Translace - překlad genetické informace Složky translačního aparátu: • mRNA • 20 standardních aminokyselin (+ SeCys. Pyrrolyzin)) • molekuly tRNA • aminoacyl-tRNA-syntetázy • ribozomy • translační faktory: IF, EF, RF • ATP, GTP Struktura molekuly tRNA attached amino acid íPhe) 3' end T loop G A C A C/ iji ii b ii-ir v .c-s T \\t ^/ anticodor loop anticodon a clover leaf (A) (Bi {C í 5' GCGGAUUUAGCUCij P) 5AGCGCCAGA :UGGAGGUCCUGUGTWCGAUCCACAGAAUUCGCA 3' anticodon Sekundární struktura tRNA 3- aa (9 akceptorové rameno PARAKODON pseudouridinové rameno dihydrouridinové rameno DHU-smyčka\ f5 (An >m variabilní 5) smyčka antikodonové rameno Vazby, kterými vzniká terciární struktura tRNA. černo kroužky = standardní nukleotidy šedé kroužky = neobvyklé nukleotidy Srovnani struktury prokaryotickeho a eukaryotickeho ribozomu 70S Prokaryoticky ribozom MW 2,500,000 30S MW 1,600,000 / \ 5S rRNA 23S rRNA MW 900,000 / 120 nucleotides 2900 nucleotides 16S rRNA 1540 nucleotides 34 Droteins 21 proteins s SOS Eukaryoticky ribozom 5S rRNA 120 nucleotides 28S rRNA 5.8S rRNA 4700 nucleotides 160 nucleotides MW 1,400,000 1 18S rRNA 1900 nucleotides -49 proteins L -33 proteins r>i 4 Sekundární struktura 16S rRNA E. coli 5 Struktura molekul rRNA (5S a 23S) ve velké ribozomové podjednotce bakterií stanovená rentgenovou krystalografií Trojrozměrná struktura rRNA a L1 proteinu v poměrné velikosti Schema sekundární struktury 23S rRNA Peptidyltransferázová aktivita 23S rRNA - ribozymu 0 1-™- None I II III IV V VI Domain left out of the reaction mixture Purifikovaná 23S rRNA z E. coli katalyzuje vytvoření peptidové vazby mezi aminokysleinami vázanými na tRNA za tvorby dipeptidu Schopnost šesti domén 23S rRNA tvořit peptidovou vazbu. Odstranění domény V vedlo k neschopnosti vytvořit peptidovou vazbu, tj. tato doména má při vytváření peptidové vazby klíčovou funkci F = fenylalanin 7 NF = N-acetylfenylalanin Struktura velké podjednotky bakteriálního ribozomu Šedě = 5S a 23S rRNA; žlutě: L proteiny rRNA zodpovídá za: 1. Strukturu ribozomu 2. Interakci tRNA s mRNA při translaci 3. Katalýzu peptidové vazby 8 Struktura ribozomu E. coli s vyznačením funkčních míst schéma ribozomu 70S £ neboli místo P neboli peptidylové A neboli aminoacylové exitu tRNA vazebné místo vazebné místo (a) Standardní genetický kód Kodony První nukleotid Druhý nukleotid Třetí nukleotid U C A G U Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser N N nebo Secys A Leu Ser N (pyrrolyzin) Trp G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gin Arg A Leu Pro Gin Arg G A lle Thr Asn Ser U lle Thr Asn Ser C lle Thr Lys Arg A Met nebo 1 Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Kodonové rodiny jsou vyznačeny modře; N = nesmyslný kodon; I = iniciační kodon; Secys = kodon pro selenocystein, UAG = pyrrolyzin Čtení genetického kódu molekulami tRNA 20 standardních aminokyselin 1 20 aa-tRNA-syntetáz 1 22-45 molekulárních druhů tRNA (tj.antikodonů) 61 kodonů se smyslem a1 a2 | / \ tRNA tRNA! tRNA2 (2 antikodony) | / \ / \ Kolísavé párování bází 1 kodon 4 kodony 11 Kolísavé párování bazí na 5'antíkodonu tRNA tRNA (antikodonové rameno) B Antikodon '* -»-J 5' T* i