1 Polymerázová řetězová reakce (PCR) nZavedení PCR v roce 1983 (Kary Mullis) uPublikace uNobelova cena nMetoda pro mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace. nK opakující se enzymové syntéze komplementárních řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA dochází po připojení dvou primerů vázajících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3'-OH-konce směřují proti sobě. nPCR umožňuje získat požadovanou zcela specifickou sekvenci bez klonování. page_1 2 nPCR využívá základních rysů replikace (enzymatické syntézy) DNA: uJako templát slouží ssDNA, podle níž je syntetizován komplementární řetězec. uK zahájení reakce je zapotřebí primer, který se připojuje na komplementární úseky DNA. Tím je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. uJako templáty pro syntézu mohou sloužit oba řetězce dsDNA, po předchozí denaturaci. nPrimery se vybírají tak, aby se připojovaly k místům ohraničujícím z obou stran amplifikovaný úsek. nTeoreticky lze získat 2n řetězců (kopií). nPředpoklady pro zavedení PCR uSyntéza oligonukleotidů uVlastní myšlenka (K. Mullis) uTeplotně stabilní DNA polymeráza uAutomatické termocyklery n n tgradient_thermocycler_2 3 Počet nově syntetizovaných molekul dsDNA při jednotlivých cyklech PCR 2n 4 Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzymů 6_21 5 Replikace DNA in vitro vyžaduje pouze jeden enzym nReakční směs obsahuje: uTemplátovou nukleovou kyselinu (DNA nebo RNA). tMnožství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké: obvykle postačuje méně než 1 mg genomové DNA, teoreticky postačuje jedna molekula. •Kvalita templátu ovlivňuje výsledek PCR. •Velké množství RNA může vázat ionty Mg2+ •znečištěný templát může obsahovat inhibitory PCR tZdroj: mikroorganizmy, buňky z tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stěry, vlasy, atd… nPrimery. Chemicky syntetické ologonukleotidy o velikost 10 - 30 nukleotidů. ndNTP ve formě Na+ nebo Li+ solí nMg2+ ionty tvoří rozpustný komplex s dNTP a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza. nTermostabilní DNA polymerázu, která odolává teplotám až 98 °C. uTaq Thermus aquaticus uTth Thermus thermophilus uTma Thermotoga maritima uPfu Pyrococcus furiosus uPwo Pyrococcus woesei 6 Syntéza obou řetězců u specifické sekvence TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 5’ 3’ 3’ 5’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 5’ 3’ 3’ 5’ TTGAGAAAGGAATAAGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ 5’ 3’ Přímý primer DNA POL dNTPs TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC TCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ 5’ 3’ Zpětný primer dNTPs DNA POL TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 5’ 3’ 3’ 5’ pcr-animation 8 Schéma PCR 10_22 9 REAKČNÍ PODMÍNKY PCR n1. Počáteční denaturace DNA. Důležitá je kompletní denaturace templátu, obvykle postačuje zahřátí směsi na 2 – 5 min / 95 °C. V případě, že dojde pouze k částečné denaturaci, molekuly DNA velice rychle renaturují a to vede k nespecifické vazbě primerů („self-priming“) a možným falešným výsledkům. nVlastní řetězová reakce: u2. Denaturační krok (separace řetězců) : 94 – 95 °C / 20 – 45 s, záleží na objemu reakce, tloušťce stěn zkumavek. Nedostatečně denaturovaná DNA neumožňuje přístup primerům, naopak příliš dlouhá denaturace snižuje aktivitu DNA polymerázy (stabilní cca 2 hod / 98 °C). u3. Připojení primerů (55 - 65 °C / 30 – 90 s) teplota