Metody výzkumu
patofyziologie volných
radikálů
Milan Číž
19.4.2019
Oxidační stres
• redoxní rovnováha
• poškození biologických makromolekul
29.4.2019
Oxidační stres
39.4.2019
Oxidační stres
49.4.2019
Metody stanovení
• volných radikálů
• aktivity zdrojů volných radikálů
• antioxidační aktivity biologických vzorků
• jednotlivých antioxidantů
• poškození biologických makromolekul
59.4.2019
Metody stanovení
• Chemiluminiscence
• Spektrofotometrie
NBT-test
redukce cytochromu C
• Elektronová spinová resonance
• Elektrochemie
stanovení spotřeby kyslíku
detekce NO
• Fluorimetrie (průtoková cytometrie)
69.4.2019
Chemiluminescence
Chemiluminiscence (1)
Luminofory jsou oxidovány RMKD. Při návratu do základního
energetického stavu emitují fotony. Jejich detekce je možná
pomocí luminometrů nebo scintilačních spektrofotometrů.
Nejčastěji používané luminofory:
-Luminol
-Lucigenin
-Isoluminol
-Pholasin
79.4.2019
Chemiluminescence
89.4.2019
CL fagocytů
99.4.2019
CL fagocytů
109.4.2019
CL fagocytů
119.4.2019
CL fagocytů
129.4.2019
Rozlišení intra- a extracelulární CL
• SOD, kataláza, křenová peroxidáza, azid sodný
• luminol vs. isoluminol
CL fagocytů
139.4.2019
plazmatická
membrána
cytosol
luminol
isoluminol
CL fagocytů
149.4.2019
Aktivátory fagocytů Místo působení
opsonizované částice (OZP) povrchové receptory
fMLP povrchové receptory
PMA proteinkináza C
vápníkový ionofor A23187 Ca2+  PKC
CL fagocytů
159.4.2019
Rozlišení mezi RMK a RMD
• antioxidanty
• NO donory (sodium nitropruside, SIN-1)
• Analogy L-argininu (L-NMMA, L-NAME, L-NNA)
Systémy generující RMKD
169.4.2019
• xanthin/xanthin oxidáza O2
-•
• peroxid vodíku + ionty přech. kovů •OH
• peroxid vodíku H2O2
• ABAP ROO•
• SIN-1 ONOO•
buněčné systémy (fagocyty)
Metoda TRAP
179.4.2019
• Total (peroxyl) Radical-trapping Antioxidative Parameter
• stanovení celkové antioxidační kapacity ve vodě
rozpustných antioxidantů
• referenční vzorek: trolox
Metoda TRAP
189.4.2019
• 2,2‘-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride
• 2,2‘-azobis(2-methylpropionamide) dihydrochloride
Metoda TRAP v lipidové fázi
199.4.2019
• 2,2‘-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)
Metoda TRAP
209.4.2019
Metoda TRAP
219.4.2019
Metoda TRAP
229.4.2019
Chemiluminiscence
239.4.2019
Chemiluminiscence (2)
• aktivitaMPO:
bromid-dependentní chemiluminiscence v
přítomnosti vzorku a peroxidu vodíku
• buněčná proliferace a cytotoxicita:
luciferin-luciferáza
závislé na ATP
• regulace exprese genů
reporter gene assay
Průtoková cytometrie
249.4.2019
• tvorba RMK neutrofily a makrofágy:
Dichlorodihydrofluorescein diacetate:
peroxid vodíku, peroxynitrit
Dihydrorhodamine 123:
peroxid vodíku, peroxynitrit
Dihydroethidium (hydroethidine):
superoxidový anion
• oxid dusnatý:
1,2-diaminoanthroquinone
Průtoková cytometrie
259.4.2019
Dichlorodihydrofluorescein diacetát
detekce H2O2 ale i dalších intracelulárních oxidantů včetně
oxidů dusíku
Výhody
• shodná vlnová délka s fluoresceinem
• používána nejdelší dobu (od roku 1983)
Nevýhody
• unikání z buněk - nelze fixovat
• vysoká citlivost vůči světlu
• toxicita
Průtoková cytometrie
269.4.2019
Dihydrorhodamin
detekce H2O2 ale i dalších intracelulárních oxidantů včetně
oxidů dusíku
Výhody
• až 10x vyšší citlivost oproti DCFH-DA
• stabilita - možnost fixace
Nevýhody
• nespecifická detekce oxidantů
• závislost na mitochondriálním membránovém potenciálu?
