Možnosti preimplantačních
genetických analýz na prahu
nového milénia
Mgr. Jan Smetana, Ph.D
Ústav Experimentální Biologie, PřF MU
Laboratoř molekulární cytogenetiky
OLG FN Brno
Asistovaná reprodukce (ART)
• Asistovaná reprodukce je označení pro lékařské postupy a metody, při
kterých dochází k manipulaci se zárodečnými buňkami nebo s embryi,
včetně jejich uchovávání, a to za účelem léčby neplodnosti ženy nebo
muže
• Komplexní proces je dnes většinou založen na technikách in vitro
fertilizace
• Kromě párů s diagnózou využívají i páry s normální fertilitou, ale riziko
přenosu genetické vady nebo patologických markerů
• Specializovaná centra - kliniky, sanatoria
• Cíl – narození zdravého potomka = „léčba neplodnosti“
Plodnost (Fertilita)
Plodnost (fertilita)
= schopnost jedince se pohlavně množit
= komplexní vlastnost, která je
výsledkem schopností samců a samic
poskytovat zdravé potomstvo v
optimálním počtu za určitý čas
= demografický ukazatel vyjadřující
průměrný počet potomků na jednu ženu
Plodnost (Fertilita) v ČR
• Pravděpodobnost otěhotnění při nechráněném styku u
zdravého páru na jeden menstruační cyklus je cca 25%
• Průměrný věk prvorodiček v ČR 26,3 roku
• Průměrná zdravá žena do 35 let s pravidelným nechráněným
pohl. stykem má šanci otěhotnět cca 16%, tj. průměrně
otěhotnění lze dosáhnout 1/6 ovulačních cyklů
• 50% žen (20-34 let) otěhotní do dvou měsíců, 80% do půl
roku
(Zdravotnická statistika MZCR, www.uzis.cz)
Neplodnost (Infertilita)
Neplodnost (Infertilita)
= neschopnost dosáhnout
klinického těhotenství po 12 a
více měsících nechráněného
pravidelného pohlavního styku
(WHO)
• V ČR ~ 20-25 % párů
Ženské faktory
• ovariální faktor - vaječník nevytvoří nebo
neuvolní kvalitní životaschopné vajíčko
• tubární faktor - poškození vejcovodů, chybění
vejcovodů, neprůchodné vejcovody
• endometrioza - přítomnost děložní sliznice
mimo dutinu děložní
Mužské faktory
• špatná funkce spermie - neschopnost spermie
proniknout a oplodnit vajíčko ženy
• Oligozoospermie (<15*106 v ejakuklátu)
• Astenozoospermie (nedostatečná pohyblivost)
• Teratozoospermie (špatná morfologie)
• Azoospermie (nepřítomnost spermií v ejakulátu)
• „grand sperm zero“ – cca 2060
Příčiny neplodnosti
Genetické příčiny neplodnosti u žen
1) Chromozomové aberace – strukturní i početní změny
Turnerův syndrom – 45, X
„Superženy“ – 47, XXX
Aneuploidie v gametách
• Robertsonské translokace, centromerická fúze
akrocentrických chromozomů (13-15, 21, 22)
2) Mutace – geny ovlivňující srážení krve
MTHFR (1p36.3)
Leidenská mutace (F5 – 1q23),
G20210A v genu pro trombin
CFTR
Genetické příčiny neplodnosti u můžů
Chromozomové aberace
• Klinefelterův syndrom - 47, XXY
• Muži - 47, XYY
• Strukturní abnormality chr. Y
delece v (Yp)(11.3) – SRY – porucha vývoje pohl. ústrojí
delece Yq11 – AZF – azoosperima factor
= porucha vývoje spermií
• Translokace autozomů, Y/A, Robertsonské translokace
– centromerická fúze akrocentrických chromozomů (13-15, 21, 22)
• Aneuploidie v gametách (X,Y, 21, 13,18)
Genové mutace
Cystická fibróza – mutace F508 v CFTR1, 97% mužů neplodných
•
Historie IVF
• 17st- van Graaf - Graafovy folikuly, van Leeuwenhoek - pozorování savčích spermií
• 19st - první veděcké práce o oplození in vitro na zvířatech
– Schenk (1878), W. Heape – porod 6 králičích mláďat po vitro oplození (1890).