určuje specifičnost a závisí na Tm primeru a templátu. Pro oba primery by měla být Tm podobná. Ta se optimalizuje v teplotním gradientu nebo se stanovuje empiricky. u4. Prodlužování primeru (polymerační reakce) při standardní PCR probíhá při 72 °C /45 – 90 s. Taq DNA polymeráza syntetizuje DNA při této teplotě rychlostí cca 60 bází/s. Nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus. uCyklické střídání teplot jednou založené směsi zajišťuje průběh reakce PCR, provádí se v termocyklerech, většinou se provádí 25 - 35 cyklů. n5. Závěrečná extenze se provádí obvykle po posledním cyklu (72°C / 5 min) a slouží k dokončení syntézy a renaturaci jednořetězcových produktů. n 30× 10 REAKČNÍ PODMÍNKY PCR Denaturace vzorku DNA Pro oddělení jednořetězců (94 °C, 5 min) Připojení primerů na řetězce DNA (30 - 65 °C, 1 min) Denaturace pro separaci řetězců DNA (94 °C, 30 s) Syntéza nových řetězců DNA polymerázou (72 °C, 45s - 2 min) 25 – 35 × 11 KONCENTRACE JEDNOTLIVÝCH SLOŽEK PŘI STANDARNÍ PCR REAKCI nDNA. Pro standardní PCR se doporučuje následující množství DNA podle velikosti templátu: ulidská genomová DNA: 100 - 500 ng ubakteriální DNA: 1 – 10 ng uplazmidová DNA: 0,1 – 1 ng nPrimery. Sekvence a koncentrace primeru významně ovlivňuje výsledek PCR. uOptimální koncentrace je mezi 0,1 a 0,6 µM. uU některých systémů může vyšší koncentrace (až 1 µM) zlepšit výsledky. uNižší koncentrace vede k předčasnému vyčerpání primerů a snížení výtěžku. ndNTP. Výsledná koncentrace se může pohybovat v rozmezí 50 – 500 µM (pro každý nukleotid) uNejběžnější koncentrace dNTP je 200 µM. Při zvýšení koncentrace dNTP je třeba zvýšit koncentraci Mg2+ iontů. 12 nMgCl2. Volné Mg2+ ionty ovlivňují aktivitu enzymu a zvyšují hodnotu Tm u dsDNA. uPro dosažení nejlepšího výsledku vždy stanovujeme koncentraci Mg2+ experimentálně. uOptimální koncentrace může kolísat od 1 mM do 5 mM. uNejčasteji používaná koncentrace je 1,5 mM (pro 200 µM dNTP). Bezjména-1 13 nDNA polymeráza. uObvyklá koncentrace je 0,5 – 2,5 jednotek / 50 µl. npH je dané reakčním pufrem, obvykle odpovídá pH 8,3 – 9,0. nPřídatné látky mohou v některých případech ovlivnit účinnost a specifičnost PCR reakce. Jejich vliv se obvykle určuje experimentálně: ualbumin z bovinního séra (BSA) (100 ng/50 µl) udimetylsulfoxid (DMSO) (2- 10 % v/v) – redukce nespecifické vazby primeru udetergenty (Triton X-100, Tween 20) ubetain (0,5 – 2 M) uželatina uglycerol (1 – 5 % v/v) uspermidin uprotein 32 genu fága T4 u u u nMinerální olej – zabraňuje vypařování během reakce n n n optimalizace PCR přídatnými látkami: 14 Struktura Taq DNA polymerázy Taqstruktura 15 BEZCHYBNOST SYNTÉZY nReplikace s Taq DNA-polymerázou neprobíhá bezchybně, DNA-polymeráza příležitostně zařazuje do nově syntetizovaných řetězců chybné (nekomplementární) nukleotidy. uBuňka má schopnost tyto báze odstraňovat opravnými mechanizmy. uIn vitro Taq DNA-polymeráze tato vlastnost chybí. nFrekvence chbného začleňování za podmínek amplifikace in vitro je asi 2×10-4. nChybné začleňování je důležité, pokud jsou PCR produkty klonovány, neboť každý klon je odvozen z jedné molekuly DNA. Chybně začleněné báze (mutace) potom obsahuje celé potomstvo. nŘešení problému: použití dvojice DNA polymeráz, z nichž jedna má opravné mechanizmy (proofreading). n long templ 16 Stanovení teploty pro připojení primeru nTeplota pro připojení primeru (annealing temperature) zkr. Ta. Teplota používaná pro teplotní hybridizaci molekul