Transkripce přepis genetické informace z DNA do RNA, při které DNA slouží jako matrice pro syntézu RNA. Reakci katalyzuje RNA-polymeráza (transkriptáza) Zpětná transkripce (reverzní transkripce: RT) - přepis genetické informace z RNA do DNA. Reakci katalyzuje zpětná (reverzní) transkriptáza Transkripce sekvence DNA do sekvence RNA DNA 3- TAC(E AACGCGAATTC- 5' • • • • AUGG 5 RNA 3'-T A C C C AACGCGAATTC-5' RNA ÁŮGGGŮLJG 5'-► 3' 2 Značení řetězců DNA podle jejich funkce dsDNA 5' -► 3' kódující (pozitivní) [nepřepisující se] 5 ..............................3'* 3 ..............................5 an ti kódující (negativní) (-DNA) [přepisující se] I transkripce i 5 ..............................3'<* mRNA 5' GATC 3' 3' CTAG 5' 5' GAUČ 3' Směr syntézy mRNA při transkripci, směr translace mRNA a směr syntézy polypeptidů Syntéza polypeptidů N-konec.....C-konec Transkripce u prokaryot je spřažena s translací, u eukaryot jsou tyto procesy odděleny Prokaryota Eukaryota 5 Srovnání prokaryotické a eukaryotícké mRNA Prokaryotní mRNA kódující sekvence \ PXPXP 1 protein a nekódující sekvence \ 1 I protein ß protein y 3' Polygen ní mRNA Eukaryotní mRNA ®f<£XE®! CH, i '_ 51 -čepička kódující sekvence \ I nekódující sekvence 3' "Iaaaaa Monogen ní mRNA (a) protein 6 Srovnání prokaryotických (jednoduchých) strukturních genů s eukaryotickými (složenými) geny kódující oblast bakteriální gen kódující oblasti nekódující oblasti (exony) {introny} eukaryontní gen Geny mohou být transkribovány z obou řetězců; jako templát je na daném úseku DNA využíván obvykle jen jeden z řetězců RNA-transkripty dna z chromosomu E. coli ^m^^^m^^m^^ anti-sense RNA 5" gen a \^ gen d gen e -^^m 3. wm áí. mmmmmmi 1 m a— ml. mm 3" gen b gen c gen f gen g 5" 5000 nukleotidových párů 8 Typy RNA vznikající při transkripci u různých typů organismů ' Total RNA Coding RNA 4% of total Noncoding RNA 96% of total Pre-mRNA (hnRNA) mRNA Pre-rRNA Pre-tRNA rRNA snRNA snoRNA scRNA tmRNA and various other types tRNA V lidském genomu je přepisováno -75% sekvencí, v buňkách různých tkání max. 57% KEY .... All organisms Eukaryotes only Bacteria only 9 Molekulární druhy molekul RNA vytvářené transkripcí u eukaryot Transkripce a úpravy RNA probihaji u Jádře. Translace probihS v cytoptamí. Enzymy katalyzující transkripci A. DNA-dependentní RNA-polymeráza (RNA-polymeráza, transkriptáza) matricí je řetězec DNA (prokaryota, eukaryota, DNA-viry) B. RNA-dependentní DNA-polymeráza (zpětná/reverzní transkriptáza) matricí je řetězec RNA (retroviry, retrotranspozony, retroelementy) Primární transkripty tvořené na řetězci DNA přepisy strukturních genů (mRNA, pre-mRNA/hnRNA) O přepisy genů pro funkční typy RNA • pre-rRNA • pre-tRNA • malé RNA (snRNA, snoRNA, scRNA, miRNA, ...) 