Bi6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Informační panely
Informační panel - Základní data o nukleových kyselinách a proteinech
Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty
(Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4
Počet částic v jednom molu = 6,023 x 1023
Průměrná molekulová hmotnost páru bazí v DNA = 650
Průměrná molekulová hmotnost bazí v RNA = 360
Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny = 110
Pro dsDNA když A260 = 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace dsDNA = 50 μg/ml = 0,15 mM
Pro ssDNA když A260 = 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace ssDNA = 33 μg/ml = 0,10 mM
Pro ssRNA když A260 = 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace ssRNA = 40 μg/ml = 0,11 mM
Molekulová hmotnost dsDNA = (počet bp) x 650
Počet molů konců dsDNA = 2 x (hmotnost DNA v gramech) / (molekulová hmotnost)
Počet molů konců vytvořených restrikčním štěpení
a) kružnicová DNA = 2 x (moly DNA) x (počet štěpných míst)
b) lineární DNA = 2 x (moly DNA) x (počet štěpných míst) + 2 x (moly DNA)
1μg DNA o délce 1 000 bp = 1,5 pmol = 9,1 x 1011
molekul
1μg DNA plasmidu pUC18/19 (délka 2 686 bp) = 0,57 pmol = 3,4 x 1011
molekul
1μg DNA plasmidu pBR322 (délka 4 361 bp) = 0,35 pmol = 2,1 x 1011
molekul
1μg DNA fága M13mp18/19 (délka 7 249 bp) = 0,21 pmol = 1,3 x 1011
molekul
1μg DNA fága λ (délka 48 502 bp) = 0,03 pmol = 1,8 x 1010
molekul
1 pmol DNA o délce 1 000 bp = 0,66 μg
1 pmol DNA plasmidu pUC18/19 (délka 2 686 bp) = 1,77 μg
1 pmol DNA plasmidu pBR322 (délka 4 361 bp) = 2,88 μg
1 pmol DNA fága M13mp18/19 (délka 7 249 bp) = 4,78 μg
1 pmol DNA fága λ (délka 48 502 bp) = 32,01 μg
DNA o délce 1,0 kb má kódovací kapacitu 333 aminokyselin = protein o M = 37 000
Protein o M = 10 000 může být kódován DNA o velikosti 270 bp
Protein o M = 50 000 může být kódován DNA o velikosti 1,55 kbp
Bi6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Informační panely
Informační panel - Vzorce užitečné pro design PCR
Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty
(Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4
Přepočty koncentrací
Pro oligonukleotid platí, když A260 = 1,0 v 1 cm kyvetě, pak jeho koncentrace = 20-30 μg/ml
Molekulová hmotnost (M)
M = (NA x 312,2) + (NG x 328,2) +(NC x 288,2) +(NT x 303,2) + P
kde
Nx = počet specifických nukleotidů (A, T, C nebo G) v oligonukleotidu
P = + 17 pro fosforylované oligonukleotidy
P = - 61 pro defosforylované oligonukleotidy
Přepočet µg na pmol
pmol oligonukleotidu = µg (oligonukleotidu) x (106
pg/ 1 µg) x (1 pmol/330 pg) x (1/N) =
= [µg (oligonukleotidu) x 3,030] /N
kde N = počet nukleotidů v oligonukleotidu
např. 1 µg oligonukleotidu o délce 20 bazí je přibližně 151,5 pmol
Přepočet pmol na µg
µg oligonukleotidu = pmol (oligonukleotidu) x (330 pg/ 1 pmol) x (1 µg/106
pg) x (N) =
= pmol (oligonukleotidu) x N x 3,3 . 10-4
kde N = počet nukleotidů v oligonukleotidu
např. 1 pmol oligonukleotidu o délce 20 bazí je přibližně 0,0066 µg
Přepočet µM na pmol
1 µl X µM roztoku primeru obsahuje X pmol primeru
např. 1 µl 2,5 µM roztoku primeru obsahuje 2,5 pmol primeru
Přepočet pmol na µM
1 µl roztoku primeru o koncentraci X pmol/µl má koncentraci primerů X uM
např. 1 µl roztoku primeru o koncentraci 20 pmol/µl má koncentraci primerů 20 µM
Bi6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Informační panely
Informační panel - informace užitečné pro práci s PCR
Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty
(Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4