primeru a matricové DNA in vitro. Optimální teplota pro připojení primeru při PCR se vypočítá podle vztahu: n n n kde Tm Primer je hodnota Tm nejméně stabilního páru primer-matrice a Tm Produkt je hodnota Tm amplifikačního produktu. n nOrientačně lze vypočítat Ta podle vztahu: nTa = 2(A+T) + 4(G+C) – 5 °C = Tm – 5 °C n 17 NÁVRH PRIMERŮ PRO STANDARDNÍ PCR n u18 – 25 bází dlouhé uneobsahují vnitřní sekundární struktury uobsahují 40 – 60 % G+C umají rovnoměrnou distribuci oblastí bohatých na G/C a A/T páry unejsou komplementární navzájem na 3’-koncích, takže nevytvářejí navzájem nebo samy se sebou duplexy una matricové DNA nemají falešná vazebná místa umají Tm teplotu 55 – 65 °C n 18 PŘÍKLADY STRUKTUR VYTVÁŘENÝCH PRIMERY, KTERÉ JE NUTNÉ ZOHLEDNIT PŘI JEJICH NÁVRHU nChybně navržená dvojice primerů, která vytváří stabilní duplex na 3’-konci: n n nSprávně navržená dvojice primerů, která vytváří pouze málo stabilní duplex na 5’-konci; na 3’-konci je G nebo C zaručující stabilní párování s templátem: n n n nChybně navržený primer, vytvářející vlásenku: n stabilníduplex nestabilníduplex stabilnívlásenka 19 nNesprávně navržený primer s falešnými vazebnými místy na templátové DNA: n n n n n nSprávně navržený primer, který nemá falešná vazebná místa na templátu: falešná místa falešná místa2 20 Pro návrh primerů se obvykle používá specializovaný software (některý je volně dostupný na internetu). oligo6 oligo7 21 „HOT START“ PCR n„Hot-start“ PCR významně ovlivňuje specifičnost, citlivost a výtěžek reakce nPrincip: uPři „hot-start“ PCR jsou určité složky reakční směsi odděleny od ostatních, dokud teplota ve zkumavce nepřekročí optimální teplotu pro připojení primeru (obvykle 55 °- 65 °C). uDNA polymeráza je v této nekompletní reakční směsi nefunkční. uNedochází k prodlužování nespecificky navázaných primerů během doby než je dosažena teplota Ta. 22 nSeparace důležitých složek reakční směsi je dosažena některým z následujících způsobů: uManuálně tNěkteré složky jako DNA polymeráza nebo Mg2+ jsou vynechány v původní reakční směsi a přidány manuálně po dosažení teploty > 70 °C. Nevýhodou je možnost kontaminace a možná ztráta reprodukovatelnosti. uFyzikální separace tReakční komponenty jsou rozděleny do dvou směsí, které jsou odděleny bariérou (vosková přepážka, nebo voskové korálky obsahující MgCl2). Během počáteční denaturace vosk roztaje a umožní smíchání reakčních složek. uProtilátky proti DNA polymeráze tPřídavek teplotně nestabilních protilátek umožní počáteční inaktivaci polymerázy. uChemická modifikace polymerázy tPřídavek teplotně nestabilních látek, které se vážou na určité aminokyselinové zbytky blokují enzym (ten je potom při pokojové teplotě inaktivní). K aktivaci enzymu dochází při počáteční denaturaci („FastStart Taq DNA polymeráza“). uDalší inhibitory tnapř. oligonukleotidy specificky se vázající na polymerázu 23 DETEKCE AMPLIFIKOVANÉHO PRODUKTU PCR 1.Stanovení fyzikální velikosti produktu gelovou elektroforézou (agaróza, polyakrylamid). Detekce obarvením a pozorování pod UV světlem. 