11 Funkce podjednotek RNA-polymerázy u E. coli podmiňuje vazbu ribonukleotidů na polymerázu udržuje stabilitu molekuly podmiňuje vazbu RNA-polymerázy k promotoru podmiňuje spojení RNA-polymerázy s matricovým řetězcem 12 Struktura RNA-polymerázy 3' 5' jaws in closed configuration rewinding DNA double helix ribonucleotide triphosphates direction of transcription flap in closed position/ RNAexrt ^5' channel newly synthesized RNA transcript active site short region of DNA/RNA helix ribonucleotide triphosphate tunnel newly synthesized RNA transcript template DNA strand direction of transcription Mg at ribonucleotide active site triphosphate uptake RNA polymerase channel 13 Strukturní gen prokaryot s vyznačením signálů pro transkripci a translaci transkripčné regulačné signály translačné regulačné signály ■* oblasť -35 PRIBNOWOV BOX iniciácia SD -10 transkripcie iniciačný kodón rozpoznávacia sekvencia ' vazbové miesto pre RNA-polymerázu pre RNA-polymerázu + 1 väzbové miesto pre ribozóm DNA TGTTGACA TATAATG ... A TAAGGAG 12 13±2 4-9 3-9 2-1t 18-129 m RNA í tga ,_ oblasť kódujúca termin ičný terminátor polypeptidový kodón transkripcie reťazec protein Sekvence po směru transkripce (downstream) a proti směru transkripce (upstream) Funkční elementy bakteriálního promotoru -35 -10 + KA.G) I TTGACAT 16-18b promotor < silný slabý TATAAT P " „ mRNA Pribnowův startovací box nukleotid box = krátká sekvence o stejné funkci sekvence -10 templätové vlákno sekvence -35 T T A -• A 5-9 A " transkripce - nebe 5' C AACTGT TŤGÄCÄ 16-19 bp netemplátové vlákno sekvence proti směru transkripce A A T A G -K- sekvence po směru transkripce lokální rozvíjení Sekvence přirozených a hybridních promotorů KONSENSUS lac trp , XPL recA -35 Region -10 Region 123456789 1011121314151617 • * • T TG A:C A • » • * * * • • • * • • • • ♦ * • TATA A T ♦ • G GCT T T ACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAT T G T C TGT TGACAAT TAAT C A T C G A A C TAGT TAACTAG G TG T TGACA TAAATACCA CTGGCGGTGAT AC TG A CACT TGATACTGTAT G A A GCA T A C A G T AT AAT TG tad tacU C TGT TGACAATTAATCAT CTGTTGACAATT AATCAT CGGCTCGTATAATG T C G A A CTAGTTTAAT G T 15-18 bp 5-9 bp Hybridní promotory tac = lac x trp Transkripce bakteriálního genu RNA-polymerázou 1. iniciace 2. elongace 3. terminace 5'l 3'i terminace a uvolnění polymerázy a hotového řetězce RNA 3|] DNA J znovunavazaru sigma-faktoru 17 Vytváření molekul mRNA na prokaryotické transkripční jednotce a spřažení transkripce a translace u prokaryot transkripty (RNA) genů podléhají translaci na mnoha ribozomech současně směr transkripce 18 Výměna podjednotek vázajících se na RNA-polymerázu v průběhu transkripce sigma-faktor JLfrRNA-PoIvmeráza a- faktor rozeznává sekvenci -35 na promotoruA Po skončení této funkce se z RNA-polymerázy I uvolňuje. RNA-polymeráza katalyzuje transkripci L bez sigma-faktoru, který je v průběhu elongace) nahrazen NúsA-proteinem B. subtilis má více sigma faktorů \ Term i nace RNA-polymeráza se z terminátoru uvolní a NusA-protein je opět nahrazen sigma-faktorem. Obr. 148 Vzájemné výměny sigma-faktoru a NusA-proteinu na RNA-polymeráze Terminace transkripce nezávislá na Ró-faktoru Zastavení pohybu RNA-polymerázy Uvolnění hotové RNA