Metody molekulární diagnostiky Molekulární diagnostika Typizace Léčba choroby Prevence Identifikace biologické makromolekuly / vyhledání zdroje / původce Identifikace Fylogenetické studie Genotypové metody •Výhodou genotypových metod oproti fenotypovým je –nezávislost na expresi specifických genů v umělém prostředí (laboratorní média) –genotypové znaky jsou na rozdíl od fenotypových (biotyp, sérotyp, antibiogram) relativně stálé –dávají reprodukovatelné výsledky analýz i za různých laboratorních podmínek –jsou rychlé a zpravidla nevyžadují předchozí kultivaci mikroorganismů •identifikace patogenů, které nelze snadno nebo vůbec kultivovat –metody založené na chromozomální DNA mají na rozdíl od fenotypových metod 100% typovatelnost, protože všechny baktérie mají chromozóm a proto se tyto metody zaměřují na stupeň a povahu polymorfismů DNA Charakteristika typizačních systémů. Molekulární metody pro detekci polymorfizmů v genomech •Cílem je charakterizace –Chromozomální DNA –Plazmidové DNA –Celkové genomové DNA –Genů nebo jejich částí •Posouzení parametrů genomu a výběr relevantních sekvencí pro detekci polymorfizmů •2 skupiny metod –Přímé •Detekce polymorfizmů na úrovni primární sruktury (např. sekvencování, real-time PCR pro detekci SNP) •Nejpřesnější, ale časově a finančně náročné –Nepřímé •Poskytují různé typy fingerprintů (otisk DNA) dostupných ve formě obrazů gelu nebo hybridizačních membrán •Rozdělují se na techniky –bez amplifikace DNA –s amplifikací DNA –Identifikace konformačních polymorfizmů nukleových kyselin Metody pro detekci polymorfizmů v genomech •Přímá metoda: –Sangerovo sekvencování –sekvenování nové generace –Jednonukleotidové polymorfizmy detekované pomocí vysoce výkonných metod •Nepřímé metody: fingerprinting (otisky DNA) 1.RFLP – polymorfizmus délek restrikčních fragmentů 2.AFLP – polymorfizmus délek amplifikovaných fragmentů 3.SSLP– polymorfizmus délek fragmentů s jednoduchou repeticí 4.SSCP – polymorfizmus konformace jednořetězců DNA fingerprinting copy Klasifikace technik pro fingerprinting DNA prokaryot Hodnocení kvality typizačního systému •Každý typizační systém je charakterizován 7 kritériemi (Maslow, 1993) –Typovatelnost –Reprodukovatelnost –Stálost –Rozlišovací síla –Epidemiologická shoda –Snadnost interpretace –Jednoduchost provedení RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism Polymorfizmus délky restrikčních fragmentů Princip RFLP • p_922 RFLP vzniká přestavbami sekvencí inzercemi delecemi substitucemi bazí uvnitř restrikčních míst Restrikční analýza chromozomální DNA (REA) •Jedna z prvních DNA typizačních metod zahrnující analýzu počtu a velikosti restrikčních fragmentů vznikajících štěpením specifickou restrikční endonukleázou (RE). •Rozdíly mezi fragmenty se označují jako polymorfizmus délek restrikčních fragmentů (RFLP). •Metoda restrikční analýzy zahrnuje následující kroky: –izolace chromozomární DNA –výběr vhodné RE –štěpení RE –elektroforéza DNA fragmentů vizualizace barvením v etidiumbromidu a densitometrické vyhodnocení –může být proveden na celkové DNA nebo pouze genech nebo jejich částech –alternativa: hybridizace se sondou a selektivní detekce genu REA Makrorestrikční analýza chromozomální DNA pomocí PFGE •Metoda slouží pro stanovení RFLP genomové DNA při použití restrikčních endonukleáz, které štěpí DNA