i i AGG U C Kolísavá pozice (první báze antikodonu) 5'1 ■ ♦ ■ ♦ U/C 3' Kodon ^ Třetí pozice kodonu Jedna tRNA: AGG (antikodon) Dva kodony: UCU UCC 12 Možnosti čtení třetího nukleotidu kodonu podle pravidel kolísavého párování bází První nukleotid antikodonu Třetí nukleotid kodonu Možnost čtení Organizmy u UCAG Kodonové rodiny Mitochondrie, Mycoplasma, chloroplasty o5U UAG Kodonové rodiny (Ser UCN, Val, Thr, Ala) Eubakterie mem5U AG Dvoukodonové sady Mitochondrie, bakterie, eukaryota m5s2U A(G) Dvoukodonové sady Eubakterie, eukaryota G UC Dvoukodonové sady Všechny G uc Kodonové rodiny Bakterie Q UC Dvoukodonové sady Eubakterie, eukaryota Hyp UCA Arg CGN Eubakterie Hyp UCA Kodonové rodiny kromě Gly GGN Eukaryota A U Thr ACU, Arg Mycoplasma, mitochondrie kvasinek C G Všude Všechny Hyp = hypoxantin; Q = queozin 05U = uracil-5-oxyoctová kyselina; m5S2U = 5-metyl-2-tiouracil; mem5U = 5-metylkarbonylmetyl-2-tiouracil; Kolísavé párování bází mezi antikodonem CGI v tRNA a třemi odlišnými (synonymními) kodony Čtení kodonů pro serin molekulami tRNA Kodon tRNA Antikodon UCU tRNASeri AGG + kolísání UCC UCA tRNASer2 AGU + kolísání UCG AGU tRNASer3 UCG + kolísání AGC Izoakceptorové tRNA jsou tRNA o různých antikodonech vázající tutéž aminokyselinu 15 Srovnání využívání kodonů silně a slabě exprímovaných genů u E. colí Leu 26 33 -* 3 345 73 69 22 294 67 262 156 118 Met 140 27 130 Val 192 41 119 108 66 .'48 83 123 Pro 21 2 29 46 26 162 45 101 Thr 103 137 15 28 46 119 32 76 Ala 173 48 37 178 119 12Ô 107 149 His { Gin 19 75 38 169 95 59 90 166 Asn, Lys 13 159 101 98 259 106 163 44 Asp Glu 1 16 204 333 1 06 183 , 106 210 98 Arg 223 101 99 133 27 42 Ser Arg 10 49 3 1 56 61 28 17 Gly 226 174 124 140 14 42 66 U c A G U C A G U C A G Silně exprimované geny představuje 24 druhů mRNA s celkovým počtem 5253 kodonů. Mezi tyto geny patří gen pro RNA-polymerázu, geny pro dvanáct ribozomých proteinů, několik proteinů vnější membrány a geny pro elongační translační faktory. Slabě exprimované geny představuje 18 druhů mRNA s 5231 kodony. Patří sem několik represorových genů, gen pro transponázu a B-laktamázu. Kodony, které jsou čteny jen jedinou tŔNA a jejichž výběr je závislý na povaze a síle interakcí mezi kodonem a antikodonem, jsou v rámečku. Šipkami jsou označeny kodony, které jsou používány jen zřídka a mohou se podílet na regulaci genové exprese. 1f Klasifikace aminoacyl-tRNA-syntetáz První třída (acylace na C2') Druhá třída (acylace na C3') Specificita pro aminokyselinu Počet podjednotek Specificita pro aminokyselinu Počet podjednotek Arg monomerní Ala tetramerní Cys monomerní Asn dimerní Gin monomerní Asp dimerní Glu monomerní Gly tetramerní(a2p2) Ne monomerní His dimerní Leu monomerní Lys dimerní Met dimerní Phe tetramerní(a2p2) Trp dimerní Pro dimerní Tyr dimerní Ser dimerní Val monomerní Thr dimerní Např: tryptofanyl-tRNA-syntetáza Bez ohledu na společnou funkci jsou syntetázy strukturně odlišné Translace probíhá ve dvou etapách: 1. mimoribozomové (připojení aminokyseliny k její tRNA pomocí aminoacyl-tRNA-syntetázy) 2. ribozomové (na ribozomech jsou přiřazovány aminokyseliny podle sledu kodonů) Ribozomová etapa má tři fáze: 