• 1944 – Rock, Menkin – oplození lidského oocytu in vitro
• 1951 – Austin, Chang - pro oplozovací schopnost spermie je nezbytný její
předchozí pobyt v genitálním traktu samice (kapacitace spermií)
• 2. pol 20st – Cambridge University - R.G. Edwards
- popis zrání oocytů a oplození in vitro, možnost kultivace embryí
• 1971 – Steptoe, Purdy: Nature – možnost in vitro kultivace
lidských embryí do stádia blasystocysty
• 70. léta – vylepšení kultivačních médií, laparoskopických technik,
kryokonzervace
• 1978 – Lancet – klinické aplikace oplození in vitro - L. Brownová
• 2010 - R.G. Edwards - Nobelova cena za embryologii
P.C. Steptoe
R.G. Edwards
A. van Leeuwenhoek
Historie IVF Č(SS)R
Prof. L. Pilka
MUDr. J. Tesarik
Prof. P. Trávník
IVF kliniky v Brně
IVF kliniky
• V ČR v současné době 41 registrovaných IVF center (6x Brno, 8x
Praha)
• Specializovaná centra asistované reprodukce (gynekologie,
porodnictví, reprodukční medicína, genetika, biochemie)
• Většinou soukromá centra x spolupráce s akademickým a
zdravotnickým sektorem
• 2016 – 17998 IVF cyklů, 52% hrazeno ZP
• Specializace na zahraniční klientela - „reprodukční turistika“
„CT2 – dovolená ve dvou – dítě v ceně“
Co obnáší IVF
Metody asistované reprodukce
Intrauterinní inseminace (IUI)
= zkoncentrované pročištěné spermie se zavádějí speciálním katetrem do
dutiny děložní v období ovulace
In vitro fertilizace (IVF)
= klasická metoda mimotělního oplodnění,
při které jsou spermie kultivovány s
oocyty in vitro.
ICSI - intracytoplasmatická injekce spermií
skrz obal (zona pellucida) do vajíčka
PICSI - zdokonalená ICSI
umožňuje vybrat a vpravit do oocytu pouze
zralou spermii přes vazbu na oocytární
komplex (hyaluronan)
www.gipom.com
Chirurgická aspirace spermií
Hormonálni stimulace – zisk oocytů
GnRH - gonadorelin, hormon uvolňující gonadotropin
CC - clomiphene citrate, syntetický estrogen, podpora ovulace
IVF cyklus
IVF cyklus
• při IVF cyklu získáme obvykle několik embryí…
• ideální je provést transfer jednoho embrya
x výběr … morfologie, genetika ?
Genetické abnormality
• velká část embryí bez ohledu na věk matky je aneuploidní (54 % ve
věku pod 35 let, 82 % ve věku 40 let a více)
Důvod = poruchy meiózy
Chromozomové aberace u embryí
• ~ 90 % aneuploidií vzniká v průběhu meiózy I u žen
= postupná degradace kohezinu (porušení integrity bivalnetů
= absence distálních crossing – porušení segreagce běhěm MI
A metaphase I oocyte about to undergo division (top).
Gabriel A S et al. J Med Genet 2011;48:433-437
Předčasné rozdělení sesterských
chromatid v MI
je více než desetkrát častější
příčinou vzniku aneuploidie, než
klasická nondisjunkce !
Genetické analýzy používané u IVF
1. Preimplantační genetické testování monogenních onemocnění - PGT-M
(PGD)
– Dříve PGD = monogenní choroby
– volba pohlaví u X-vázaných chorob
– vrozené strukturní abnormality (Robertsonské translokace,
balancované translokace)
2. Preimplantační genetické testování aneuploidií PGT-A (PGS)
– detekce nejčastějších vrozených početních chromozomových aberací –
aneuploidií
PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÉ TESTOVÁNÍ
(PGT)
PGA – diagnostické metody
a) Molekulární cytogenetika (I-FISH, CGH)
• aneuploidie, translokace, mikrodeleční syndromy aj
b) PCR – monogenní choroby
• specifické mutace - CF, thalasemie, srpkovitá
anémie, hemofilie, DMD…..
