1 Klonování DNA •Klonování: proces tvorby klonů •Klon: soubor geneticky identických buněk (resp. organismů), odvozených ze společného předka • •Klonování DNA: tvorba klonů DNA •Klon DNA: soubor identických molekul, fragmentů nebo úseků DNA, připravených např. množením rekombinantních molekul DNA v hostitelské buňce (in vivo) nebo PCR (in vitro) •Rekombinantní molekula DNA: molekula DNA vytvořená spojením cizorodé (klonované) DNA s klonovacím vektorem 2 Klonování DNA •Stěžejní metoda molekulární biologie: •umožňuje izolovat z komplexního genomu jeho dílčí úseky (např. geny), ty ve formě rekombinantních molekul mnohonásobně zmnožit a zpřístupnit je tak dalšímu studiu • •Využití klonování DNA: •izolace genů •studium regulačních oblastí, které řídí genovou expresi •fyzikální a genetická analýza genomů •exprese cizích genů v nepříbuzných hostitelích (heterologní exprese) za účelem přípravy žádaných produktů •základ genového inženýrství (příprava transgenních organismů) 3 Klonování zahrnuje 3 kroky 1.příprava rekombinantní molekuly DNA 2.přenos rekombinantní molekuly do hostitelské buňky 3.Selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA • •Pro zajištění bodu 2 jsou zapotřebí klonovací vektory 4 Klonovací vektory •nejčastěji kružnicové molekuly DNA schopné autonomní replikace •obvykle odvozené z plazmidů nebo virů •navíc obsahují pomocné sekvence různého původu usnadňující vložení cizorodé DNA, její expresi, selekci transformantů, apod.) 5 Typy vektorů pro klonování DNA •Plazmidové: pBR322, pUC18, BACs •Fágové: - odvozené od bakteriofága lambda • - odvozené od fága M13 •Kosmidy: hybridy mezi plazmidy a fágy •Vektory eukaryotické buňky: • - kvasinkové • - rostlinné • - živočišné 6 Plazmidové vektory •Vlastnosti: •Jednoduchá manipulace •Přirozený výskyt v mnoha druzích bakterií •Variabilita ve velikosti: jednotky kb – stovky kb (pro klonování obvykle malé 2-5 kb) plasmid_vector_116912 7 Přirozené plazmidy •Extrachromozomální molekuly DNA, obvykle kruhové, dvouřetězcové a tvoří nadšroubovici •Schopnost replikace uvnitř bakterie, občasný přechod do jiné buňky) •Selekční výhoda poskytovaná plazmidem hostitelské buňce je zároveň výhodou pro plazmid •Zodpovídají za šíření genů pro rezistenci k antibiotikům •Je zakázáno provádět takové experimenty, které by mohly způsobit rozšíření nových genů pro rezistenci k antibiotikům v patogenních bakteriích 8 Žádoucí vlastnosti plazmidových vektorů 1.Autonomní replikace v bakteriální buňce 2.Možnost tvorby více kopií v buňce 3.Plazmid by neměl být přenositelný konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) 4.Přítomnost restrikčních míst, využitelných pro klonování 5.Přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) 6.Velikost by měla být co nejmenší (zvýšení účinnosti transformace) 9 Replikace plazmidů •Základní předpoklad pro využití plazmidů jako klonovacích systémů (namnožení fragmentu DNA) • •Hostitelské buňka je vybavena veškerým aparátem pro replikaci DNA • •Počátek replikace (ori) • - genetická informace, kterou musí poskytnout plazmid, aby mohl být v bakteriální buňce replikován • - Je tvořen jen několika stovkami párů bazí 10 Žádoucí vlastnosti plazmidových vektorů 1.Autonomní replikace v bakteriální buňce 2.Možnost tvorby více kopií v buňce 3.Plazmid by neměl být přenositelný konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) 4.Přítomnost restrikčních míst, využitelných pro klonování 5.Přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) 6.Velikost by měla být co nejmenší (zvýšení účinnosti transformace) 11 Žádoucí vlastnosti plazmidových vektorů 1.Autonomní replikace v bakteriální buňce 2.Možnost tvorby více kopií v buňce 3.Plazmid by neměl být přenositelný konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) 4.Přítomnost restrikčních míst, využitelných pro klonování 5.Přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) 6.Velikost by měla být co nejmenší (zvýšení účinnosti transformace) 12 Plazmidy a rozmezí hostitelů •některé plazmidy se