Uvolnění RNA-polymerázy z DNA 19 Vazba prokaryotické RNA-polymerázy na promotor RNA-polymeráza (holoenzym) -50 -40 -30 + -20 RNA-polymeráza zrněni tvar i velikost po rozpoznání promotoru sigma-faktorem. uzavřený binární komplex Obr. 144a iniciace transkripce otevřený binární komplex Obr. 144b Iniciace transkripce +20 bp +20 bp a - stabilita holoenzym u P - vazba rNTP na polymerázu P'- spojení s matricovým řetězcem a - vazba k promotoru Denaturace v oblasti +1 oblast bohatá na páry A:T 20 Iniciace transkripce -40 ■30 -20 vazba sigma-faktoru na-35 +10 +20 +30 bp nascentní RNA Při zakončení fáze iniciace a vstupu do fáze elongace mění sigma-faktor i RNA-polymeráza svou konformaci, což se projevuje změnou v její velikosti i tvaru. Sgma-faktor se uvolňuje z RNA-polymerázy. Iniciační fáze transkripce u prokaryot Rozpoznání sekvence -10 a -35 sigma faktorem Core enzyme IfilMlIÍ....... +1 liiiis iiii Typy terminátorů transkripce u prokaryot sekvence terminátorů přepsané do mRNA a) Sekvence bohatá na GC 1 I I I I I I U A A C A vlásenka —. se smyčkou OG G-C U=A A=U IHA G^C U-A G^C G U -r— b) C A A U C A A U U U U U U U A C C A U Terminátory: a) nezávislý na rho faktoru b) závislý na rho Strukturní rozdíly mezi dvěma typy prokaryotických terminátorů (jejich transkriptů) 23 Struktura terminátorů nezávislých na ró-faktoru a jejich přepis do mRNA jedinečná 24 Struktura transkripčnftio terminátoru nezávislého na rho faktoru DNA 5'- CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTTCTTTAATGA -3' 3'- GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAAGAAATTACT -5' 1111■1•11 1 1 1 1 *'111 1 1 1 1 1 1 1 ■ 1 ■11111 1 1 1 11 1 1 1 111 ■ 1 1 templátovévlákno DNA transkripce RNA-transkript 5'- CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU OH-3" rychlé skládáni RNA 1' složená RNA /uTc\ U G G ••• C A ••- U C ... G C ... G G ... C C ... G C ... G G ..« C A A* 5'- C C C A C Složený řetězec RNA napomáha terminaci řetězce. ^^^^ U U U U OH-3' 25 Termínace transkripce mRNA mRNA DNA vlásenka párování A:U napomáhá uvolnění RNA uuuuu 26 i. recognition II. Elongation SIGMA IS RELEASED NusA III. NusA is picked up NusA DNA IV. Termination DNA Sigma displaces NusA Výměna sigma faktoru a NusA proteinu na RNA-polymeráze - Sigma faktor: iniciace - NusA protein - terminace Terminace transkripce za účasti Rho faktoru RNA polymerase Elongační fáze transkripce Připojení Rho-faktoru a jeho pohyb po mRNA Připojení Rho-faktoru k sekvenci terminátoru Rho faktor rozmotává hybridní DNA-RNA Uvolnění Rho-faktoru, RNA-polymerázy a mRNA Terminace transkripce závislá na Rho-faktoru Elongační fáze I M I IIMUnTTTT Rho-faktor se pohybuje za RNA-polymerázou Rho-faktor je rozeznáván NusA-proteinem, který je přechodnou součástí RNA-polymerázy. Rho-faktor katalyzuje po vazbě na tento protein odvíjení mRNA z DNA-řetězce a uvolnění RNA-polymerázy. K tomu je zapotřebí ATP, který je hydrolyzován Rho-faktorem vyznačujícím se aktivitou ATPázy. .....I i Hl I I I I I I