• QF PCR - +13,16,18,21, X,Y
c) Screeningové techniky – „PGD 2.0“ - celogenomové pokrytí
• array-CGH (DNA čipy) - početní i strukturní CHA
• SNP čipy – KARYOMAPPING
• NGS - komplexní přístup, spojení PGD+PGS
PGA – vstupní biologický materiál
Oplození in vitro Biopsie embrya Genetický test
Polární tělísko Blastomera (3. den) Blastocysta (5-6. den)
Biopsie embryí – rozdíly mezi 3. a 5.
denním odběrem
Biopsie embrya 3. den
(blastomery)
• analýza 1 – 2 buněk
• 30 – 60 % ztráta implantačního
potenciálu
• vyšší riziko mozaicismu
• časová tíseň (24 hod)
Biopsie embrya 5.- 6. den
(blastocysta)
• analýza 5 – 10 buněk
• menší riziko mozaicismu
• možnost vitrifikace embryí po
odběru – dostatek času pro vyšetření
• ne všechna embrya dosáhnou stádia
blastocysty
Kryokonzervace a vitrifikace embryí
Vitrifikace
• moderní metoda efektivní kryokonzervace embryí, oocytů i spermií
• Superrychlé zamražení biol. materiálu se směsí vhodně zvolených
kryoprotektiv(sacharózy, dimethysulfoxidu) na -196C
• Viablita po rozmažení cca 98%
Preimplantační genetický screening/diagnostika
NGS
Chromozomové abnormality u embryí
Početní chromozomové aberace (aneuploidie)
• jsou nejčastější genetickou změnou u lidských embryí
• aneuploidie se často vyskytují i u morfologicky normálně se vyvíjejících
embryí (A. Mertzanidou, 2013)
• snižují úspěšnost metod asistované reprodukce
Strukturní chromozomové aberace
• postzygotické mitotické poruchy jsou u embryí velmi časté
• až u 70 % embryí byla pomocí SNP čipů prokázána chromozomová
nestabilita – duplikace, amplifikace, delece, UPD (Vanneste et al., 2009)
SCREEINING POUHÝCH ANEUPLOIDIÍ U RANÝCH
EMBRYÍ NESTAČÍ!
Preimplantační genetický screening/diagnostika
pomocí techniky I-FISH
Screening - AneuVysion Vysis MultiVysion Probe Panel
(13,18,21,X,Y,16,22)
SpectrumGreen 21
SpectrumRed 13
SpectrumBlue X
SpectrumGold Y
SpectrumAqua 18
Více chromozomů na jedné buňce – opakovaná FISH (FISH –
zhodnocení, odmytí, nová FISH – zhodnocení)
PGS pomocí I-FISH nezlepšuje úspěšnost IVF…..proč?
Problémy PGA I
• vyšetření 1 buňky - možnost diagnostického
omylu ?
Problémy PGA II
• normální (všechny buňky diploidní) 27, 5 %
• mozaika (diploidní + aneuploidní buňky)
• abnormální (všechny buňky
abnormální)
• chaotické (každá buňka obsahuje
jiný počet chromozomů)
EMBRYA:
Jedna buňka nemusí
reprezentovat celé embryo !!!
Problémy PGA III – strukturní CHA
• u embryí se vyskytují též strukturní aberace (delece, duplikace,
UPD atd…) …postygotické mitotické poruchy mitózy jsou četnější
než meiotické…
Nestačí vyšetřit
aneuploidie !
Celogenomové
vyšetření !