2.Ověření specifičnosti produktů nŠtěpení produktu restrikčními enzymy a posouzení spektra vznikajících restrikčních fragmentů (PCR-RFLP) nSekvencování 3.Detekce kvantitativní – v reálném čase Příklad standardní gelové elektroforézy s produkty PCR v agarózovém gelu. 1 = hmotnostní st. 2 - 4 = produkty PCR 24 Kontaminace při PCR nVynikající citlivost PCR může být ovlivněna kontaminací i jedinou molekulou exogenní nebo neznámé DNA. nPro minimalizaci falešných pozitivních výsledků je doporučeno: upoužívání autoklávovaných roztoků ufyzikální separace používaných PCR-reagencií od templátové DNA a PCR-produktů upříprava reagencií i vzorků do alikvotních částí upoužívání UV-světla k odstranění exogenních nukleových kyselin na pracovní ploše upoužívání jednorázových rukavic upřidávání DNA do reakce jako poslední upečlivá volba pozitivních, negativních a vnitřních kontrol nVyloučení kontaminace je důležité zejména tam, kde je potřeba použít vysokého počtu amplifikačních cyklů, aby bylo dosaženo požadovaného produktu unízkokopiových templátů DNA udegradovaných vzorků. nV případě pochybností je nejlepším přístupem opakování experimentu s úzkostlivou pozorností k detailům a kontrolám. nJako zdroj kontaminace DNA je nejčastěji uváděn: upřenos kontaminující DNA z dříve amplifikovaných produktů PCR, uvzájemná kontaminace zdrojových materiálů, ukontaminace plazmidem z rekombinantního klonu, který obsahuje cílovou sekvenci. 25 UNG Jako prevence před přenosem kontaminující DNA je v reakční směsi rutinně používána náhrada dTTP za dUTP. Následným působením uracil-N-glykosylázy na reakční směs před zahájením amplifikace. 26 VYUŽITÍ METODY PCR 1.Základní výzkum uizolace genů nebo jejich částí usekvencování DNA umutageneza in vitro umodifkace konců DNA uanalýza (selekce) klonů z genových knihoven upříprava značených sond u 2.Aplikovaný genetický výzkum uprenatální diagnostika (dědičných chorob) udetekce mutací v genech ustudium polymorfizmu genů (např. RAPD) upopulační genetika 3.Využití v klinických disciplinách udetekce patogenních mikroorganismů (baktérií, virů, prvoků, hub) uidentifikace onkogenů utypizace nádorů ustanovení pohlaví u 4.Využití v praxi uarcheologie usoudnictví ukriminalistika n 27 PCR amplifikace se používá k detekci bakteriálních a virových infekcí nKonvenční diagnostické metody jsou založeny na schopnosti vypěstovat organismy v kultuře nebo detekovat jejich přítomnost v pacientu za použití protilátek. uvyžaduje několik týdnů (mykobakterie) uněkdy metoda málo citlivá (protilátky) nZvláštní význam má PCR při diagnostice virů, např. HIV. uCílem je detegovat infikované buňky na pozadí mnohonásobně početnějších neinfikovaných buněk. uDetekce odhalí HIV inkorporované v buňkách. Přítomnost virové RNA naznačuje aktivní infekci, a to lze prokázat provedením PCR za použití cDNA jako templátů vytvořených pomocí RT z RNA infikovaných buněk. nU tuberkulózy je pomocí PCR prokazován některý z vysoce konzervativních genů (sekvencí) mykobakterií pomocí primerů připravených k těmto sekvencím. Amplifikovaný fragment je pak hybridizován se sondami vysoce specifickými pro daný kmen (druh). Tímto postupem je možno detekovat i jen 10 bacilů v 106 eukaryotických buněk. 28 PCR je používána k monitorování terapie rakoviny nNěkteré formy rako- viny vznikají jako výsledek chromozo- mových translokací týkajících se známých genů. Např. existuje translokace mezi chromozomy 14 a 18 u folikulárního lymfomu. nTechniky PCR jsou schopny detekovat jedinou buňku z 106 normálních buněk, tedy daleko citlivěji než hybridizační metody. nDva PCR primery se vyberou ze sekvencí sousedících s místy zlomu na každém chromozomu. Pak pouze v buňkách, kde proběhla translokace, dojde k amplifikaci a vznikne fragment konstatní délky. nPodobná strategie byla použita k detekci leukemií za použití mRNA jako výchozího materiálu. To