Jakmile se RNA-polymeráza zastaví na terminátorové vlásence, Rho-faktor ji dostihne a oddělí RNA od DNA (Rho = helikáza) 29 Transkripce transkripční jednotky pro rRNA (rrn operony) DNA geny tRNA 16S-rRNA tRNA 23S-rRNA |5S-rRNA| | tRNA promotory pre-rRNA transkripce terminátory 1 posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) r~\ s"\ 16S-rRNA tRNA 23S-rRNA 5S-rRNA tRNA 30 Transkripce transkripční jednotky pro tRNA promotor □j DNA pre-tRNA geny tRNA tRNA transkripce posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) + 4° 4° 4° 5l tRNA tRNA tRNA tRNA ' 1 mRNA 3' 31 Transkripce a úprava genů pro rRNA u bakterií a savců Bakterie Savci gen pro rRNA dna AYAWAyAVAyAYA^^^^ transkripce prekruzor , rRNA30S | prekurzor 4S 16S rRNA tRNA i i I-1 (a) 16S 4S rRNA tRNA 1 štěpení endoribonukleázami prekurzor 23S rRNA prekurzor 5S rRNA H C druhotné štěpení endoribonukleázou a zkrácení exoribonukleázami □ 23S rRNA 5S rRNA gen rjro rRNA dna \YAWA/AYAyAVAVAWAVAYAYAYAyA\ primární transkript - prekurzor rRNA45S transkripce 13 000 nukleotidů 5'ppp i -4 rozložené oblasti primárního transkriptu 1874 nukleotidů 5' 1 (b) 18S rRNA 160 nukleotidů 5' 3' 5 5,8S rRNA úpravy RNA 4718 nukleotidů 28S rRNA 10H 3' 32 Úprava pre-tRNA u E. coli * probíhá působením enzymů xonukleázi I I O —O 0 -o-3' > 150 nucleotides endonukleáza tRNA-nukleotidyltransferáza dodatečné připojení ACC 33 Transkripce u eukaryot cytoplasm a buněčné jádro introny exony gen primární RNA-transkript transkripce přidání 5' -Čepičky a poly(a)-konce ■zzhaaaa sestřih rna aaaa export aaaa Jtransuv l Eukaryotícké DNA-dependentní RNA-polymerázy Matricí pro syntézu RNA je u všech těchto polymeráz negativní DNA-řetězec. Existují tři druhy těchto RNA-polymeráz: • RNA-polymeráza I, která katalyzuje syntézu pre-rRNA. Nachází se v ja-dérku a není citlivá k a-amanitinu Geny I. třídy • RNA-polymeráza II, která katalyzuje syntézu hnRNA a některých malých rRNA. Je citlivá k a-amanitinu. Vyskytuje se v karyoplazmě. Sestává přibližně z 10 protomerů, z nichž tři největší jsou homoloqické s protomery a, 6 a Bprokaryotické RNA-polymerázy. Protomer 6 váže volné ribonukleotidy, 6' se váže k DNA a a spojuje protomery navzájem. Ostatní protomery se neliší od protomerů polymeráz I a III. Geny II. třídy • RNA-polymeráza III, která katalyzuje syntézu pre-tRNA, 5S-rRNA a některých malých RNA. Citlivost k a-amanitinu je druhově specifická. Vyskytuje se v karyoplazmě. Geny III. třídy Každá z uvedených tří RNA-polymeráz vyžaduje svůj specifický promotor, na který se váže. To je rozdíl proti prokaryotům, která mají jen jeden typ RNA-polymerázy (a jeden typ promotoru) Elementy eukaryotíckého promotoru (Pol II) +1 (startovací nukleotid + Inr-element) - iniciátor TATA-box (Hognessův b.) -34 až -26 - TATA-box CAAT-box -75 až -80 "1 Elementy proti směru >- transkripce (upstream elements) GC-box -90 Oktamer ATTTGCAT oktamerový box počátek transkripce +1 ATTTGCAT konzervativní sekvence \ GGGCGG GGCCAATCT konzervativní