replikují v rozmanitých bakteriálních druzích (široké rozmezí hostitelů): RP4, RSF1010, pC194 •většina vektorů užívaných pro klonování se replikuje jen v úzkém rozmezí hostitelů • • • • • •Pendlující (bifunkční, „shuttle“) vektory –Možný přenos mezi dvěma bakteriálními druhy –2 místa ori v jednom plazmidu • Výhoda: - snížení rizika rozšíření pozměněné genetické informace Nevýhoda: - pokud potřebujeme experimen-tovat s jinými bakteriemi než E. coli musíme si připravit „vlastní vektor“ se specifickým ori 13 Žádoucí vlastnosti plazmidových vektorů 1.Autonomní replikace v bakteriální buňce 2.Možnost tvorby více kopií v buňce 3.Plazmid by neměl být přenositelný konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) 4.Přítomnost restrikčních míst, využitelných pro klonování 5.Přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) 6.Velikost by měla být co nejmenší (zvýšení účinnosti transformace) 14 Klonovací místo •Unikátní restrikční místo (zastoupené pouze jednou v molekule plazmidu) •poloha klonovacího místa nesmí narušit funkci oblasti ori nebo jiné důležité funkce plazmidu •začlenění fragmentu DNA do určitého klonovacího místa vede k vzniku rekombinantního plazmidu se dvěma cílovými místy téhož restrikčního enzymu - možno využít pro identifikaci rekombinantního plazmidu 15 16 Místo „MCS“ (Multiple cloning site) •Krátká oblast DNA, která obsahuje cílová místa několika restrikčních enzymů •je vytvořeno uměle (nasyntetizováno a včleněno do vektoru ligací) •možno použít pro včlenění většího počtu sekvencí 17 Spojení fragmentů DNA prostřednictvím kohezních konců • 16 18 Proces klonování •Geny (oblasti) zájmu jsou štěpeny RE •Vektor je štěpen stejnou RE •Klonovaný fragment je vložen do vektoru a spojen ligázou •Nový rekombinantní plazmid je vnesen do hostitelské buňky plasmids 19 Spojení fragmentů DNA prostřednictvím homopolymerních konců • 17 20 Využití spojek a adaptorů • 18 Využití rekombinací •Rekombinační klonování pomocí Gateway technologie •Funguje na principu reversibilní rekombinační reakce •Nejsou zapotřebí restrikční enzymy 4-Figure1-1 22 Přenos plazmidových vektorů do hostitelských buněk Transformace: •bakterie uvedeny do stavu kompetence (u E.coli působeních chloridu vápenatého za nízké teploty) •po přidání DNA a krátkém zahřátí na 42 oC) přechází transformující DNA do buněk Elektroporace: •buňky jsou vystaveny krátkému elektrickému impulsu o vysokém napětí – v buněčné stěně vznikají póry, kterýmiexogenní DNA vstupuje do buněk 23 Transformace bakteriálních buněk • závislá na stavu kompetence buněk • u některých bakterií se stav kompetence objevuje přirozeně (S. pneumoniae) • u E.coli se připravuje uměle - promytím buněk ledovým CaCl2 - přidání DNA - mírný teplotní „šok“ (2 min, 42oC) - krátká inkubace v růstovém médiu (zotavení bakterií, exprese selekčního markeru) 24 cloning 6 Transformace tepelným šokem s využitím CaCl2 25 Transformace bakterií elektroporací •Promytí buněk vodou (odmytí elektrolytů z růstového média) •krátký elektrický puls o vysokém napětí •dočasné otvory v buněčném obalu •vstup DNA do buňky 26 Transformace elektroporací cloning7 27 Žádoucí vlastnosti plazmidových vektorů 1.Autonomní replikace v bakteriální buňce 2.Možnost tvorby více kopií v buňce 3.Plazmid by neměl být přenositelný konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) 4.Přítomnost restrikčních míst, využitelných pro klonování 5.Přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) 6.Velikost by měla být co nejmenší (zvýšení účinnosti transformace) 28 Selekční markery •Nezbytné pro funkci vektoru •procesy ligace i transformace jsou málo účinné: max. 1% bakteriálních buněk (E.coli) DNA přijme, v praxi obvykle méně •nutnost zabránit v růstu netransformovaným buňkám •obvykle zajištěno genem, který hostitelským buňkám poskytne rezistenci na antibiotikum 29 Gen bla •kóduje enzym b-laktamázu •b-laktamáza hydrolyzuje b-laktamová antibiotika (příbuzná penicilinu), např. ampicilin 30 Inzerční inaktivace •projev úspěšného začlenění