má výhodu v tom, že mRNA představuje již amplifikační produkt daného genu genomové DNA. priklad translokace kopie 29 PCR je používána ke stanovení pohlaví u prenatálních buněk nŠirokou oblastí využití PCR je prenatální diagnostika obecně. nPro choroby děděné na X-chromozomum které postihují pouze samce, je stanovení pohlaví prvním krokem. To je možné proto, že samci nesou pouze jeden X a jeden Y chromozom, obsahující jedinečné sekvence. nPři oplození in vitro se odebere jedna buňka z rané zygoty pomocí mikromanipulátoru, vyizoluje se DNA a ta se popdorbí amplifikaci pomocí specifických primerů. Prokáže se amplifikační fragment. Výsledku se pak využívá v genetickém poradenství při výběru samičích embryí pro implantaci. priklad sex Y vazany kopie 30 Analýza genové vazby s využitím jednotlivých spermií a)Polohy lokusu genu pro paratyroidní hormon (PTH) a lokusu Gg-globinového genu (HBG2) se nacházejí na krátkém rameni lidského chromozomu 11. b)Jednotlivé spermie se přenesou do zkumavek, amplifikace obou lokusů proběhne současně za použití dvou sad primerů c)Reakční produkty se nanesou na nitrocelulózový filtr a jsou testovány probami specifickými pro každou ze čtyř možných alel, A a a pro PTH a B a b pro HBG2. Výsledek hybridizace je vizualizována autoradiograficky. d)Z autoradiogramu lze odečíst haplotypy každé ze spermií, z nich pak vypočítat frekvenci rekombinace mezi oběma lokusy a stanovit genetickou vzdálenost mezi nimi. n priklad vazba FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) 31 Kvantitativní PCR (qPCR) nPolymerázová řetězová reakce sledovaná v reálném čase (real-time PCR, online PCR, kinetic PCR, quantitative PCR, zkr. Q-PCR). nVarianta PCR umožňující přímou kvantifikaci PCR-produktu v reálném čase nprovádí se prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciálním přístrojovém zařízení, které umožňuje ucyklické střídání teplot udetekci fluorescence umonitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat PCR-produkty elektroforeticky schema1lightcycler 32 Na DNA se vázající interkalační barviva nPro kvantifikaci amplikonů se běžne používají fluorescenční kyaninová barviva SYBR® Green, která fluoreskují po vazbě na dsDNA. nFluorescence SYBR green I je po vazbě na DNA až 1000× vyšší nFluorescenční signál se zvyšuje se vzrůstajícím množstvím PCR-produktu. nSignál se měří na konci elongace nebo kontinuálně. nNa DNA se vázající barviva nemohou být použita u mnohonásobných reakcí nHlavním omezením je nemožnost odlišení nespecifických produktů. nNespecifické signály tvořené dimery primerů mohou být zhášeny při použití primerů značených specifickými fluorofory. real time4 Image 33 Fluorescenční výměny při qPCR nPro značení primerů a hybridizačních sond se používají specifické molekuly fluoroforů uemitují světlo určité vlnové délky po předchozí absorpci světla odlišné vlnové délky uemitovaná vlnová délka světla je vždy vyšší než absorbovaná nDvojitě fluorescenčně značené sondy obsahují kromě fluoroforu také zhášeč umolekula, která přijímá energii z fluoroforu ve formě světla a způsobuje její rozptýlení tve formě světla s vyšší vlnovou délkou tve formě tepla uk dosažení optimálního zhášení je třeba, aby se absorbční spektrum zhášeče překrývalo s emisním spektrem fluoroforu. nV současné době existuje mnoho fluroforů určených pro jednobarevné nebo vícebarevné mnohonásobné detekce polymorfních sekvencí 34 nJedna z nejčastěji používaných dvojic fluoroforů při metodách FRET udonorový fluorofor FAM (6-karboxyfluorescein) uakceptorový fluorofor TAMRA (5-karboxytetrametylrhodamin). 