1. Iniciace translace 2. Elongace polypeptidového řetězce 3. Terminace translace 18 1. Mimoribozómová etapa: Nabíjení tRNA aminokyselinou 1. Vytvoření aminoacyladenylátu 2. Přenos aminokyseliny na tRNA aa + ATP-► aminoacyl-AMP + PPi aminoacyl-AMP + tRNA-►aminoacyl-tRNA + AMP 19 Aktivace aminokyseliny aminoacyl-tRNA-syntetázou AMP i adenosintrifosfát, nejvýznamnější makroergická sloučenina 12 makroergické vazby mezi fosfáty, každá po 33 kJ/mol, znázorňují se vlnovkou Vznik aminoacyl-tRNA působením aminoacyl-tRNA-syntetázy EľíTyrwc / Ani mo acid site ATP site n ■ 7 H-C-NH2 O" o-p=o o □ Adenosine R H CNHj 0 ' ^P=0 H o Adenosine ft 3 vazebná místa na aa-tRNA-syntetáze 1. aa + ATP --- aa-AMP + PP Vznik aminoacy laděny látu 2. aa-AMP + tRNA vznik aa~tRNA tRNA s nabitou aminokyselinou Vazba správné tRNA je stabilizována konformační změnou enzymu, která umožní rychlou aminoacylaci. Pokud je navázána chybná tRNA, ke konformační změně nedojde. Výsledkem je pomalejší reakce a disociace tRNA. Přenos na ribozom 21 Ribozomová etapa translace - 3 fáze 1. Iniciace translace - vazba mRNA a první aa~tRNA na ribozom 2. Elongace polypeptidového řetězce - průběžné přiřazování aminokyselin do rostoucího polypeptidového řetězce podle kodonů na mRNA 3. Terminace translace - zakončení syntézy polypeptidového řetězce, odpoutání mRNA z ribozomu a jeho rozpad na podjednotky 22 Zařazování metioninu do polypeptidu během iniciace translace a během její elongace u prokaryot - odlišné vlastnosti tRNA vázajících Met Podobá se spíše peptidyl-tRNA formyl fMet-tRNAfMet IF2 30S Vazba na iniciační kodon AUG v P místě r bozomu Kompletní ribozom, vazba v A-místě Vazba na kodon AUG pro Met uvnitř genu fMet—protein Deformylace (deformyláza) fMet (aminopeptidáza) 23 Metionin je po vazbě na fmet-tRNAi formylován na formylmetionin, který je po začlenění do polypeptidu deformylován na metionin, který může být následně z N-konce polypeptidu odstraněn h h n—c 2 blokuje NH2-skupinu cooh ch h n h c formyl cooh h i ch transformyláza ch ch ch metionin s ch N-formylmetionin deformyláza aminopeptidáza K formylaci metioninu dochází také u mitochondrií a chloroplastů 24 A) Struktura iniciátorové tRNA Formylated amino acid Fořmyl I ' Met I A C C A G A g-c c-g g-c g-c g-c c g g c g i • • • • » guu g g formylace 1U1UJJ1UL u a A A c g A c C t i • i gcuc u a g a g g d u-a U g g g-c g-c age / Stop codon Ä; ä? tmRNA nesoucí alanin (~ alanyl-tRNA) navázaná v A místě nbosome stalled on broken mRNA H2N incomplete protein 11-amino acid tag Degradace peptidu specifickou tag-proteázou Inkorporace selenocysteinu do polypeptidového řetězce - čtení bifunkčního kodonu UGA serine i A C U seryl-tRNA synthetase seíeřiocysteine tRNA SELB se lenocystei ne-specif ic translation factor Ulil) A C U serine enzymatically converted to selenocysteine A C U Speciální tRNASec selenocysteine added to growing peptide chain Potenciální stop kodon UGA Speciální sekvence pro SELB (Element SECIS) Vnášení tRNA-sec na vnitřní stop kodon UGA a) U bakterií b) U savců ^_ Single prótěiil binds tRXA-Sec and šlem - loop mRNA Vlásenka je součástí kódující sekvence mRNA I! h,n—c — cook ' i CH ch, OH serin