na < 30 místech. •Vznikají velké fragmenty chromozomální DNA (10 - 1000 kbp), které jsou separovány pulzní gelovou elektroforézou. •Pro izolaci intaktní DNA není vhodná konvenční metoda, ale používá se specifický postup. PFGE-gel1 Příklad pulzní gelové elektroforézy DNA různých kmenů Staphylococcus carnosus. Princip selektivní hybridizace Ribo0 Ribotypizace gel Příklad hybridizace se sondou specifickou pro16S rDNA. selektivní hybridizace přináší značné zjednodušení při interpretaci spekter fragmentů DNA Princip selektivní hybridizace Ribo0 Příklad hybridizace se sondou specifickou pro16S rDNA. selektivní hybridizace přináší značné zjednodušení při interpretaci spekter fragmentů DNA Rea2 Sondy používané pro SRFH u eukaryot •Jednolokusové sondy –Hybridizují k jedné hypervariabilní oblasti genomu a vytvářejí vzor o 1-2 proužcích –Pro identifikační účely se používá směs („kokteil“) jednolokusových sond –Jsou citlivější a dávají jednodušší obraz než multilokusové sondy –Pro hybridizaci je třeba min 10 ng DNA •Mnoholokusové sondy –Hybridizují k repetitivním sekvencím vyskytujícím se s četností 100 – 1000 v genomu –Při Southernově hybridizaci se detekuje 20 – 30 proužků –U člověka se využívá minisatelitů, z nichž 60 má společnou konvenční sekvenci –Délka repeticí u každé z alel je polymorfní –Pravděpodobnost, že 2 jedinci budou mít stejnou délku 1 repetice po štěpení restriktázou HinfI je 0,25. Pokud uvažujeme 36 detekovatelných lokusů (proužků), je pravděpodobnost výskytu stejného vzoru –0,2536=10-22 –Nevýhodou je vysoký nárok na množství DNA (250 ng) –Příklad hybridizace se sondou připravenou z minisatelitu v myoglobinovém genu s konvenční sekvencí GGAGGTGGGCAGGANG Bezjména-2 Bezjména-1 Bezjména-4 Prenatální diagnóza hemofilie pomocí PCR-RFLP •V analyzované oblasti DNA mohou být až tři místa BclI, přičemž jedno z těchto míst v intronu 18 je polymorfní. •Fragment DNA o délce 142 bp obklopující polymorfní místo BclI je nasyntetizován s pomocí oligonukleotidových primerů. •Normální alela má BclI místo a proto je fragment štěpen na 99 + 43 bp fragmenty •Polymorfní místo může –chybět na obou chromozomech (5), –přítomné na jednom a chybět u druhého (2,4,7) –nebo být přítomné na obou (1,3,6). PCR-RFLP diploid AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphism polymorfizmus délek amplifikovaných fragmentů •Jakákoli PCR technika poskytující vznik více než jednoho produktu (fingerprint) –AP-PCR (RAPD) – náhodně amplifikovaná DNA –Rep-PCR – interrepetitivní PCR, primery odvozeny z vícekopiových repetitivních motivů –Alu-PCR –ITS-PCR (RS-PCR) – Amplifikace mezerníků v genech pro funkční RNA • 17 18 AluI-PCR alu 19 Analýza mezerníkových oblastí v rDNA (RS-PCR, PCR-ribotypizace) •U prokaryot obsahují rDNA operony geny pro všechny tři typy rRNA (16S, 23S a 5S). •Geny pro 16S a 23S rRNA jsou odděleny mezerníkovou oblastí, která se liší délkou v závislosti na druhu (od 278 bp u mykobakterií do do 2 kb u borrelií). Navíc u většiny Eubakterií se vyskytuje více kopií rDNA operonu, u nichž se vyskytují menší rozdíly v délce mezerníků. rDNA-spacer PCR 100 bp ® 500 bp ® U Staphylococcus aureus se nachází v genomu 6 rrn operonů, všech 6 mezerníků mezi 16S a 23S rRNA se může lišit svou délkou. SSLP - Simple Sequence Length Polymorphism Polymorfizmus délky jednoduchých repetitivních