Popis formátu cdf file:
http://dept.stat.lsa.umich.edu/~kshedden/Courses/Stat545/Notes/AffxFileFormats/cdf.html
Stiahnutie cdf ku konkrétnej platforme (hg-u133-plus)
http://www.affymetrix.com/support/technical/byproduct.affx?product=hg-u133-plus
BiocInstaller::biocLite("hgu133a2cdf") – instalacia platformy uz existujucej
BiocInstaller::biocLite("makecdfenv") – nastroj na vytvorenie prostredia k akejkolvek platforme (nutno mat
cdf file)
Affymetrix cdf files
https://wiki.metacentrum.cz/wiki/How_to_compute/Accessing_machines/Fro
m_Window
Krátky úvod metacentrum
Kapitola III.
Společné principy analýzy
genomických a proteomických dat
Výuka IBA
Genová exprese
 Gen je exprimovaný, pokud se přepisuje do mRNA
 Pokud se gen přepisuje, znamená to, že je aktivní
 Aktivitu genu můžeme měřit měřením množství
příslušné mRNA v buňce
DNADNA
mRNAmRNA
ProteProteíínn
přepis ~
exprese
překlad
Tradiční schémata analýzy I.
 Každý experiment má odlišné cíle, v závislosti od
typu dat a zájmů výzkumníků, ale existují tradiční
schémata které se opakují:
 Učení s učitelem (supervised learning)
Známa struktura dat musí byt zevšeobecněná na
nové data
 Porovnávání skupin (class comparison)
 hledáme rozdíly v expresi, v počtě kopií či
struktůře genů/proteinů mezi už definovanými
skupinami
 Předpovídání skupin (class prediction)
 na známých skupinách se snažíme vytvořit
klasifikátor, který by dokázal zařadit nového
pacienta do jedné ze skupin
Tradiční schémata analýzy II.
 Učení bez učitele (unsupervised learning)
 Objevování skupin (class discovery)
 Struktura v datach není známa, je potřebné ji
vytvořit, objevit!
 Na základě informací o genech/proteinech
hledáme nové skupiny
 Příklady:
• Existují nějaké soubory genů které se exprimují
stejně ve všech podmínkách?
• Onemocnění X je velmi heterogenní. Můžeme
identifikovat specifičtější podtypy, které by mohli
být cílem cílené terapie?
Společná schéma analýzy dat
Biologická otázka
(hypotéza)
N matic základních dat
(jedna pro každý z N vzorků)
Kontrola kvality
Normalizace
Sumarizace
Provedení experimentu
(hybridizace mikročipů,
hmotnostní spektrometrie...)
Dizajn
experimentu
Objevování skupin?
(Shlukování)
Porovnání skupin?
(Testování)
Predikce skupin?
(Klasifikace)
Analýza přežití
Analýza časových řad
Charakterizace nových
skupin
List genů
se stejným profilem
změn exprese v čase
Interpretace Validace Publikace
Matice informací o vzorcích
N x P
(např. klinická data v
medicíně)
Finální datová matice
N vzorků a K genů
(proteinů)
Nové skupiny
genů nebo vzorků
List genů
s odlišnou expresí
mezi skupinami vzorků
Klasifikační pravidlo
využívající
genovou expresi
Seznam
prognostických genů
Analýza
genových sad /
genových sítí
Kapitola V.1.
Porovnávání skupin
Výuka IBA
Příklady porovnávání skupin
 Pokud chceme zjistit
 jaké geny jsou aktivní/neaktivní
 jaký je rozdíl v přítomných proteinech mezi
dvěma nebo více skupinami:
 nemocní vs. zdraví pacienti
 pacienti před vs. po terapii
 pacienti v čase diagnózy a v čase relapsu
 bakterie v aerobním vs. anaerobním prostředí
 druh 1 vs. druh 2
 porovnáváme podtypy onemocnění
Základní metody pro porovnávání
Můžeme rozdělit do tří hlavních skupin:
 Metody studující velikost efektu změny mezi
skupinami
 Testování hypotéz
 Regresní strategie
Základní metody pro porovnávání
Můžeme rozdělit do tří hlavních skupin:
 Metody studující velikost efektu změny mezi
skupinami
 Testování hypotéz
 Regresní strategie
Velikost efektu / změny II.
