http://www.vesmir.cz | Vesmír 83, říjen 2004 581
V minulých stoletích se světelné mikroskopy
v biologii používaly převážně pro pozorování
a popis buněk či jejich výrazných struktur.
Rozvoj fluorescenční mikroskopie umožnil lokalizovat
v biologických systémech i jednotlivé
makromolekuly. Izolace zeleně fluoreskujícího
proteinu (GFP – green fluorescent protein)
z medúzy, příprava jeho barevných variant
(YFP – žlutá, CFP – modrozelená ad.) a objevy
dalších fluoreskujících proteinů (od modrých
po červené) v mořských korálech společně
s rozmachem konfokální mikroskopie (Vesmír
83, 586, 2004/10) v uplynulém desetiletí posunuly
hranice poznání v buněčné biologii a rozšířily
možnosti světelného mikroskopu. Mikroskopy
dnes neslouží jen k prostému popisu
buněčných organel, ale pomáhají odhalovat
pohyb i interakce jednotlivých molekul, především
proteinů, přímo v buňkách, a tím přispívají
k pochopení jejich biologických funkcí.
Protein, který chceme studovat, nejdříve
přímo v buňce geneticky „vybavíme“ fluorescenčním
přídavkem, např. již zmíněným GFP1
(chceme-li sledovat více proteinů současně,
použijeme pro každý typ proteinu jinou barevnou
variantu přídavku). Abychom mohli
úspěšně popsat jeho dynamické chování, stačí
navodit stav, při němž je pouze určitá část
molekul tohoto proteinu fluorescenčně aktivní.
Toho se dosahuje dvěma, v principu opačnými
přístupy: cíleným „vybělením“ (fotodegradací)
nebo fotoaktivací fluorescence.
l Vybělení fluorescence.2 Zvolenou oblast
buňky nejprve osvítíme intenzivním laserovým
pulzem s vlnovou délkou odpovídající
excitační vlnové délce GFP. Tím „označené“
molekuly proteinu (tj. vybavené fluorescenčním
přídavkem), které se právě nacházely
v dané oblasti, ztratí svou schopnost fluoreskovat.
Molekuly, které se nacházely mimo
tuto oblast, schopnost fluoreskovat neztratily
a postupně pronikají do sledované oblasti.
Intenzitu i rychlost těchto pohybů lze pozorovat
dvěma rozdílnými způsoby:
— jako opětovný nárůst fluorescence ve „vyběleném“
objemu (obr. 1),3
— jako úbytek fluorescence mimo něj.4
l Fotoaktivace fluorescence.Příkladem je fotoaktivovatelná
varianta GFP (PA-GFP). Ta
je v buňkách syntetizována ve stavu, ve kterém
nevykazuje žádnou fluorescenci v oblasti
viditelného světla. Jestliže ji však osvítíme
intenzivním zářením o krátké vlnové délce
(400–420 nm), struktura molekuly PA-GFP se
změní, a tím se aktivuje fluorescence v oblasti
zeleného světla, obdobná jako u klasického
GFP. Tato metoda tak umožňuje „označit“
molekuly, které se během fotoaktivace nacházejí
ve vybrané oblasti (obr. 4, s. 583), a je tak
velmi vhodná pro pozorování pohybu molekul
mezi buňkami v tkáních či mezi jednotlivými
strukturami v rámci jedné buňky.
Oba popsané přístupy pak vypovídají nejen
o tom, kde se sledované proteiny v buňce
vyskytují a jak rychle se pohybují, ale přinášejí
i odpovědi na otázky „Jak dlouho trvá přepis
genu?“, „Jak rychle po skončení reakce je
daný enzym znovu použit?“ ap.
