1 Enzymy používané pro analýzu nukleových kyselin •ROZDĚLENÍ •A. Podle typu substrátu •- DNA enzymy •- RNA enzymy •B. Podle typu reakce •- enzymy syntetizující NK (anabolické) = polymerázy •- enzymy odbourávající NK (katabolické) = nukleázy •- enzymy modifikující NK •- enzymy spojující molekuly NK = ligázy stažený soubor 2 • Enzymy syntetizující DNA 3 • Enzymy syntetizující RNA 4 • Katabolické enzymy degradující DNA Katabolické enzymy degradující RNA 6 Enzymy modifikující DNA 7 Enzymy spojující molekuly DNA 8 Restrikční endonukleázy (RE) •součást restrikčně modifikačních systémů bakterií •omezují propagaci bakteriofágů v různých bakteriálních kmenech (např. fág namnožený v E.coli kmeni C nemůže účinně infikovat E.coli kmen K – degradace fágové DNA) •DNA hostitelské buňky je před účinkem vlastní endonukleázy chráněna metylací •původní význam RE: ochrana před cizorodým genetickým materiálem 9 Restrikce bakteriofága 10 Význam restrikčních endonukleáz •nástroj pro přípravu rekombinantních molekul DNA •prostředek pro studium struktury, organizace, exprese a evoluce genomu •základ pro genové inženýrství 11 Vlastnosti RE •štěpí dvouřetězcové molekuly DNA ve specifických místech •většina RE rozeznává palindromy (obrácené repetice) •štěpí oba řetězce DNA •rozdělují se do tříd I, II, III a IV 12 RE třídy II mají praktické využití •vážou se na specifické (4-6 pb) sekvence nukleotidů •katalyzují štěpení dvou řetězců molekuly DNA uvnitř vazebného místa nebo v jeho bezprostředním sousedství •k štěpení dochází vždy ve stejném místě •štěpení se podrobují všechna cílová místa v dané molekule DNA •rozeznávací sekvence mají téměř vždy charakter obrácených opakování: stejná sekvence je štěpena ve stejném místě v obou řetězcích •molekulová hmotnost: 20.000 - 100.000 •kofaktor: pouze ATP 13 Charakter cílových míst RE třídy II 14 Orientace je důležitá 15 Produkty štěpení RE •tupé konce (po štěpení obou řetězců ve stejném místě) • •ostré konce (po štěpení řetězců v různých místech, která jsou obvykle vzdálena 1-4 nukleotidy) • - 5´přečnívající • - 3´přečnívající 1QPS-56a09bba5f9b58eba4b20806 16 17 Názvosloví RE •např. EcoRI •1. písmeno: počáteční písmeno jména rodu produkční bakterie •2. a 3. písmeno: první dvě písmena jména druhu bakterie •označení kmene (serotypu) produkční bakterie (ne vždy) •římská číslice vyjadřuje pořadové číslo endonukleázy izolované z téže bakterie • 18 19 Jednotka RE •množství RE, které kompletně rozštěpí 1mg •DNA fága Lambda za 1 hodinu při optimální •teplotě a v optimálním prostředí 20 Počet restrikčních míst pro daný enzym v molekule DNA klesá s jejich velikostí 21 DNA ligázy •enzymy, které obnovují cukr-fosfátovou kostru DNA tvorbou kovalentní fosfodiesterové vazby mezi 5´fosfátovou skupinou jednoho řetězce a 3´OH skupinou druhého řetězce za spotřeby ATP nebo NAD •fyziologický význam při replikaci, rekombinaci a reparaci DNA •analogické RNA ligázy katalyzují in vitro podobné reakce při ligaci ssRNA 22 Působení DNA ligáz 2OWO2 23 Použití DNA ligáz •příprava rekombinantních molekul DNA •možno spojovat fragmenty DNA různého původu (restrikční fragmenty DNA, uměle syntetizované molekuly DNA, produkty zpětné transkripce, atd.) 24 PŘÍPRAVA REKOMBINANTNÍCH MOLEKUL DNA Přečnívající kompatibilní konce usnadňují spojení fragmentů DNA pocházejících z různých zdrojů 25 Běžné typy DNA ligáz •T4-DNA-ligáza •izolace z buněk E.coli infikovaných fágem T4 •spojuje lepivé i tupé konce DNA •opravuje jednořetězcové zlomy („nicks“) v dvouřetězcové DNAm RNA a u hybridů DNA/RNA •vyžaduje přítomnost fosfátové skupiny na 5´konci a OH skupiny na 3´konci molekuly • •Bakteriální DNA ligáza •izolace z E. coli •spojuje jen DNA s lepivými konci 26 Polymerázy •syntetizují nukleové kyseliny postupným doplňováním nukleotidů k 3´OH konci stávající molekuly nukleové kyseliny •není známá