1. Porovnává se poměr průměrů/mediánů jedné a
druhé skupiny: mean(X)/mean(Y).
2. Stanoví se fixní dělící hranice, které určují, jaká
velikost efektu je pro nás zajímavá
 Příklad: genová exprese, mean(X)/mean(Y), kde X
a Y jsou genové exprese ve skupinách. Použitá
hranice: 2!
 Výhody:
 jednoduché
Velikost efektu / změny III.
DNADNA
mRNAmRNA
DNADNA
mRNAmRNA
Skupina A. Zdravá tkáň Skupina B. Nádor
9/3 = 3
Gen g1 je 3x více exprimován v nádoru,
než ve zdravé tkáni
Velikost efektu / změny IV.
 Nevýhody:
 I menší změny mohou být biologicky významné
(malý efekt genu/proteinu může být znásobený kooperací
více genů v dráze)
 Data jsou ovlyvněné technickou a biologickou variabilitou:
 Co pokud máme 1.9?
 Poměry mohou být vychýlené směrem k nule
(například u nádorů s příměsí normálních buněk ve
vzorce)
 Neberou do úvahy variabilitu!
Testování hypotéz
Základní metody pro porovnávání
Můžeme rozdělit do tří hlavních skupin:
 Metody studující velikost efektu změny mezi
skupinami
 Testování hypotéz
 Regresní strategie
Testování hypotéz
 Klademe si otázku: Je aktivita/množství
proteinu/genu ve skupině A odlišné od průměrné
aktivity/množství proteinu/genu ve skupině B?

 Na každý protein/gen aplikujeme statistický test,
kterým získáme Tg statistiku a příslušné p-hodnoty
 Výběr testu
Počet skupin pro porovnání
Data jsou normální Data jsou normální
2 >2
T-test
Mann-Whitney
test
ANOVA
Kruskal-Wallis
test
ANO NE ANO NE
Testování hypotéz II.
Testuje se
 Nulová hypotéza (H0):
Gen / protein není odlišně exprimovaný mezi skupinami
versus
 Alternativní hypotéza (H1):
Gen je odlišně exprimovaný mezi skupinami
Na základě našich dat musíme rozhodnout, co je
pravda
 Nulovou hypotézu zamítneme jen pokud existuje
dostatečně silná evidence, že je neplatná
 Evidence – statistika a p-hodnota!
T-statistika I.
 Abychom rozhodli, která hypotéza je pravdivá,
sumarizujeme data do jednoho čísla
 V testovaní hypotéz se toto číslo nazývá statistika (Tstatistika,
Z-statistika, F-statistika...)
 T-statistika porovnává signál se šumem
 Signál = rozdíl průměrů ve skupinách (u microarray dat se
jedná o log(skupina 1)-log(skupina 2) =
log(skupina1/skupina2))
 Šum = směrodatná odchylka rozdílu (SD)
 T = log(skupina 1/skupina 2)/SD
 T hodnoty daleko od nuly indikují snížení a nebo
zvýšení exprese v jedné ze skupin
T-statistika II.
 Dvouvýběrový T-test pro porovnání rovnosti dvou průměrů μ1,
μ2:
 Průměr exprese genu ve skupině 1 vs. průměr ve skupině 2
 Pokud data mají normální rozložení a neexistuje
rozdíl mezi skupinami, tak T-statistiky pocházejí
z T-rozložení.
 p-hodnota = pravděpodobnost že dostaneme danou hodnotu Tstatistiky
nebo hodnotu větší, v případě, že neexistuje rozdíl mezi
skupinami
pg = Pr(Tg ≤ T)
 Dostatečně malá p-hodnota = významný rozdíl (silná evidence)
Tg=
μg1−μg2
sg
√1
n1
−
1
n2variabilita
-4 -2 0 2 4
0.00.10.20.3
Distribution of t-statistic (df =6)
t-values
y
Testování hypotéz III.
H0 nezamítneme H0 zamítneme
H0 je pravdivá
(gen není odlišně
exprimovaný)
Pravdivá negativita
(PN)
Falešná pozitivita
(FP)
Chyba I. druhu
H0 není pravdivá
(gen je odlišně
exprimovaný)
Falešná negativita
(FN)
Chyba II. druhu
Pravdivá pozitivita
(PP)
Testování hypotéz IV.
