencí růstových faktorů, přítomností specifických cytokinů (TNF, ligand Fas) apoptózovými signálními drahami: vnitřní dráhou závislou na mitochondriích vnější dráhou nezávislou na mitochondriích 37 Dvě signální dráhy apoptózy: vnitřní a vnější vnitřní dráha vnější dráha mitochondrie cytochrom c receptory smrti kaspázy kaspázy buněčná smrt buněčná smrt APOPTÓZA Signální dráhy apoptózy receptorová (vnější) se aktivuje vazbou ligandů smrti na příslušné membránové receptory mitochondriální (vnitřní) se aktivuje změnou permeability vnější mitochondriální membrány Vnitřní (mitochondriální) dráha hlavním elementem jsou mitochondrie a cytochrom c obsažený v prostoru mezi vnější a vnitřní membránou translokace cytochromu c do cytozolu je kritickou událostí dráhy 40 Cytochrom c běžně přítomen v prostoru mezi vnitřní a vnější membránou mitochondrie, podíl na transportu elektronů při oxidativní fosforylaci permeabilizovanou vnější mit. membránou difunduje z mezimembránového prostoru do cytozolu váže se na Apaf-1 („apoptotic protease activating factor“) Apaf-1 mění konformaci-umožnění vazby dATP vazbou dATP se konformace Apaf-1 dále mění - obnažení oligomerizační domény 7 molekul Apaf-1 se spojuje-vzniká apoptozom apoptozom váže iniciační prokaspázu 9 molekuly prokaspázy 9 se v apoptozomu dostávají do těsné blízkosti, což vede k jejich aktivaci kaspáza 9 aktivuje exekuční kaspázy 3 a 7 Apoptozom cytochrom c uvolněný z mitochondrií do cytozolu se váže na Apaf-1 Apaf-1/cytochrom c díky dATP mění konformaci a oligomerizuje („apoptozom“) apoptozom váže a aktivuje prokaspázu 9 aktivovaná kaspáza 9 aktivuje další kaspázy zodpovídající za apoptotickou smrt buňky (kaspázy 3 nebo 7) Co rozhoduje o uvolnění cytochromu c? proteiny rodiny Bcl-2 poměr anti-apoptotických („pro-survival“) a pro-apoptotických vzájemně heterodimerizujících proteinů rozhoduje a propustnosti mitochondriální membrány pro cytochrom c 43 Proteiny Bcl-2 tvoří dimery prostřednictvím domény BH homodimerizují nebo heterodimerizují homodimery Bax indukují apoptózu Bcl-2 tvoří s proteinem Bax heterodimery, čímž jeho proapoptotickou aktivitu inhibují poměry faktorů „pro-death“ a „pro-survival“ rodiny Bcl-2 rozhodují o smrti buněk pro-apoptotické signály způsobují depolarizaci vnější mitochondriální membrány a sestavení takových dimerů z proteinů rodiny Bcl-2, které usnadňují přenos cytochromu c membránou do cytozolu, kde se spojuje s dalšími proteiny a spouští kaskádu reakcí vedoucí k apoptóze anti-apoptotické signály vedou k sestavování takových komplexů rodiny Bcl-2, které uvolnění cytochromu c mimo mitochondrie neumožňují Rodina Bcl-2 Vnější (receptorová) dráha aktivovaná vnějšími („death“) ligandy registrace ligandů povrchovými receptory Fas a TRAIL (rodin receptorů TNF) receptory po aktivaci tvoří trimery dva nebo tři trimery se prostřednictvím ligandů propojují nitrobuněčné domény těchto receptorů se tím aktivují – jsou schopny interakce s dalšími proteiny – např. adaptérovým proteinem FADD FADD je následně schopen interakce s monomery prokaspázy 8 a stimulace jejich dimerizace dimeriace aktivuje kaspázu 8, která tak může aktivovat exekuční kaspázy Receptory smrti transmembránové proteiny schopné vyvolat apoptózu napojují se na vnitřní kaspázovou signalizaci 47 poškození DNA, nedostatek růstových faktorů a další stresové podněty mohou indukovat apoptózu pomocí proteinu p53 p53 aktivuje expresi bax, který kóduje pro-apoptotický protein uvolňující cytochrom c z mitochondrií (aktivace kaspáz) posiluje expresi receptoru Fas blokuje anti-apoptotickou dráhu řízenou IGF (Insulin-like growth factor) Apoptóza a p53 48 oba proteiny uvolňovány cytotoxickými T-buňkami Perforin: tvorba transmembránových pórů pro zajištění průniku granzymu do buňky Granzym B: - štěpení efektorových prokaspáz (kaspáza 3) - štěpení inhibitoru ICAD 49 Apoptóza vyvolaná perforinem a granzymem B Změny v plazmatické membráně translokace fosfatidylserinu z vnitřní do vnější vrstvy – znak rané apoptózy detekce proteinem Annexin V, který se k fosfatidylserinu váže