n Cysteine h m RNA Vlásenka je součástí 3'netranslatované mRNA ilm-—-c — coo h CH, 11 SEt.EXOCYSTEINE Translace u eukaryot 1. na čepičku na mRNA se postupně navážou elF-4F, elF-4A, a elF-4B (dohromady tvořící CBP-protein) 2. Je vyhledán iniciační kodon a Met-tRNAmet je umístěna proti němu (v P místě) 3. Uvolní se iniciační faktory a připojí se podjednotka 60S 4. Začíná fáze elongace EF-1 a EF-2 (analogy EF-Tu, Ts) . iniciační tRNA malá ribosomální podjednotka s navázanými iniciačními taktory vazba mílNA mRNA AUG čepička RNA Met iniciační tRNA se pohybuje poděl mRNA, a hledá první triplet AUG faktory disociují naváže se velká ribosomalní podjednotka navaze se aminoacyl-tRNA (1. krok) tvoří se první peptidová vazba (2. krok) elF4A a B se podílejí na rozmotání sekundární struktury mRNA elF6 udržuje ribozom v disociovaném stavu 1. u baktérií se iniciační komplex tvoří přímo na sekvencích ohraničujících AUG 2. u eukaryot nejdříve 40S rozpozná 5' konec mRNA a pak se pohybuje k iniciačnímu místu, kde se spojuje s 60S elF-2 initiator tRNA small ribosomal subunit with initiator tRNA bound -if AAAAAAAA^^ LelF;4G» mRNA elF-4E 5' cap additional initiation factors mRNA AUG INITIATOR tRNA MOVES ALONG RNA SEARCHING FOR FIRST AUG elF-2 AND OTHER INITIATION FACTORS DISSOCIATE Met LARGE RIBOSOMAL SUBUNIT BINDS AMINOACYL-tRNA BINDS (step 1) Iniciace translace u eukaryot eIF-4G je vázán na polyA-konec RNA a na eIF-4E vázaný na čepičku = překládány budou jen mRNA s úplnou délkou FIRST PEPTIDE BOND FORMS (step 2I 41 Standardní signální sekvence exportovaných proteinů Pozitivní Hydrofobni doména doména Oblast štěpení zbytek proteinu místo štěpení vedoucí (signální) peptidáza 42 Kotranslační export proteinů u bakterií 43 Syntéza extracelulárních a membránových proteinů preprotein = polypeptid se signálním peptidem na N-konci mRNA ribosom signál rozeznávající částice {SRP) signální sekvence na rostoucím polypeptidu SRP odstraněn a recyklován „ní, ;;,„ ;;;■„ -.-.i.- receptor pro SRP v membráně ER translokační kanál CYTOSOL LUMEN ER 44 Translokace proteinu membránou do vnitřního prostoru endoplazmatického retikula zbytek polypeptidového řetězce signální sekvence translokační kanál signální peptidáza NH; CYTOSOL •3 1 ■ m ■ w 1 ; \:......-j P-....------- 11 .......!!!!,. I-U.U i.iS LUMEN ER COOH COOH 45 Začlenění transmembránového proteinu do membrány ER CYTOSOL ^cooh Posttranslační procesy 1. Kotranslační úpravy * deformylace * odštěpení aminokyselin z N-konce aminopeptidázou * chemické modifikace aminokyselin (hydroxylace, fosforylace, acetylace, aj). * tvorba disulfidových můstků - vznik terciární struktury * připojení cukerných zbytků (oligosacharidů) - glykozylace, vznik glykoproteinů * vznik sekundární a terciární struktury 2. Posttranslační úpravy * vy štěpení peptidů (proinzulin > inzulín) * tvorba kvarterní struktury (spojování protomerů do aktivních oligomerů) * přidání prostetických skupin, koenzymů apod. (hemoglobin) * posttranslační štěpení polyproteinů (polypeptidový prekursor > peptid, např. ACTH) * proteinový sestřih (vyštěpení IVPS - intervening protein sequence), vytvoření nové peptidové vazby 3. Sestavování