35 TaqMan technologie nHybridizační metoda, kterou využívá kvantita- tivní PCR např. pro detekci bodových mutací nOligonukleotid s fluores- cenční značkou a zhášečem se váže na vnitřní část amplifi- kované sekvence nPokud primer vytváří homoduplex (a), je rozložen 5‘-exonukleázovou aktivitou DNA-polymerázy a vznikne fluorescence Bezjména-4 36 Modifikace PCR používané při analýze genomu 37 Amplifikace sekvencí klonovaných ve vektorech ZVEKTO~1 kopie BEZJMÉ~1 38 Modifikace konců DNA, expression cassete PCR (EC-PCR) Připojení sekvencí prostřednictvím 5‘-konců primerů nPřidávané sekvence uRE místa uPromotory uTerminátory uTranslační signály u „sticky foot“ 5‘ 3‘ 39 Asymetrická PCR nPodobně jako jiné DNA, lze produkty PCR sekvencovat. nTemplátem pro Sangerovu metodu jsou ssDNA. Pro jejich přípravu se používá se technika označovaná jako asymetrická PCR, při níž jsou tvořeny preferenčně ssDNA. nStandardní PCR se založí s tím rozdílem, že výchozí koncentrace primerů se liší faktorem 100 (tj. jeden z primerů je ve 100 x vyšší konectraci než druhý). nDvouřetězcové DNA fragemnty se tvoří až do doby, než se jeden z primerů nevyčerpá. nDruhý primer pak dále syntetizuje pouze jeden z řetězců - i když se tento tvoří spíše lineární než exponenciální rychlostí, je jeho množství postačující pro sekvencování. n asymetric 40 Obrácená PCR (I-PCR) IPCR PCR umožňující amplifikovat úseky DNA o neznámé sekvenci ohraničené na obou stranách DNA se známou sekvencí. 41 Zpětná (reverzní) PCR (RT-PCR) detekce sekvencí na RNA nRNA nemůže sloužit jako templát pro PCR. nProdukty RT-PCR se tvoří, jestliže je izolovaná RNA nejdříve převedena na cDNA pomocí retrovirové zpětné transkriptázy uM-MuLV = Moloney murine leukemia virus uAMV = avian myeloblastosis virus n a poté amplifikována pomocí PCR se dvěma specifickými primery. nNevýhody: Zpětná transkriptáza je termolabilní a obvykle nefunkční nad 42°C. Navíc v některých případech znemožňuje převod RNA na cDNA, zejména při složité sekundární struktuře RNA. nSoučasná technika: uTermostabilní Tth DNA polymeráza z Thermus thermophilus je schopná převést RNA na DNA (RNA dependentní DNA polymerázová aktivita) za přítomnosti Mn2+ iontů při 72°C. uPomocí stejného enzymu je poté prováděna PCR reakce. nPoužití: umRNA uvirové genomy (např. hepatitis C virus, virus chřipky, pikornaviry) n 42 Princip RT-PCR 43 Návrh primerů pro RT-PCR nRT-PCR amplifikace mRNA vyžaduje dvojici specifických primerů. nPrimery můžeme navrhnout tak, abychom odlišili produkty vznikací při RT-PCR a při standardní PCR s genomovou DNA. nDva přístupy pro návrh primerů: uPrimery, které se připojují k sekvenci 2 exonů na obou stranách určitého intronu. Amplifikační produkt z genomové DNA je větší než produkt RT-PCR. uPrimery komplementární k sekvenci na spojení exon/exon. Takové primery neamplifikují genomovou DNA. n RT-PCR2a RT-PCR2b 44 Uspořádání RT-PCR reakce nJednokroková RT-PCR uTth DNA polymeráza udvojice primerů usyntéza cDNA za přítomnosti Mn2+ nVýhody: urychlost unení riziko kontaminace uvyšší citlivost (probíhá při vyšší teplotě) n nDvoukroková RT-PCR uPrvní krok: zpětná transkriptáza + oligo(dT) uDruhý krok: Taq DNA polymeráza + dvojice primerů nVýhody: uumožňuje optimalizovat zvlášť zpětnou transkripci a zvlášť PCR uumožňujě syntézu dlouhých produktů (až 14 kb) n