sekvencí VNTR – Variable Number of Tandem Repeats Polymorfizmus délky jednoduchých repetitivních sekvencí (SSLP-PCR) •Jednoduché repetitivní sekvence (SSR) jsou tandemové repetice o délce 2 až 10 bp (např. mikrosatelity) přítomné v eukaryotických genomech s četností až 80. •V důsledku mutací nebo rekombinace se počet těchto repeticí může zvýšit nebo snížit. •Primery pro tuto metodu jsou navrhovány tak, aby se připojovaly oblastem ohraničujícím SSR. –Tyto ohraničující sekvence bývají konzervativní pouze v rámci druhu a proto je nutné navrhovat pro každý druh novou sadu primerů. •Jelikož je mezi jedinci počet repeticí značně variabilní, výsledkem amplifikace je vznik různě dlouhých PCR produktů, které jsou separovány na polyakrylamidové nebo agarózové gelové elektroforéze s vysokým rozlišením. •Rozdílů v délce fragmentů genomové DNA podmíněné přítomností SSR se používá k odlišení blízce příbuzných jedinců a k detekci vztahů mezi nimi zejména v genetice populací. Příklad amplifikace mikrosatelitů Amplifikace repeticí pomocí PCR Ø Počet repeticí je velice variabilní mezi jedinci = Repetice (např. GA) Jedinečné ohraničující oblasti Ø Struktura Návrh pimerů ( ) komplementárních k ohraničujícím sekvencím CODIS markery pro identifikaci u člověka •The official order of the 13 core CODIS loci given within the CODIS system itself is: –CSF1PO –FGA –THO1 –TPOX –VWA –D3S1358 –D5S818 –D7S820 –D8S1179 –D13S317 –D16S539 –D18S51 –D21S11 • •Sometimes, the following two loci used more in Europe than America are added to make a standard 15: • –D2S1338 –D19S433 • • • Příklad elektroforetogramu s výsledkem multiplex PCR s fluorescenčně značenými primery X, Y, X Y Stanovení SSLP na automatickém sekvenátoru 5. SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism Polymorfizmus konformace jednořetězců SSCP a DSCP: Polymorfizmy detekované speciálními elektroforetickými metodami •Odhalení lokálních polymorfizmů v DNA je závislé na použití speciálních elektroforetických • •Metody jsou vhodné zejména pro srovnání polymorfizmu na úrovni genů, aniž by bylo nutné stanovovat přímo jejich sekvenci. • •Úseky DNA s vhodnou velikostí (100 - 2500 bp) se pro analýzy připravují pomocí PCR Konformační polymorfizmus jednořetězců (Single-Strand Conformation Polymorphism - SSCP) •SSCP analýza se obvykle používá pro detekci sekvenčních rozdílů mezi různými alelami téhož genu •Metoda je vhodná pro sledování změn (mutací) na krátkých fragmentech DNA o velikosti 150 - 400 bp •Metoda využívá vytváření rozdílné sekvenčně specifické intramolekulární struktury ssDNA ovlivňující rychlost pohybu při nedenaturujících elektroforetických podmínkách •U delších fragmentů se snižuje diskriminační účinnost a reprodukovatelnost Princip metody SSCP •zvýšení účinnosti SSCP se dosahuje různými modifikacemi: –RFLP-SSCP •přístup kombinující štěpení DNA restriktázami s následnou SSCP •vzdálenost polymorfizmu od konce fragmentu –Vazbou různých látek ovlivňujících elektroforetickou mobilitu ssDNA –RNA-SSCP (je nutno připravit ssRNA transkripcí pomocí T7- nebo SP6-RNA polymerázy) • •SSCP je vhodná pro analýzu mutací v prokaryotických (rDNA), eukaryotických a virových genomech •Homozygotní DNA vytváří 2 elektroforetické formy •Heterozygotní DNA obsahující sekvence dvou různých alel vytváří 4 elektroforetické formy Bezjména-1 1