fragmentu DNA do klonovacího místa na fenotypu transformovaných bakterií –klonovací místo je ve vektoru umístěno v genu zodpovědném za rezistenci hostitelské buňky k antibiotiku –inzerce klonované DNA způsobí ztrátu funkce tohoto genu –buňky nesoucí rekombinantní plazmid jsou k danému antibiotiku citlivé, buňky nesoucí prázdný vektor jsou rezistentní 31 Gen lacZ byl přerušen začleněním klonovaného fragmentu DNA: na X-gal plotnách vzniknou bílé kolonie Princip inzerční inaktivace 32 Růst na selekčním médiu cloning8 33 Modro-bílý test •Modré kolonie reprezentují ampicilin-rezistentní bakterie obsahující plazmidový vektor a exprimující funkční alfa fragment z intaktní LacZ alfa kódující sekvence. Bílé kolonie reprezentují ampicilin-rezistentní bakterie obsahující plazmidový vektor s inzertem a exprimující nefunkční alfa fragment LacZ • 34 Výhody inzerční inaktivace •Jednoduše poskytuje informace o úspěšnosti •ligace: •bakterie přijala plazmid (je AmpR) •bílá barva kolonie signalizuje, že přijatý plazmid nevznikl recirkularizací prázdného vektoru 35 Klonování v plazmidu pBR322 – příklad inzerční inaktivace 21 36 Vektory pro speciální účely •expresní vektory: obsahují promotor, kterým lze zajistit produkci cizího proteinu v hostitelských buňkách (vhodné inducibilní systémy) •kyvadlové vektory: obsahují dva počátky replikace – možnost propagace ve dvou různých organismech (např. E.coli a B. subtilis) • 37 Expresní vektory •Upraven nejen pro klonování DNA, ale také pro její expresi •Obsahují signály pro: • - iniciaci transkripce (promotor) • - iniciaci translace (vazebné místo pro ribozóm a startovní kodon) u translačních fúzních vektorů • 38 2 typy expresních vektorů •1. Transkripční fúzní vektor •Obsahuje promotor, translační signály musí poskytnout klonovaná DNA • •2. Translační fúzní vektor •Obsahuje signály pro iniciaci transkripce i translace •Klonovaný fragment se začleňuje do kódující oblasti genu ve vektoru •Inzert musí respektovat čtecí rámec Potřebné regulační sekvence pro expresi D1 40 Fágové vektory –odvozené od fága l Výhody: •rekombinantní DNA lze sbalit do kapsidů a přenést do hostitelských buněk infekcí (o několik řádů vyšší účinnost přenosu než při transformaci plazmidovou DNA) •v jedné zkumavce lze uchovávat ve formě fágových virionů celou genovou knihovnu (např. několi miliónů rekombinantních klonů) •vhodné pro klonování větších fragmentů DNA (výhodné pro tvorbu genových knihoven) • Pozn: rekombinantní plazmidy s velkými inzerty jsou méně stabilní (nízká klonovací kapacita), transformace je méně účinná, nízký výtěžek při purifikaci z E. coli 41 Vektory odvozené od fága l 22 42 Umělý kvasinkový chromozom (YAC) •Obsahuje 2 kvasinkové telomery, které umožňují jeho udržování v kvasinkách jako lineární strukturu •Centromera •Sekvence pro replikaci •Selektovatelné signální znaky •Replikuje se v buňkách E.coli i kvasinkách •Vhodné pro klonování velkých fragmentů DNA (0,2 – 2 Mb) 43 d_22 44 Umělý bakteriální chromozóm (BAC) •Bakteriální vektory s nižší klonovací kapacitou než YAC •BAC = vektor založený na F plazmidu, který pojme inserty až do velikosti 300 kb •Výrazně vyšší stabilita než YAC •Hojně používané u sekvenačních projektů 45 Vektory pro savčí buňky •Replikace extrachromozomálních elementů typu plazmidů je v savčích buňkách obtížná •Vektory s počátkem replikace viru SV40 se replikují epizomálně v některých savčích buňkách (např. buňky COS) •Většinou stabilní klony vznikají po začlenění DNA do chromozomu • 46 Retrovirové vektory •využití schopnosti retrovirů zajistit integraci DNA do genomu •využití možnosti „trans“ komplementace retrovirových funkcí defektním pomocným („helper“) virem •Funkce, které nelze „trans“ komplementovat, musí být přítomny na samotném vektoru (LTR a místo psi) 47 Klonovací kapacita vektorů: přehled Klonovací vektor Velikost inzertu Běžné plazmidové vektory 0-10 kb l Inzerční vektory 0-10 kb l Substituční vektory 9-23 kb Kosmidové vektory 30-44 kb BAC vektory £300 kb YAC vektory 0.2 – 2.0 Mb