Průtoková cytometrie
279.4.2019
Dihydroethidium
detekce O2
-•
Výhody
• dobrá specificita pro O2
-•
• stabilita - možnost fixace
Nevýhody
• HE katalyzuje dismutaci O2
-•
• toxický
• nelze použít současně s PI
Průtoková cytometrie
289.4.2019
• povrchové antigeny:
Mab značené různými fluorescenčními značkami
• buněčný cyklus, buněčná viabilita:
Propidium iodide
EPR
299.4.2019
Metody využívající existence spinu a jeho chování v silném
magnetickém poli. Podle toho, zda se jedná o spin elektronu
nebo jádra se dělí spektroskopické metody na nukleární a
elektronové.
• Nukleární magnetická rezonance (NMR)
• Nukleární kvadrupólová rezonance (NQR)
• Elektronová paramagnetická rezonance (EPR)
• Muonovárezonance
Objevena 1945. Metoda je založena na měření absorpce a
emise elektromagnetického záření (mikrovlny) elektronů.
EPR
309.4.2019
Na vzájemné interakci elektronového momentu hybnosti s
vnějším magnetickým polem je založena elektronová
paramagnetická rezonance (EPR), nazývaná také elektronová
spinová rezonance (ESR).
EPR spektroskopie často neumožňuje přímé stanovení krátce
žijících radikálů bez použití složitých experimentálních postupů
(měření při nízkých teplotách, použití tzv. flow-techniky
apod.). Aby se umožnilo stanovení krátce žijících radikálů i bez
použití speciálních postupů, byla v šedesátých letech vyvinuta
metoda spin-trappingu.
EPR
319.4.2019
Metoda EPR je použitelná pro systémy s nenulovým spinem, tj.
pro systémy, které obsahují alespoň 1 nepárový elektron. Jsou
to např. paramagnetické ionty některých přechodných kovů
nebo vzácných zemin s částečně zaplněnými d a f orbitaly jako
Cu(II), Mn(II), Cr(III,IV), V(IV) a organické radikály.
Působením magnetického pole dojde k rozštěpení původního
energetického stavu E0 na energetické hladiny, odpovídající
jednotlivým prostorovým orientacím celkového momentu
hybnosti.
EPR
329.4.2019
Interakcí nepárového elektronu s magneticky aktivními jádry
okolních atomů nebo s jinými nepárovými elektrony dochází k
rozštěpení signálu na multiplety.
• Počet čar v multipletu n+1 (n = počet interagujících jader)
EPR
339.4.2019
EPR
349.4.2019
EPR
359.4.2019
Spektrometrie
369.4.2019
• aktivita MPO:
o-dianisidine
• lipidová peroxidace:
koncentrace TBARS
• jednotlivé antioxidanty:
kyselina močová, kyselina askorbová, albumin, bilirubin
• oxid dusnatý:
Griessova reakce (nitrity, nitráty), detekční limit 100 nM,
548 nm.
• viabilita, cytotoxicita, buněčná proliferace:
MTT test
Elektrochemie
379.4.2019
• oxid dusnatý:
Selektivní elektroda pro NO
• ostatní RKM
• stanovení spotřeby kyslíku
Poškození biologických
makromolekul
389.4.2019
• Lipidová peroxidace
Stanovení konjugovaných dienů pomocí CL
Stanovení MDA spektrofotometricky, HPLC
Stanovení 4-hydroxynonenalu (spektrometrie, GC-MS)
Poškození biologických
makromolekul
399.4.2019
• Oxidativní poškození bílkovin
Stanovení karbonylových skupin proteinů (HPLC,
spektrometrie)
Stanovení proteinových hydroperoxidů
Poškození biologických
makromolekul
409.4.2019
• Oxidativní poškození DNA
Stanovení 8-hydroxy-deoxy-guanosinu (8-OHdG)
- HPLC, GC-MS