konzervativní sekvence sekvence / \ / \ GGGCGG TATAAAA konzervativní konzervativní sekvence sekvence 36 Struktura promotoru RNA-polymerázy II obecné transkripční faktory SP1 bazálni transkripční startovací faktor nukleotid TFUD ATTTGCAT- GG G C G G—G GC C A ATCT—T AT A A A A PyAPyPyPyPyPy -100 -90 ■75 30 Inr-element konvenční sekvence elementů eukaryotického promotoru (iniciátor) Promotory různých genů se lišt počtem, umístěním a kombinací těchto elementů. Všechny promotory však musí obsahovat jeden nebo více elementů, aby mohly zahájit bazátní transkripci. Provozní geny mají jen fnr-efement bez TATA-boxu (Hognessův box). Poznámka Promotory RNA-pofymerázy II u některých genů nemají ani TATA-box ani Inr-element Transkripce těchto genů může začít z různých míst seřazených za sebou. 37 Vazebná místa eukaryotického promotoru pro RNA-polymerázu II Promoter 0 Start of transcription Iniciace transkripce eukaryotních genů RNA-polymerázou II za účasti obecných transkripčních faktorů TATA box (A) (B) začátek transkripce TFIID TRI B pro zahájení transkripce je nutné navázáni TF na TATA-box a na RNA-polymerázu (o TRIE O- TFIIH TRIFr-^dalši fakton RNA-polymeráza I (D) ATP h UTP, ATP CTP, GTP TRANSKRIPCE ZAC(NÁ RNA-polymeráza je fosforylována TFIIH (+ATP), mění konformaci a zahajuje transkripci 39 i-*- místopoiáthu A transkripce O Na TATA box se váže TF1ID. .......11 lllllllllllllllllllll ......Illllllllllllllllllll K iniciačnímu kompletu se připojuje TFJIA. 1 1 11 1 1 ......1......1.....1....... Ke komplexu se připojuje TFIIF, který má rozplélad aktivitu; zároveň se pripojuje polymeraza II im. Q K iniciačnímu komplexu se váže TFIIE. Iniciace transkripce RNA-polymerázou II TFIID obsahuje TATA-vazebný protein (TBP), kterým se váže k TATA-boxu 40 RNA-polymeráza II Posttranskrípční úpravy hnRNA Úpravy konců • 5'-konec: připojení čepičky (angl. cap) • 3'-konec: polyadenylace Úpravy vnitřní sekvence • Metylace • Sestřih • Editace (redakční úprava) 41 Posttranskripční úprava transkriptů strukturních genů eukaryot intron DNA jty/ŮOWFMTÍX^ transkripce pre-mRNA H. 0 0 C II II II ,CH -O-P-O-P-O-P-0 -CH OH H0\| 2 I I O" 0 O '2 /O 7-metylguanozin 0 O-CH, I s Q K S'-konci se připojuje 7-MG čepička. 1. Připojení čepičky 5'-čepička 5'-čepička 5'-čepička mRNA 5'-čepičkai fy Připojuje se úsek poly(A). 4Mř Q Intron se vyštěpí. -AAAAA(A)~i90 AAAAOH úsek 3'-poly(A) úsek 3'-poly(A) úsek 3'-poly{A) 2. Připojení (poly)A konce 3. Sestřih 42 Struktura čepičky í '-Tcnnec NH 7HS ■.+ |/'\|^ľ—o—!p-o—>:n 2 bází: h h/^ oh oh ôh oh m7G5 ppp5 -mRNA bá2e mRNA°-CH3 Rané stadium transkripce genu RNA-polymerázou II. RNA-polymeráza II 5' 3' pre-mRNA 5' 7-MG (a) \ 5'-čepička CH3-GpppNpNp CH, t 2'-0-metyltransferáza 5'- konec primárního CH3-GpppNpNp t=i T guanin-7-metyltransferáza GpppNpNp [=□ PPj + Pj guanylyltransferáza ' *" - GTP pppNpNp transkriplu (b) Biosyntetická dráha 7-MG čepičky. 