oligomerních proteinů a nadmolekulárních struktur (nekovalentní interakce mezi rozpoznávacími místy polypeptidových řetězců) * tvorba organel (membrány aj) účast chaperonů a chaperoninů při sestavování struktur 4. Samo sestavo vání (spontánní seskupení proteinových podjednotek) * ribozomy * morfogeneze virů (sestavení virových kapsidů) Modifikace aminokyselin Dekódováním m RNA při translaci je možno do bílkoviny vybrat jen asi 20 aa - z bílkovin lze však vyizolovat až 100 různých modifikovaných forem aminokyselin: hydroxylovaný p roli n a lyzin fosforylovaný serin, treonin, tyrozin karboxylovaná kys. glutamová acetylovaný lyzin metylovaný lyzin a prolin adenylovaný tyrozin glykozylované zbytky modifikace lipidickými zbytky * zbytky nenasycených mastných karbonových kyselin (acylace: 12C - laurylace, 14C - myristylace, 16C - palmitylace) * zbytky polyizoprenového charakteru (iso/prenylace: 15C - farnesylace, 20C - geranylgeranylace) Mnohé modifikační enzymy se nacházejí v ER a Golgiho Mikrozomální aparátu, někdy však dochází ke změnám až mimo buňku. frakce 48 Průběh vzniku funkčního proteinu Nascentní polypeptidový řetězec Sbalování, vazba kofaktorů (nekovalentní interakce) Kovalentní modifikace (glykozylace, fosforylace, acetylace aj) t Vazba dalších proteinových podjednotek Kotranslační sbalování proteinu Sbalená C-terminální mRNA ribosome 50 Sbalování proteinů za účasti chaperonů Nesbalený protein Správně sbalený protein 51 Molekulární chaperony/chaperoníny • speciální skupina proteinů podílejících se na sbalo-vání polypeptidů (zabraňují chybnému sbalování) • hlavní rodiny chaperonů: proteiny hspóO a hsp70 Ohsp70: rozpoznávají krátké úseky polypeptidů tvořené hydrofobními aminokyselinami během jeho syntézy na ribozomu O HspóO (GroE; Hsp60/Hsp10): vytvářejí soudkovité struktury, v nichž se upravují kompletně JÉ|| nasyntetizované proteiny mam Dva obecné mechanismy působení chaperoninů Účast chaperonů na procesu sbalování proteinů správně sbalený poiypeptid Hsp70 se váže na hydrofobní oblasti (GroEL, GroES) proteinu a zabraňuje jeho agregaci. Další úlohy: • transport • disagregace denaturovaných hsp = heat shock protein proteinů (např. Hsp60) 54 Posttranslační úprava proinzulín B-řetězec Proteinový sestřih srovnání způsobů odstraňování intronů a inteinů Dna Exon 1 Iiitrun Exon 2 I UWSCRIIMIO-N rna Exon 1 Intron Exon 2 SPLICISIŠOF RNA mRNA Exon 1 Exon 2 Extein 1 Intein Extein 2 Inteiny byly zjištěny u kvasinek, řas, bakterií a archeí - obvykle je přítomen jen jeden intein, výjimečně dva Translation Protein TiUN&DvnoN From From exon 1 intein From exon 2 From extein 1 From extein 2 SPl.rCINGOl' PROTEI !V Intein katalyzuje své vlastní vyštěpení Protein prior to splicing Průběh sestřihu inteinu probíhá autokatalyticky ve dvou krocích 1 Extein 1 je uvolněn a připojen k cysteinu exteinu 2 - vzniká větvený intermediát Intein je vy štěpen a oba exteiny se spojí peptidovou vazbou do zralého proteinu exteins rearrange sh Final protein formed 9 Inteins are currently known in more then 200 types of proteins with diverse in functions. These proteins include metabolic enzymes, DNA and RNA polymerases, proteases, ribonucleotide reductases, and vacuolar-type ATPases. Sestřih inteinu (proteinový sestřih) tntein-containing gene Transcription Intein DNA jumps Cut by the intein Genová konverze Intein homing N-extein Sestřih Sekvenčně-specifická endonukleáza so; Intein Štěpení genu bez inteinu v místě, kam se má začlenit intein Intein-minus gene Konzervativní sekvence aminokyselin 140-850 aa +/- homing endonuclease gene (HEG) 58 Samosestavování (self-assembling) ocásek I 5.6.7.8.10.25.26. 