Využití celogenomových
screeningových technik v PGA
• Izolace 1 – několika buněk + celogenomová amplifikace
• Využití mikročipových technik array-CGH, SNP čipy, NGS
• Možnost vyšetřit celý genom – nutno v krátkém časovém
intervalu (24 h) X zamražená embrya (vitrifikace)
Amplifikace DNA - klíčový krok PGA
Genomové metody – potřeba ng DNA, = 106buněk
XX aspirát trofoektodermu 20 buněk = pg DNA, nutnost amplifikace DNA
Single cell WGA principy – PCR
Výhody: vyšší výtěžnost, jednoduchý protokol, časově méně náročné
X tvoří artefakty, ADO
Aplikace: array-CGH, QF - PCR
Sin
Single cell WGA principy - MDA
Amplifikace „kruhem“ pomocí termostabilního mutanta fága Phí29
Výhody – menší míra ADO, nejsou produkty amplifikace x náročnější, menší
výtěžek
Aplikace: NGS, metylační analýzy (PWS/AS)
Sin
Single cell WGA principy - MALBAC
MALBAC - Multiple Annealing Looped Base Amplification Cycles
Kombinace PCR a MDA, dnes standard pro DNA i RNA sekvenování
https://youtu.be/CaFq9cnfTZI
BAC array CGH–za 12 hodin
Aneuploidie i strukturní změny (delece, duplikace) v celém genomu
Rozlišení ~ 5 Mbp
Metodika screeningových technik u PGD
Array-cgh workflow
1. Agilent SurePrint Mikročipy
• 8x60k mikročipy
• Rozlišení až 1 Mbp,. 2 - 5 Mbp
standard
2. High Resolution Scanner
• Rozlišení 10- 2 mm
• Až 48 microarrays / cyklus
• 15 min / 1 array (60k array)
3. Agilent Genomic Workbench
• Kritéria pro analýzu
• Vizualizace dat
• Tvorba protokolů, správa dat
Oligo array-CGH pro PGD
Agilent Technologies
Preimplantační genetická analýza pomocí
high-resolution array-CGH
• Materiál: buňky z trofoektodermu 5-denních embryí
• Amplifikační protokol: PicoPLEX WGA Kit (Rubicon Genomics, USA)
• Microarrays: 8x15K - CytoSure™Single Cell Aneuploidy Array, OGT UK
• 8x60K - Agilent SurePrint G3 Oligo CGH Microarray
• Software: CytoSure Interpret Software, Genomic Workbench
• Kontrola: hodnocení 4 zaškolení pracovníci
Porovnání profilu chromozomu 19 u na
platformě Agilent a OGT
Vyšší falešná pozitivita 15k platformy, nejčastěji chr. 11, 16 a 19
Agilent 8x60k OGT 8x15
Porovnání profilu chromozomu 22 na
platformě Agilent a OGT
Agilent 8x60k OGT 8x15k
Vyšší hustota 60k microarrays dává robustnější výsledky v porovnání s 15k
Agilent 8x60k OGT 8x15
Mozaicismus a verifikace výsledků u PGA
Embryo s mozaikou +13, potvrzeno QF PCR
Mikulášová A. et al, SLG konference 2014, Praha
Preimplantační genetická analýza pomocí highresolution
array-CGH
•nejčastější monozomie: chromozom 22 (7.7 %; 5/65), 7, 8 a
18 (po 6.1%; 4/65)
•nejčastější trizomie: chromozom 15, 21 a 22 (po 4,6 %; 3/65)
Výsledky PGS I.
Výsledky PGS II.
Visualization of 8.4 Mb segmental
deletion in chromosome 13q21.32 q22.2
affecting loci ofCDH9, KLHL1,
ATXN8OS, DACH1, C13orf37,
C13orf34, DIS3, PIBF1, KLF5, KLF1
gene.
Karyomapping – SNP profilování
SNP profilování rodičů + embryí = komplexní pohled, monogenní
choroby + detekce aneuploií
X
Chybí více dat,??
Karyomapping – SNP profilování
Karyomapping – SNP profilování
Karyomapping – SNP profilování
KUBÍČEK, David. Využití metod preimplantační genetické diagnostiky v reprodukční medicíně [online]. Brno, 2019 [cit. 2019-04-23]. Dostupné z:
KUBÍČEK, David. Využití metod preimplantační genetické diagnostiky v reprodukční medicíně [online]. Brno, 2019 [cit. 2019-04-23]. Dostupné z:
Kubeciek et al, Incidence and origin of meiotic whole and segmental chromosomal aneuploidies detected by karyomapping. 2018.