43 Připojení sekvence poly (A) k 3'konci mRNA transkripční jednotka 5'- čepička Q Štěpení endonukleázou 5'- čepička Přidání úseku poly(A) poly(A)-poiymerázou. RNA-polymeráza AAUAAA y bohatá na GU endonukleoiytické štěpení AAUAAA \ Přepis polyadenylačního signálu 5'- čepička1 AAUAAA AAAAA (AL, 3' úsek poly(A) 44 Schéma polyadenylace 3'-konce hnRNA hnRNA Přepis polyadenylačního signálu část proti směru transkripce část po směru transkripce faktor rozpoznávací přepis polyadenylačního signály ostatní proteiny komplexu poly (A) • polymeráza štěp^ení^jgi i-1 Tato část se rozloží cxonukíeázou Iniciační fáze polyadenylace elongační fáze polyadenylace 1 I terminace 100 Transport hotové eukaryotické mRNA z jádra do cytoplazmy Faktory pro transport RNA CBC hnRNP DrotOinsr Proteiny vázající se na polyA mRNA «; připravená k transportu PŠb.1". • »■ * ■ - * « ' T ■ Jaderné póry Iniciační translační faktory elF-4G jaderné proteiny translace JADRO ^aaaaaa CYTOPLAZMA Některé z proteinů zůstávají v jádře, jiné jsou transportovány spolu s mRNA do cytoplazmy a zajišťují její stabilitu a iniciaci translace 46 Sestřih (splicing) - proces, při němž jsou odstraňovány introny Intron: nekódující sekvence uvnitř genu Objev: 1977: v genu adenovirů 1978: P-globin, imunoglobulin, ovalbumin, tRNA and rRNA. Známé typy intronů Intron type Where found GU-AG introns AU-AC introns Group 1 Group II Group III Twintrons Pre-tRNA introns Archael introns Eukaryotic nuclear pre-mRNA Eukaryotic nuclear pre-mRNA Eukaryotic nuclear pre-rRNA, organelle RNAs, few bacterial RNAs Organelle RNAst some prokaryotic RNAs Organelle RNAs Organelle RNAs Eukaryotic nuclear pre-tRNA Various RNAs 47 Důkaz přítomnosti intronů v genu pro ovalbumin Splicing diversity (a) Electron micrograph of ovalbumin DNA-mRIMA heteroduplex. RNA Schéma intronu s vyznačením konzervativních sekvencí sekvence potřebné pro vyštěpení íntronu část primárního transkriptu exon 1 exon 2 50 Schéma struktury intronu v hnRNA 5' exon 1 3' AAG C GüftAGU-AAG.GUAAGU i S'-místo sestřihu R = purinový nukleotid Y = pyrimidinový nukleotid N = jakýkoliv nukleotid A c = A nebo C -intron- -YNCUŘlC CUAAC 31 (Y^NCAG^G místo větvení Nukleotid poskytující skupinu 2''ÓH. pyrimidinový úsek Oblast bohatá na pyrimidinové nukleotidy. t 3'-místo sestřihu Sekvence a nukleotidy zakreslené do šedého rámečku jsou vysoce konzervativní (četnost 100 %). Ostatní sekvence se vyskytují v četnosti 70 - 95 %. Sekvence uvedené pod schématem intronu a exonu jsou sekvence, které byly zjištěny u savců. 51 Schéma transesterifikace při sestřihu hnRNA lasovitá intronexonová RNA 5' exon 1 —o lasovitá intronová RNA První transesterifikace (první přenos OH-skupiny). Druhá transesterifikace (druhý přenos OH-skupiny). Transesterifikace = přeměna jednoho fosfátového esteru v jiný probíhající přenosem OH-skupiny bez hydrolýzy a za nepřítomnosti ATP n. GTP 5' exon 1 exon 2 3' 52 5' O. □ O OH I o= P —o I On vyštěpená intronová sekvence v lasovité formě 2,5- fosfodiesterová vazba - o 5' -konec intronové sekvence O 2' I O O—P —O—i o= P —o