1 27,28,29.4 TŘI SESTAVOVACÍ ŘADY hlava vlákna ocásku bazálni destička TTT bazálni - destička spojená s proteiny dutiny ocásku j\j připojení obalového prcieinu kompletní lágový virion kompletní vlákna ocásku + labilní faktor Vytváření nadmolekulárních struktur, spojování proteinů nekovalentními vazbami Čísly jsou označeny strukturní geny, kterými jsou kódovány proteiny fága Buněčné mechanismy monitorující kvalitu proteinů po translaci Proteinové agregáty Správně Správně sbalen sbalen bez s pomocí cizí pomoci chaperonů Neúplně sbalená forma je rozložena v proteazomu 60 Odbourávání proteinů v proteazomech (eukaryota) Schéma cyklu ubikvitinu E1 = enzym aktivující ubikvitin. £2 = enzym přenášející aktivní ubikvitin sbalený protein na sbalený protein. Protein určený k odbourání ~ Označení ubikvitinem za účasti enzymu E2. Aktivace ubikvitinu enzymem E1. proteazom - 19 S 20 S proteáza 19 S Odbouráni proteinu proteázou. fragmenty " '"" proteinu mm y Q ď© neaktivní ubikvitin centrální cylindr aktivní místa proteáz 19S „cap" - váže označené proteiny 61 Označování proteinů ubiqutinem A. Aktivace ubiquitinu prostřednictvím enzymů El, E2 a E3 ubiquitin B. Připojení ubiquitinu na cílový protein Ubiquitin či ubikvitin (z lat. ubique, všude) je malý globulární protein o délce 76 aminokyselin, přítomný ve všech eukaryotických buňkách, který reguluje rozklad jiných proteinů v proteazomu, lyzozomu či ve vakuole. V určitých případech však také stimuluje endocytózu, vnitrobuněčný transport a podílí se na udržování struktury chromatinu (ubikvitin se váže se na histony). Ubiquitin se zpravidla připojí na protein, který má být rozložen (degradován), tento proces navázání ubiquitinu se označuje jako ubiquitinace. Váže se glyčinem (na svém C-terminálním konci) k lysinu na proteinu určeném k degradaci. Po připojení ubikvitinu je označený protein degradován proteasomem 26S. Tato degradace je specifická a přesně cílená, je tedy často využívaná pro specifické odstranění proteinů signálních drah. Proteiny degradované proto, aby jejich aminokyseliny, případně peptidy mohly být použity jako stavební kameny, bývají degradovány spíše nespecificky proteázami. Mechanismus připojení Na cílový protein, určený k degradaci, se ubikvitin váže pomocí tří enzymů, aktivačního El, konjugačního E2 a ligačního E3. Ligační enzym se spojí s cílovým proteinem. Aktivační enzym nejprve ubikvitin aktivuje na účet ATP a poté ho předá konjugačnímu enzymu, který se spojí s komplexem, tvořeným ligačním enzymem spojeným s cílovým proteinem určeným k degradaci. V tomto komplexu tvořeným E2, E3, ubikvitinem a cílovým proteinem pak dojde k navázání ubikvitinu na cílový protein. E2 a E3 se recykluje. 63 64 65