Regulace exprese lidského genomu Genetický kód a tok genetické informace Skladba lidského genomu Jaderný genom 22 autosomů, 2 pohlavní chr., velikost 50-250 Mb, 35 000 genů Mitochondriální (MCH) genom (Anderson 1981) 14.5 kb, 0.5% celého genomu, dědí se výhradně od matky, při dělení buňky MCH DNA segreguje náhodně, 37 genů – syntéza na MCH ribosomech (vlastní rRNA a tRNA); MCH genom je kompaktní - kódující Repetitivní sekvence (např. Alu sekvence, LINE) transpozony Skladba genů u pro- a eukaryot Genom eukaryot obsahuje mezi kodujícími sekvencemi řadu nekódujících oblastí - intronů Geny : prům. velikost 10-15 kb ale variabilní od stovek bp- Mb (tRNA – Dys); exony činí od 100% až po 0.6% (Dys) Introny jsou velmi variabilní: 0-118 na gen (u colagenu); délka 0.5 kb pro b-globin až po 30 kb pro dystrofin Možnosti regulace exprese u eukaryot DNA RNA transkript mRNA mRNA inaktivní mRNA protein inactive protein regulace transkripce regulace sestřihu regulace transportu a lokalizace regulace translace regulace degradace mRNA regulace degradace a aktivity proteinu Jádro Cytoplasma Epigenetická regulace exprese Epigenetika zahrnuje jevy související s dědičnou modifikací struktury a transkripce chromatinu jež navazuje zejména na: - modifikace histonů - metylaci DNA - strukturu chromatinu a genomu Patří zde PEV, umlčování genů heterochromatinem, LCR regulace, regulace vývoje a diferenciace Polycom and trithorax proteiny, imprinting a další jevy. Nepatří zde vliv vnějších faktorů na expresi buněk. Úloha heterochromatinu při řízení exprese -PEV Heterochromatin – kondensovaná forma chromatinu po dobu buněčného cyklu - nachází se hlavně v centromerických a telomerických oblastech - je genově málo zastoupený, - obsahuje repetitivní sekvence - nachází se většinou na okraji buněčného jádra - DNA v heterochromatinu je špatně přístupná pro transkripční faktory, - histony jsou málo acetylovány a hodně metylovány, například na H3-K9 - obsahuje HP1 protein vázaný na di-/tri-metylovaný H3-K9 BrdU – late S phaseDAPI H3K9me3 Dvoustupňová regulace exprese (Francastel et al., 1999) Úloha heterochromatinu při řízení exprese Měřena vzdálenost genu od nejbližší oblasti heterochromatinu pro 3 typy buněk T-MEL – exprese umlčená gen je blízko heterochrom atinu Struktura se může otevřít - dole a k expresi ještě nemusí dojít N-MEL – struktura je otevřená, gen je aktivní Buňky HL-60 Granulocyty Vzdálenost Rb genů k chromocentrům (Bártová et al., 2000) Úloha heterochromatinu při řízení exprese Metylace DNA - Existují enzymy metylující de novo (DNMT3a a DNMT3b) - Funkce DNMT1 - Existují demetylázy (TET1-3 enzymes), které se uplatňují při degradaci metylace DNA. - Metylace DNA nastává nejčastěji v heterochromatinu a u nádorových buněk u symetrických CG sekvencích (CpG islands), zdrojem metylové skupiny je S-adenosylmethionin (SAM) Zachování metylace při replikaci „udržovací metylázou“ CH3 CH3CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Replikace Metylace DNMT1 Methylace DNA se u savců podílí na udržování genomové stability například prostřednictvím inaktivace chromozomu X. Na metylované CpG se váží specifické proteiny (MeCP) Joon et al., J. Cell Biol. (2018) Co označujeme za epigenetické faktory formylcytosine Obecně platí, že CpG ostrůvku se vyskytují převážně v promotorech house keeping genů a ty jsou fyziologicky fungujících buněk demethylovány na DNA. Methylace CpG se vyskytuje tedy jen v nádorových buňka, nebo v house keeping genech na inaktivním chromosomu X, v okamžiku kdy začne fungovat Xist. Dále výjimkou ve statusu demethylace CpG jsou buňky senescentní, u kterých se vyskytuje globální metylace genomu. Obecně u nádorových buněk platí, že se v genomu vyskytuje globální hypomethylace, ale nefyziologická lokální hypermetylace DNA . Úloha metylace při řízení transkripce - Transkripčně aktivní geny obsahují podstatně menší hladinu metylované DNA ve srovnání s inaktivními geny, - Inaktivní chromatin je obvykle metylován (např. inaktivní Xchromosom nebo inaktivované supresorové geny u nádorů) - Chromatin v místě metylace DNA je kondensovanější a brání přístupu TF Mechanismus jak metylace DNA vede ke kondensovanému chromatinu DNA metylace usnadňuje vazbu HDAC komplexů (přes MBP – methyl binding proteins) a histon metylázy (HMT). Tyto enzymy odstraní Ac skupinu a přidají Me skupinu na H3-K9, která je rozpoznána HP1 proteinem. Tento stav je dále šířen vazbou histon metyltransferázy na HP1. Umlčení exprese genu metylací de novo Umlčení genu probíhá v následujících krocích: 1) Odstranění regulačních proteinů 2) Metylace DNA 3) Vazba metylačně závislých proteinů 4) Deacetylázy a histon- metylázy 5) HP1 se váže na met. H3-K9 a posílí kondenzaci chromatinu Transkripční mapa genomu (Caron et al., 2001) HSA 18 and 19 (positioningand gene density) T. Cremer group, Munich