žádná polymeráza prodlužující 5´konec DNA •matricí (templátem) je jednořetězcová DNA nebo RNA •polymerázy vytvářejí komplementární kopii templátového řetězce 27 Polymerace DNA 28 DNA polymeráza I (Kornbergův enzym) •zdroj - E.coli •katalyzuje 3 různé reakce: •1. Polymerázová aktivita: Prodlužování polynukleotidového řetězce ve směru 5´- 3´ –matrice je čtena ve směru 3´- 5´ –tvorba fosfodiesterové vazby nukleofilním atakem 3´OH skupiny rostoucího řetězce a 5´P dNTP za tvorby pyrofosfátu –požadavek přítomnosti primeru 29 DNA polymeráza I (Kornbergův enzym) •2. Exonukleázová aktivita 5´- 3´i 3´- 5´ –hydrolýza řetězce DNA v obou směrech • •3. Degradace DNA ve směru 5´-3´a současná syntéza degradovaného řetězce –oprava chybně začleněných nukleotidů in vivo – („proof-reading“) –využití při značení DNA („nick translace) –exonukleázové aktivity mohou záviset na přítomnosti iontů Mg2+ nebo Mn2+ • 30 Klenowův fragment DNA polymerázy I •jeden ze dvou produktů proteolytického štěpení DNA polymerázy I subtilizinem •polymerázová aktivita 5´- 3´ •exonukleázová aktivita 3´- 5´ •Využití: při značení DNA („fill-in“ 3´zkrácených konců a pomocí „random hexamers“) •sekvenování DNA Sangerovou metodou •syntéza druhého řetězce cDNA • The+structure+of+the+Klenow+fragment+of+DNAP+I+from+E 32 Terminální transferáza •katalyzuje přidání deoxynukleotidů k 3´OH konci molekul DNA •substrátem jsou přečnívající, zkrácené i tupé konce dvouřetězcové molekuly DNA nebo ssDNA •nevyžaduje matrici ani primer •zdroj: telecí brzlík •využití: přidání homopolymerních konců k 3´koncům DNA •značení 3´konců DNA 33 Příklad reakce katalyzované terminální deoxynukleotidyl transferázou 34 Výhody terminální transferázy •možnost připojení dlouhých úseků komplementárních nukleotidů na 3´koncích vektoru a insertu •velikost připojených úseků nemusí být stejná (pokud se jedná o úseky větší než 20 nukleotidů, jejich párování je dostatečně silné, aby zajistilo stabilitu duplexu v pokojové teplotě) •v transformovaných buňkách se nespárované oblasti opraví reparačními mechanismy 35 Připojení homopolymerních konců ke klonované DNA terminální transferázou 36 Zpětná (reverzní) transkriptáza •RNA-dependentní DNA polymeráza •přepis genetické informace z RNA do DNA •požadována přítomnost primeru a matrice •poskytuje v první fázi hybrid RNA/DNA, po odstranění rna působením hydroxidů nebo RNázy H lze zpětnou transkriptázou katalyzovat i syntézu druhého vlákna DNA •syntézu 2. vlákna může zajistit také DNA polymeráza I • •zdroj: retroviry •M-MuLV (Moloney Murine Leukemia Virus) •AMV (Avian Myeloblastosis Virus) •RSV (Rous Sarcoma Virus) 37 Zpětná (reverzní) transkriptáza •Aktivity: •polymerázová •5´- 3´exoribonukleázová •3´- 5´exoribonukleázová (RNázaH) • •Využití: •tvorba cDNA - specifická (primer oligo dT) • - nespecifická (primer komplementární k 3´oblasti hledané mRNA) 38 Syntéza cDNA 39 Nukleázy •Nukleáza S1 •endonukleáza specifická pro jednořetězcovou DNA •Zdroj: •bakterie Aspergillus oryzae •Využití: •odstraňuje jednovláknové struktury z DNA (odstranění nespárovaných smyček) •hydrolýza jednořetězcových konců 40 Mapování nukleázou S1 41 Nukleázy •DNázaI •nespecifická deoxyribonukleáza •substrátem je dvouřetězcová i jednořetězcová DNA •za přítomnosti kofaktoru Mg2+ jsou místa štěpení rozmístěna statisticky na obou řetězcích •za přítomnosti kofaktoru Mn2+ jsou přednostně štěpena místa ležící ve ds DNA proti sobě •Zdroj: hovězí pankreas •Využití: •nízké koncentrace: vytváření jednořetězcových zlomů v ds DNA •vyšší koncentrace: odbourání DNA z roztoků RNA • 42 Ribonukleázy • •Ribonukleáza A •nespecifická ribonukleáza •Zdroj: hovězí pankreas •Využití: •odbourání RNA z roztoků DNA •Ribonukleáza H •sekvenčně specifická ribonukleáza, rozpoznávající hybridní molekuly RNA:DNA • 43 Působení enzymů používaných při manipulaci s DNA