 Typické rozhodovací pravidlo:
 Výpočet T-statistiky a p-hodnoty
 Pokud p < 5%, gen je označený za odlišně exprimovaný
 Důležité: V případě, že platí nulová hypotéza, jsou p-hodnoty
rovnoměrně rozložené (vlevo). V případě, že je značná část
genů odlišně exprimovaná, rozložení p-hodnot už není
uniformní (vpravo).
Histogram of p.new
p.new
Frequency
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
05001000150020002500
Problém mnohonásobného porovnávání
Porovnáváme tisíce genů/proteinů mezi skupinami.

Hypotézu testujeme pro každý gen!

Máme zvýšenou šanci falešně pozitivních výsledků!
Příklad: 10 000 genů, žádný odlišně exprimovaný
mezi skupinami => 0.05 x 10 000 = 500 s p <
0.05.

p <0.05 už negarantuje významnost výsledku

Musíme tedy udělat korekci p-hodnot na
mnohonásobné porovnání
Korekce problému mnohonásobného
porovnávání
# nezamítnuté (NZ) # zamítnuté (Z)
#bez rozdílu Pravdivá negativita (PN)
Falešná pozitivita (FP)
Chyba I. druhu
# odlišné geny/proteiny
Falešná negativita (FN)
Chyba II. druhu
Pravdivá pozitivita (PP)
Chyby 1. druhu:
1. Family–wise error rate (FWER): Pravděpodobnost alespoň
jedné chyby prvního druhu (falešné pozitivity): FWER = Pr(FP >
0)
1. False discovery rate (FDR)(Benjamini & Hochberg,1995):
Očakávaný podíl falešně pozitivních výsledků mezi zamítnutými
hypotézami
FDR= E[FP/Z]
Korekce p-hodnot
 Kontrolujeme FWER
 Bonferroniho korekcia (pro nezávislé testy!)
p <  / m (napr. p < 0.05/10 000)
 Kontrolujeme FDR
 Benjamini/Hochberg procedura
FDR = 10% (ze 100 zamítnutých hypotéz
očekáváme 10 falešně pozitivních)
Který typ korekce použít?
 FWER pokud chceme aby VŠECHNY vybrané
geny/proteiny byly opravdu významné. Na druhou
stranu, nevybereme tak všechny významné geny!
 FDR pokud preferujeme vybrat většinu
významných genů/proteinů, a nevadí nám nějaké
falešně pozitivní
 q-hodnota je nejmenší FDR při které daný gen
ještě zůstává na listu pozitivních
III.1. Porovnávání skupin
Moderovaná T-statistika
• Problém ve statistickém testovaní mikročipových dat:
Příliš malé hodnoty exprese (blízké šumu) vykazují malou variabilitu
=> vysoké T-statistiky u biologicky nerelevantních genů!
Příklad:
• Aby se daly statistiky porovnat, je potřeba sjednotit variabilitu:
• Moderovaná T-statistika:
Konstanta korigující
variabilitu
dg=
μg1−μg2
sg +s0
Tg=
μg1−μg2
sg
μg1=2,μg2=2.5,
sg=0.02
=>Tg=−25
Significance analysis of microarrays (SAM)
• Tusher, Tibshirani a Chu (2001)
• Založená na moderované t-statistice (dg), počítá FDR
• Statistická významnost dg je následně stanovená permutacemi
původních dat a kalkulací očekávaného skóre v případě, že platí
nulová hypotéza (de)
• Gen je statisticky významný, pokud splňuje podmínku |dg - de | > Δ.
