Hybridizace nukleových kyselin •Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou •jednořetězcových a komplementárních molekul • •Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace a renaturace (hybridizace) DNA 10_07 © Espero Publishing, s.r.o. Denaturace DNA •oddělení komplementárních vláken DNA působením vysoké teploty (90-100oC), extrémních hodnot pH nebo denaturačních činidel (formamid, močovina) • •změna v uspořádání bazí při denaturaci zvyšuje absorbci světla při vlnové délce 260 nm (hyperchromní efekt) Průběh denaturace a renaturace sledovaný na základě absorpce UV-světla 7 DENATURACE RENATURACE Teplota tání DNA Tm - se lineárně zvyšuje s obsahem GC Teplota tání (denaturace) závisí na čtyřech hlavních faktorech: - obsahu GC (a AT) - koncentraci solí - délce sekvence - přítomnosti nespárovaných úseků GC-bohaté GC-bohaté AT-bohaté Teplota Teplota • Stanovení hodnoty Tm Teplota, při které dochází k denaturaci DNA závisí na obsahu guaninu a cytozinu v DNA. Čím více obsahuje GC-párů, tím vyšší teploty je zapotřebí k její denaturaci. Rozmezí denaturačních teplot je zhruba 30 - 100 oC. Denaturaci DNA provází hyperchromní efekt, tj. dochází ke zvýšení absorbance ultrafialového světla. Hyperchromní efekt je způsoben rozpadem dvouřetězcových molekul DNA na molekuly jednořetězcové, které absorbují UV-záření silněji než molekuly dvouřetězcové. Teplota, při níž zdenaturovalo 50 % dvoušroubovicových molekul DNA, se označuje jako teplota tání a vyjadřuje se symbolem Tm. Tato teplota odpovídá inflexnímu bodu denaturační křivky. Renaturace •opětná tvorba dvouřetězcových struktur z jednořetězcových polynukleotidů za vhodných připojovacích („annealing“) podmínek •nastává při pomalém ochlazování (65oC) roztoku teplem denaturované DNA •nenastává při prudkém ochlazení roztoku DNA s vyšší teplotou než Tm •při renaturaci se mohou tvořit hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA •rozsah renaturace odpovídá rozsahu komplementarity sekvencí • Hybridizace molekul nukleových kyselin. Spojení částečně nebo úplně komplementárních DNA řetězců pocházejících z různých dvouřetězcových molekul DNA nebo podobně spojení DNA-řetězce s RNA řetězcem; oba procesy probíhají in vivo a mohou být navozeny in vitro. Hybridní molekuly DNA. Renaturované molekuly, v nichž se spojily řetězce pocházející z molekul DNA různých zdrojů. Homoduplex. Hybridní molekula DNA, jejíž řetězce se vyznačují úplnou komplementaritou. Heteroduplex. Hybridní molekula DNA, jejíž řetězce se vyznačují neúplnou komplementaritou. 5 ‘ GATCGATCGATCGATC 3’ | | | | | | | | | | | | | | | | 3’ CTAGCTAGCTAGCTAG 5’ zvýšení teploty 5 ‘ GATCGATCGATCGATC 3’ + přidání 3’ CTAGCTAGCCGGCTAG 5’ ochlazení 5 ‘ GATCGATCGATCGATC 3’ | | | | | | | | | | | | | | 3’ CTAGCTAGCCGGCTAG 5’ Využití hybridizace nukleových kyselin •test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha molekul DNA budou hybridizovat jen ty, které jsou dostatečně komplementární) – z toho lze vyvozovat stupeň příbuznosti testovaných organismů •testy genové exprese (hybridizovat mnohou i molekuly DNA a RNA) •lokalizace genů na chromozomech •testy paternity, identifikace osob, atd. •amplifikace nukleových kyselin pomocí PCR (připojení primeru k templátu je rovněž typ hybridizační reakce) •vyhledávání klonů nesoucích rekombinantní DNA •čipové technologie („microarrays“) •spojování fragmentů při klonování • •základem hybridizace je vždy značená sonda o známé nukleotidové sekvenci • Uspořádání hybridizačního experimentu je rozmanité podle povahy prostředí, ve kterém probíhá d_18 Typy přenosu z gelu na membránu podle typu analyzovaných molekul •Southernův přenos - DNA •northernový přenos - RNA •westernový přenos - proteiny •southwesternový přenos - proteiny vázající DNA • (sondou je DNA) •northwesternový přenos - proteiny vázající RNA • (sondou je RNA) Typický hybridizační experiment - Southernův blot (přesávka) •technika vyvinuta E.M. Southernem • •běžné použití při detekci přítomnosti určitých genů v buněčné DNA nebo při sledování evoluční příbuznosti vzorků DNA z různých organismů • Southernův blot (přesávka) - postup •rozdělení restrikčních fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou •denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr („blotting“ - přesávka) •inkubace filtru se značenou jednořetězcovou sondou - dojde k hybridizaci sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou filtru •odmytí nenavázané sondy •detekce navázané sondy - vizualizace hybridů (autoradiografie) Detekce specifického fragmenu kapilárním přenosem a hybridizací (Southern blotting) 10_09 © Espero