označení Annexinu V fluoreskující značkou - detekce fluorescenční mikroskopií nebo průtokovou cytometrií nekrotické buňky mohou poskytovat falešnou pozitivitu díky poškození membrán - lze eliminovat současným barvením DNA (např. propidium jodidem – „double-staining“) Metody detekce apoptózy Změny v mitochondriální membráně snížený membránový potenciál – znak rané apoptózy lze detekovat sondou TMRE (tetrametylrodamin, etyl ester), což je barvivo, které proniká do buněk a váže se na mitochondrie u mitochondrií v apoptotických buňkách se sníženým membránovým potenciálem je vazebná schopnost TMRE snížena obvyklá detekce – průtokovou cytometrií lze stanovit i uvolněné mitochondriální proteiny (např. cytochrom c) Metody detekce apoptózy FCCP indukuje permeabilizaci mitochondriální membrány 51 Změny v cytoplazmě aktivace kaspáz detekce pomocí specifických kaspázových substrátů, např. PARP nebo cytokeratin detekce pomocí protilátek zaměřených na epitopy, které se obnažují po štěpení kaspázami nebo přímo degradaci substrátů – např. westernovým přenosem nebo průtokovou cytometrií Metody detekce apoptózy 52 Změny jádře kondenzace chromatinu fragmentaci DNA (dvouřetězcové zlomy mezi nukleozomy) lze detekovat gelovou elektroforézou nebo technikou TUNEL TUNEL (terminal deoxy-nucleotidyltransferase dUTP nick end labelling) assay zlomy DNA jsou označeny enzymem TdT, které se pak stanovují protilátkami (imunohistochemicky nebo průtokovou cytometrií) Metody detekce apoptózy 53 Průtoková cytometrie Co dokáže? rozlišit živé buňky od mrtvých zhodnotit míru emitované fluorescence každou jednotlivou buňkou frakcionovat buňky podle určitých vlastností, které korelují s mírou fluorescence vyhodnotit více než 100 buněk za 1 minutu 54 Průtoková cytometrie Účel: Studium vlastností individuálních buněk v buněčné populaci míra přítomnosti určitých antigenů (např. sledování diferenciace buněk) míra přítomnosti DNA (např. sledování buněčného cyklu, apoptózy) velikost buněk, přítomnost granulí v cytoplazmě (určení buněčných typů ve směsích buněk) možno využít k frakcionaci buněk dle určitých vlastností (FACS - Fluorescence-Activated Cell Sorter) 55 Průtoková cytometrie Princip: Počítačové zpracování míry emitované fluorescence jednotlivých buněk Předpoklad: Míra fluorescence odpovídá sledovanému parametru (antigen, DNA…) Pojmy: „Flow cytometry“ - měření určité vlastnosti buněk v průběhu jejich toku přístrojem „Flow sorting“ (Fluorescence-activated cell sorting FACS) oddělování buněk podle jejich vlastností zjištěných v průběhu průtokové cytometrie 56 Průtoková cytometrie Postup: koncentrovaná suspenze buněk je opatřena fluorescenční značkou specifickou pro cílovou molekulu (pro DNA - propidium jodid, pro protein - fluoreskující protilátka) buněčná suspenze je rozdělena na malé kapičky (každá z nich obsahuje jednu buňku) jednotlivé kapičky jsou ozářeny laserovým paprskem - dojde k excitaci fluorescenční značky a emisi fluorescence měření míry fluorescence pro každou buňku (určuje míru přítomnosti cílové molekuly) měření míry rozptylu světla pro každou buňku (určuje míru granulace cytoplazmy, velikost a tvar buňky) 57 Frakcionace buněk - FACS Princip: podle míry fluorescence je každé kapičce s jednotlivou buňkou udělen proporcionální elektrický náboj kapičky procházejí prostorem mezi dvěma elektrodami a dochází k jejich frakcionaci podle náboje Výhoda: buňky nejsou průtokovou cytometrií poškozeny - udržují si životaschopnost buňky nejsou kontaminovány - lze je dále kultivovat 59 Využití průtokové cytometrie pro analýzu buněčného cyklu Princip: měření obsahu DNA v jednotlivých buňkách, který se v průběhu cyklu periodicky mění Postup: obarvení DNA fluorescenčním barvivem - propidium jodidem měření míry fluorescence emitované jednotlivými buňkami počítačové zpracování dat a grafické vyhodnocení 60 Využití průtokové cytometrie pro analýzu fragmentace DNA Princip: buňky se ošetří 70% etanolem a poškozenou membránou uniká fragmentovaná DNA fragmentovaná DNA po obarvení propidium jodidem fluoreskuje v oblasti subG1) 61