• Výhody: jednoduché
- Nevýhody: výpočtově náročné (permutace)
- Výstup: q-hodnoty
- biocLite(“samr“)
- library(samr)
dg=
μg1−μg2
sg +s0
SAM - algoritmus
Genová
exprese vzorků
Definuj a
spočítej
statistiku dg
Odhadni
rozdělení dg
Urči potenciálně
významné geny
Odhadni FDR
Permutace
vzorků
Vyber 
Skupiny vzorků
SAM - algoritmus
Genová
exprese vzorků
Definuj a
spočítej
statistiku dg
Odhadni
rozdělení dg
Urči potenciálně
významné geny
Odhadni FDR
Permutace
vzorků
Vyber 
Skupiny vzorků
dg=
μg1−μg2
sg +s0
SAM - algoritmus
Genová
exprese vzorků
Definuj a
spočítej
statistiku dg
Odhadni
rozdělení dg
Urči potenciálně
významné geny
Odhadni FDR
Permutace
vzorků
Vyber 
Skupiny vzorků
dg=
μg1−μg2
sg +s0
dp Seřaď Zkombinuj permutace
de
dgp=
μg1−μg2
sg +s0
SAM - výpočet očekávaných hodnot
• Pro každou permutaci p spočítej dgp
• Seřaď statistiky podle velikosti
• Definuj g-tou očekávanou hodnotu na základě N
permutací
SAM - algoritmus
Genová
exprese vzorků
Definuj a
spočítej
statistiku dg
Odhadni
rozdělení dg
Urči potenciálně
významné geny
Odhadni FDR
Permutace
vzorků
Vyber 
Skupiny vzorků
dg=
μg1−μg2
sg +s0
SAM – určení významných genů I
de
dg
SAM - algoritmus
Genová
exprese vzorků
Definuj a
spočítej
statistiku dg
Odhadni
rozdělení dg
Urči potenciálně
významné geny
Odhadni FDR
Permutace
vzorků
Vyber 
Skupiny vzorků
dg=
μg1−μg2
sg +s0
SAM – výpočet FDR
• t1 a t2 budou použité jako hranice
• Vypočítej průměrný počet genů, které v permutacích tyto
hranice překročily (byly významné)
• Odhadni počet falešně pozitivních genů v případě, že platí
nulová hypotéza podělením počtem významných genů v
originálním pozorování:
SAM – výpočet FDR, příklad
dg dp
SAM - algoritmus
Genová
exprese vzorků
Definuj a
spočítej
statistiku dg
Odhadni
rozdělení dg
Urči potenciálně
významné geny
Odhadni FDR
Permutace
vzorků
Vyber 
Skupiny vzorků
dg=
μg1−μg2
sg +s0
SAM – jak vybrat 
Parametr
Počet falešně
pozitivních
(z permutací)
Počet
označených za
významné
(v orig.)
FDR
Limma
• Smyth, G. K. (2004). Linear models and empirical Bayes methods
for assessing differential expression in microarray experiments.
Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology, Volume
3, Article 3. http://www.bepress.com/sagmbvol3/iss1/art3
• Lineární modely pro stanovení odlišné exprese z
mikročipových dat
• Balík se souborem funkcí pro normalizaci dat a porovnání exprese
mezi skupinami (včetně časových řad)
• Moderovaná statistika: variabilita je vyhlazená pomocí
empirických bayesovských metod
• biocLite(“limma“)
• library(limma)
Volcano plots I.
- log10(q-value) ~ -log10(0.1)=2.3
Volcano plots II.
library(limma)
volcanoplot(fit2, highlight=100)
Základní metody pro porovnávání
Můžeme rozdělit do tří hlavních skupin:
 Metody studující velikost efektu změny mezi
skupinami
 Testování hypotéz
 Regresní strategie
Regresní strategie
 Pokud máme víc jak 1 proměnnou, která může ovlivnit
genovou/proteinovou expresi
 genová exprese ~ skupina + pohlaví
Lineární modelování
 Pokud se snažíme zjistit, jak velmi se genová exprese
změní, pokud se změní hodnota nějaké spojité proměnné
 genová exprese ~ prežití
 genová exprese ~ věk
Lineární modelování, Coxův model proporcionálních rizik
 Chceme najít pravděpodobnost, že vzorek patří do určité
skupiny na základě expresní hodnoty daného genu
Logistická regrese
Porovnání skupin
Počet skupin
Normální data? Normální data?
2 >2
Počet
faktorů
Mann-Whitney
test, SAM
ANOVA,
Lineární modely,
SAM
Kruskal-Wallis test,
SAM
Lineární modely,
Coxův model
proporcionálních rizik
(časy prežití)
spojitá odpovědná
proměnná
ANO ANO NENE
T-test,
Lineární modely, SAM
Lineární modely
1 >1