On c) o o 0 OH 1 O OH I o= P —o" o= P —o o—i o u On i 3' 3' -konec intronové sekvence O OH 0= P —O I L31___j Průběh sestřihu strukturního genu - účast U snRNP místo 5' -sestřihu axon 1 Ul snRNP U2 snRNP místo 3' -sestřihu / / exon 2 ., . . , j y cast primárního i m 3' transkriptu U4/U6 snRNP U5 snRNP U4/U6 snRNP,. ,---- ■ U5 snRNP Lvurba „lasa" a štěpení místa 5' -sestřihu štěpení místa 3' -sestřihu a spojení obou exonú exon 1 intron a. exon 2 ll gu a i ag i i I I I 3 5P- / sestfíhové místo místo vetvení \ 3'- sestřihové místo B. ■<ľ—r snRNP U1 se váže na 5'- seslňhové misto a snRNP U2 se váže na misto větvení. Částice snRNP Small nuclear ribonucleoproteins Proteiny snRNP + U snRNA + specifické proteiny □ 3' Q Sestavuje se úplný spliceozom a štěpi trarskriptv 5'- ssstřihovém miste. štěpené 5'- sestřihavé místo Q 5'- konec intronu se připojuje k A v místě větveni za vzniku Jasovité struktury, uvolňují se U1 a U4_ □ 3' vystepena intronova sekvence ve formě lasa bude degradována v jádře V Štěpí se 3'- sestřihové misto a S - konec exonu 2 s9 pripojuje k 3'- konci exonu 1. Intron se uvolňuje ve tvaru lasa spolu s snRNP U2, U5 a U6. exon 1 exoti 2 mRNA 5' C □ 3' sestřižená mRNA Rozeznávání 5' -místa sestřihu a místa větvení malými jadernými U1-snRNA a U2-snRNA U1-snRNA 3' exon 1 5* Íguaagu 5' U2-snRNA O O ŕ U1-i U2-snRNA jsou komponenty částic U1- a U2-snRNP. Jsou tedy v komplexu s proteiny, které se uplatňují katalyticky při sestřihu a plní též štrukturálni funkci. • m'G UACUAC [_£y_jCAG místo větvení" exon 2 pyrimi; -intron- drnový úsek (u savců) 3' Všechny uvedené sekvence nukleotidů jsou vysoce konzervativní u S. cerevisiae a vyskytují se též u jiných organizmů s výjimkou trypanozom, která nemají sekvenci GUGUA v U2-snRNA. S. cerevisiae nemá pyrimidinový úsek. 55 Průběh sestřihu ve spliceosomu během úpravy pre-mRNA A. Před první transesterifikací je U1 snRNP zaměněna za U6 snRNP exon 1 GUAUGU+ 3' rearrangement GUAUGUf 3' B. A je rozpoznán BBP a pak U2 BBP (branchpoint bridging protein) exon 2 5' + UACUA AC C. Změna tvaru U5 přiblíží konce exonů exon 1 UACUACA U G AUG U Účast PRP-proteinů (upravujících prekurzorovou RNA) m í* '■ í ' •' * ' * a . ■• ' , A U G A 'J C ... o Mill -i ; A C U A G U : UACUACA/, ■ ■■"■■■•■.::A :v,;.\: T...... A L G A J í, U ■ U2 rearrangement Účast SR proteinů při rozpoznání míst sestřihu („exon definition hypothesis") intron exon -200 intron 10-105 nucleotides nucleotides nucleotides I ]l —----------ff — l SR hnRNP Proteiny SR (bohaté na serin a arginin) se během transkripce průběžně vážou na hranice exonů a pomáhají tak navádět částice snRNP do míst sestřihu Způsoby alternativního sestřihu hnRNA i s/V,.. „ 3 Jeden potenciální exon sousedící se dvěma konstitutivními Jeden potenciální exon s více 5'-místy sestřihu a s jedním 3'-místem M &'/\y s-/\z- IH9 i ■ JH 4 ĚSes&I ffiSSUH %ŽSSi Jerfen potenciální exon s více y-místy sestřihu a s jedním S'-místem Přeskakování jednoho potenciálního exonu 3' 5-/\3'