https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2018.11.023
Karyomapping – SNP profilování
Karyomapping – SNP profilování
Výhody
• Rychlá a efektivní metoda pro komplexní PGD
pokud máme vhodnou referenci
• Detekce strukturních delecí a aneuploidií dvou meiotických
chromozomů
Nevýhody
• Patentováno, není konkurence pro chemii, finančně náročné,
uzavřený systém
• Možnost problémů při absenci referenční DNA
Haplarithmisis
• 2016 – Vermeesch et al. – Nová koncepce analýzy halptypů
pro potřeby PGD
• Haplarithmisis – z řeckého „počítání haplotypů“
• Princip – celogenomová analýza haplotypů + detekce
nebalancovaných změn v rámci jedné buňky
• Analýza genotypu rodičů + blízký příbuzný
• Bioinformační algoritmus siCHILD (single-cell haplotyping and
imputation of linked disease variants)
= identifikace recesivních alel přenašečů, strukturních
změn i aneuploidií
= lze diagnostikovat meiotické aberace od mitotických
Haplarithmisis
Výhody
• Komplexní metoda kombinující výhody SNP profilování,
vazbovou analýzu a aCGH
• „Otevřený“ systém – lze použít data jak z SNP mikročipů
Illumina a Affimetrix, tak i NGS
Nevýhody
• Experimentálně a laboratorně velmi náročné
• Potřeba solného bioinformatického zázemí
• V současné době doména University Hospitals Leuven (prof
Veermeesh
Případné zjednodušení algoritmu má velký potenciál i pro menší
laboratoře a IVF centra
Haplarithmisis
Technologie masivního paralelního sekvenování
Technologie masivního paralelního
sekvenování (NGS) v IVF
• NGS technologie se pomalu začínají prosazovat i v rámci PGS
• Zpracování většího množství vzorků v jednom experimentu v
porovnávání s mikročip. technikami
•V současné době používány na velkých IVF klinikách hlavně pro
screening aneuploidií x možnosti komplexního pohledu (ploidie,
strukturní změny, mutace)
•Nejčastěji forma uzavřených systémů – Illumina, Ion Torrent, nebo
forma přípravy knihoven (např Agilent, Roche apod)
VeriSeq PGS (Illumina)
• Sekvenace syntézou
• Detekce aneuploidií za 12 hod.
• Až 24 vzorků, rozlišení 16 Mbp
VeriSeq PGS (Illumina)
VeriSeq PGS (Illumina)
VeriSeq PGS (Illumina)
BlueFuse analytický SW
VeriSeq PGS (Illumina)
Ion Torrent Semiconuctor Sequencing
Ion Torrent Aneuploidy Analysis
(Life Tech Inc.)
Ion Torrent Aneuploidy Analysis
• „Polovodičové“ sekvenování
• Založeno na detekci změny pH, která nastává při uvolnění H během
navázání báze na deoxyribózu
• Protokol do 24 hodin
• Rozlišení ~ 10 Mbp
• Cena 70$ / embryo při 32 společné analýze 32 embryí
Ion Torrent Aneuploidy Analysis
• „Polovodičové“ sekvenování
• Založeno na detekci změny pH, která nastává při uvolnění H během
navázání báze na deoxyribózu
• Protokol do 24 hodin
• Rozlišení ~ 10 Mbp
• Cena 70$ / embryo při 32 společné analýze 32 embryí
NGS u PGD
• Technologie budoucnosti
• Rutinnímu využití zatím brání cenové náklady a
algoritmus v laboratořích (3 vs. 5 denní embrya,
technologie vitrifikace apod.)
• Výhody - robustnější v porovnání s array-CGH,
větší kapacita,
• vyšší „dynamický interval“ - detekce mozaicismu
• Vývoj – detekce na exomové úrovni – „all in“
= CHA, mutace pro monogenní choroby
NGS u PGD
NGS u PGD
NGS u PGD
NGS u PGD
Agilent OneSeq Target Enrichment
Detekce CNAs, LOH a mutací v rámci jednoho experimentu
Knihovna: 60 Mbp / vzorek: 300 kbp rozlišení, LOH oblasti od 5 Mp, exomový
panel klinicky významných mutací
NGS u PGD
NGS u PGD - problémy?
1) S robustnějšími metodami screeningu narůstá objem dat – interpretace?
2) Detekce mozaicismu u embryí – transfer ano či ne?
3) PGD 2.0 – zlepšuje skutečně IVF výsledky?
Legislativa a IVF
• http://www.pharmaceutical-int.com/article/co2-incubator-for-in-vitro-fertilisation.html
Etické aspekty
• Pokrok technologií asistované reprodukce a
prenatální a preimplantační diagnostiky
vyžaduje úpravu etických a právních
norem, které by bránily jejich zneužití a
umožnili naopak jejich využití v prevenci
• Zabránění neodůvodněným genetickým
manipulacím….volba pohlaví ?
Po provedení PGD by měly být výsledky
konzultovány s klinickým genetikem
+
Měla by být provedena kontrola pomocí
prenatální genetické diagnostiky
Po PGD…
Rozhodnutí vždy přísluší rodině.
Děkuji za pozornost