Zkratky používané pro označení bází v nukleotidech
používá se např. při objednávání oligonukleotidů pro PCR
Kód Značí Kód Značí
A adenin K keto (T a G)
T thymin M amino (C a A)
G guanin D všechny kromě C
C cytosin V všechny kromě T
Y pyrimidiny (C a T) H všechny kromě G
R puriny (A a G) B všechny kromě A
W „weak“ (A a T) N všechny
S „strong“ (G a C) X neznámý
Výpočty teplot annealingu
pro oligonukleotidy dlouhé 14 až 25 nukleotidů
Tm = [2 °C x (počet bází A a T)] + [4 °C x (počet bází G a C)] +
pro oligonukleotidy delší než 25 nukleotidů
Tm = 81,5 °C + 16,6 [Na+
] + 0,41 (% GC) – 0,61 (% for) – 500/N
kde
[Na+
] = koncentrace Na+
iontů
% GC = podíl nukleotidů G a C v sekvenci
% for = podíl formamidu v hybridizačním roztoku
Vybrané odkazy na důležité www stránky
1) www.ncbi.nim.nih.gov = databáze sekvencí (Genová banka) a literárních odkazů
2) www.dgb.org = umístění lidských genů, fragmentů DNA, populace,
polymorfismy, mapy, mutace
3) www.rebase.neb.com = restrikční enzymy a metylázy
4) www.scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop = klasifikace struktur proteinových domén
5) www.expasy.ch/sprot = databáze proteinových sekvencí SWISS-PROT
Bi6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Informační panely
Informační panel - Tabulka standardního genetického kódu
Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty
(Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4
kodony
první
nukleotid
druhý nukleotid
třetí
nukleotid
U C A G
U
Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) U
Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) C
Leu (L) Ser (S) terminace
terminace,
SeC
Pyr (O)
A
Leu (L) Ser (S) terminace Trp (W) G
C
Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) U
Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) C
Leu (L) Pro (P) Gln (Q) Arg (R) A
Leu (L) Pro (P) Gln (Q) Arg (R) G
A
Ile (I) Thr (T) Asn (N) Ser (S) U
Ile (I) Thr (T) Asn (N) Ser (S) C
Ile (I) Thr (T) Lys (K) Arg (R) A
Met nebo
iniciace
Thr (T) Lys (K) Arg (R) G
G
Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) U
Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) C
Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) A
Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) G
SeC = selenocystein
Pyr = pyrolysin
Tučně jsou vyznačeny kodonové rodiny
Bi6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Informační panely
Informační panel- Parametry prokaryotické buňky
Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty
(Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4
Složení bakteriální buňky
Hodnoty platí pro Escherichia coli, případně Salmonella typhimurium
Parametr Na buňku
Na litr kultury
(109
buněk/ml)
Vlhká hmotnost 950 fg 950 mg
Suchá hmotnost 280 fg 280 mg
Obsah proteinů 155 fg 155 mg
Obsah genomové DNA 17 fg 17 mg
Obsah RNA 100 fg 100 mg
Objem 1,15 µm3
= 1 pikolitr
Vnitrobuněčná koncentrace proteinů 135 µg/ml
Antibiotika používaná v buněčných kulturách
Antibiotikum Koncentrace
Gram+
bakterie
Gram-
bakterie
Mycoplasmata Kvasinky
Stabilita
při 37°C
ampicilin 50-100 mg/ml + + - - 3 dny
amfotericin B 0,25-25 µg/ml - - - + 3 dny
carbenicilin 100 U/ml + + - - 3 dny
ciprofloxacin 10 µg/ml + 5 dnů
erythromycin 100 µg/ml + + + - 3 dny
gentamycin 5-50 µg/ml + + + + 3 dny
kanamycin 100 µg/ml + + +/- - 5 dnů
lincomycin 50 µg/ml + - - - 4 dny
neomycin 50 µg/ml + + - - 5 dnů
nystatin 100 U/ml - - - + 3 dny
penicilin G 50-100 U/ml + - - - 3 dny
polymixin B 100 U/ml - + - - 5 dnů
streptomycin 50-100 µg/ml + + - - 5 dnů
tetracyklin 5-10 µg/ml + + + - 3 dny