Publishing, s.r.o. • F12-19 DNA obarvená etidium bromidem autoradiogram Southernův přenos Ukázky provedení hybridizace •SouthernHybridization.mov •hybrid2.mov •hybrid3.mov •hybrid4.mov Způsoby přesávky („blotingu“) •kapilární přenos •elektroforetický přenos •vakuový přenos Kapilární přenos Tečková hybridizace („dot blot“) •Postup: •sonikace nebo restrikce genomové DNA; linearizace plazmidové DNA •denaturace •vzorky DNA naneseny na podložku v podobě teček •hybridizace se sondou •hodnocení hybridizace (vizuálně, denzitometrem, • b-spektrometrem) [Dot Blot] Typy sond •restrikční fragmenty dvouřetězcové DNA (cDNA) •mRNA izolovaná z buněk nebo tkání •RNA transkripty in vitro •syntetické oligonukleotidy (připravené podle sekvence aminokyselin) Způsoby značení sond •pomocí náhodných hexanukleotidů („random primer DNA labeling“) •posunem jednořetězcového zlomu („nick translation“) •koncové značení •značení vektoru s naklonovanou sondou •značení transkriptů in vitro (RNA) Značení DNA pomocí náhodných oligonukleotidů „Random primer DNA labeling“ d_19 • k ssDNA se přidá směs hexanukleotidů o různé sekvenci • k těmto primerům připojuje DNA polymeráza značené nukleotidy Značení DNA posunem jednořetězcového zlomu „Nick translation“ d_20 Vytvoření náhodných jednořetězcových zlomů DNázou I DNA polymeráza I odstraňuje nukleotidy od místa zlomu (exonukleázová aktivita 5´- 3´) Současně ve stejném směru připojuje značené nukleotidy k 3´konci zlomu Značení konců DNA fragmentů a) značení 5´konců Značení konců DNA fragmentů b) značení 3´ konců Neradioaktivní značení sond •Digoxineninem • •Biotinem • • •fluorescenčními značkami (fluorescein, rhodamin, kumarin) digoxigenin biotin Bez názvu 1 Neradioaktivní značení nukleových kyselin digoxigeninem d_21 § protilátkou s navázanou alkalickou fosfatázou (AP) Substrát pro AP: A) X-fosfát + NBT B) lumi-fosfát Enzymová reakce: odstranění fosfátové skupiny Detekce: A) po reakci s kyslíkem se produkt reakce zbarvuje B) emise světla, zachycení na filmu Neradioaktivní značení nukleových kyselin biotinem Hybridizační postup 1.Prehybridizace - zabránění nespecifické vazbě sondy na membránu 2.Hybridizace - navázání sondy na komplementární sekvence (68oC, 42oC s formamidem) • - lze volit různé podmínky hybridizace („stringence“) Hybridizační postup •3. Promývání - odstranění nenavázané sondy • (účinnost je ovlivněna teplotou, koncentrací solí) • •4. Detekce navázané sondy • - autografie • - imunologická reakce - barvení • - luminiscence • -fluoroscence Hybridizační postup •5. Rehybridizace • - odmytí navázané sondy • - aplikace další sondy Rea2 Ribotypizace gel Elektroforetický gel Hybridizace s radioaktivně značenou sondou Hybridizace s neradioaktivně značenou sondou Využití hybridizačních technik v praxi Hybridizace in situ •Detekce DNA nebo RNA v intaktních buňkách •radioaktivními nebo fluorescenčními sondami. • •Využití: •prostorová lokalizace nukleových kyselin v buňkách a tkáních (hybridizace buněčné RNA) •lokalizace genů (sekvencí) na chromozómech (hybridizace jaderné DNA) • Použití hybridizace in situ pro detekci genů na chromosomech 10_10 Použito 6 různých sond pro analýzu sekvencí v lidském metafázním chromozomu 5. Každá sonda vytváří 2 tečky na každém chromozomu (mitózou je DNA zreplikována). Obvyklá fluorescenční barviva •fluorescein (zelená fluorescence) •rhodamin (červená fluorescence) •kumarin (modrá fluorescence) • Detekce bakteriálního klonu nesoucího určitý fragment DNA 10_18 Lokalizace specifických sekvencí v genomové DNA Southernova analýza potomků heterozygotních rodičů (RFLP) Pokud je výskyt většího fragmentu spojen s nemocí je třeba sledovat dceru #1, sourozenci #2 a 3 jsou přenašeči Ribotypizace bakterií Ribo0 Ribotypizace gel Příklad hybridizace se sondou specifickou pro16S rDNA. Využití VNTR při přípravě profilu DNA Využití VNTR při testování otcovství § izolace DNA z buněk otce, matky a dítěte § štěpení DNA, elektroforéza, Southernův přenos § všechny pruhy v zobrazení profilu DNA dítěte by měly být přítomny v kombinaci profilů jeho rodičů § lze použít více sond Testování podobnosti DNA • na základě hybridizace DNA-DNA • studium příbuznosti organismů • základ pro studium jejich evoluce • tvorbu fylogenetických stromů Postup: § štěpení DNA na malé fragmenty a jejich separace (denaturace) § smísení denaturovaných DNA ze srovnávaných vzorků § renaturace méně příbuzných řetězců nebude perfektní, stabilita hybridů bude odpovídat míře komplementarity řetězců – lze prověřit podle míry energie nutné pro jejich opětnou separaci § DNA hybridy příbuzných řetězců budou denaturovat při vyšších teplotách DNA