Kromě pohybu a lokalizace jednotlivých
proteinů je důležité vědět, zda spolu sledované
proteiny interagují, popřípadě kde a jak
intenzivně. Technika umožňující sledovat to
přímo v buňce je založena na nezářivém přenosu
excitační energie (FRET – Fluorescence
Resonance Energy Transfer), který popsal
T. Förster v polovině 20. století. V principu
jde o přenos energie mezi dvěma vhodnými
fluorochromy nacházejícími se v příhodné
orientaci a vzdálenosti. Pokud se molekuly
fluorochromů CFP a YFP k sobě dostatečně
přiblíží (typická vzdálenost pro FRET je
5 nm) a vhodně se vůči sobě natočí, je pravděpodobné,
že po excitaci molekuly CFP tato
molekula získanou energii nezářivě předá
blízké molekule YFP, takže místo modrozelené
fluorescence pozorujeme fluorescenci žlutou
(obr. 5, 6, s. 584). Máme-li tedy buňku,
která produkuje rekombinantní formy dvou
zvolených proteinů kombinovaných s CFP,
resp. YFP a tyto proteiny spolu v buňce interagují,
může se stát, že budou obě základní
podmínky pro nezářivý přenos excitační
energie během interakce splněny a k měřitelnému
přenosu energie z donoru na akceptor
dojde. Přenos excitační energie představuje
vhodný nástroj k detekci mezimolekulárních
interakcí v buňkách. Lze tak například zjistit,
JAN BEDNÁR
DAVID STANĚK
JAN MALÍNSKÝ
KAREL KOBERNA
IVAN RAŠKA
Dnešní mikroskopie
v biomedicíně
Pohyb molekul
v přímém přenosu
z živé buňky
a další kouzla
MIKROSKOPIE
) V případě eukaryotických buněk se do buněčného jádra vpraví DNA, která
obsahuje genetický kód pro zvolený protein spolu s kódem pro GFP. Na
základě této genetické informace si buňka sama syntetizuje protein kombinovaný
s GFP – takzvaný rekombinantní protein. Protože při této přípravě
fluorescenčně značeného proteinu zůstává produkce původního „buněčného“
proteinu nezměněna, je třeba před vlastním experimentem otestovat kromě
funkčnosti rekombinantního proteinu i vliv nadprodukce studovaného proteinu
na chování buňky.
) Poznámka redakce: Ve Vesmíru jsme dosud užívali termín „vysvícení“, který
asi lépe postihuje podstatu jevu: svítí-li se dlouho na vzorek, který je fluorescenčně
značen, „světélkování“ zhasne a v zorném poli mikroskopu „nastane
tma“. Nicméně v odborném jazyce byl zaveden termín „vybělení“, k němuž
se přikláníme.
) Odborníci znají tuto metodu pod zkratkou FRAP (Fluorescence Recovery
After Photobleaching).
) V tomto případě mluvíme o metodě FLIP (Fluorescence Loss Induced by
Photobleaching).
Jan Bednár (*1960)
získal Ph.D. u profesora
J. Dubocheta v Lausanne,
kde se věnoval vývoji
metodiky nativních
kryořezů a jejich
aplikace na studium
struktury chromatinu
in situ. Později zkoumal
topologické vlastnosti
DNA-proteinových
komplexů, zejména 30 nm
chromatinového vlákna,
pomocí techniky tenké
vitrifikované vrstvy. Nyní
se jako stálý pracovník
Národního střediska pro
vědecký výzkum (CNRS)
na univerzitě v Grenoblu
zabývá elasticitou 30nm
chromatinového vlákna za
použití optické pinzety.
David Staněk, PhD.,
(*1970) vystudoval
Přírodovědeckou fakultu
UK. V drážďanském Ústavu
Maxe Plancka pro buněčnou
biologii a genetiku se zabývá
dynamikou proteinů a RNA
v živých buňkách a studiem
makromolekulárních
komplexů pomocí FRET.
Oba autoři plánují vrátit se
do Prahy v roce 2005.
Prof. RNDr. Ivan
Raška, DrSc., (*1945),
RNDr. Karel Koberna,
CSc., (*1965) a RNDr. Jan
Malínský, Ph.D., (*1970) se
v Ústavu buněčné biologie
a patologie 1. LF UK a na
oddělení buněčné biologie
Ústavu experimentální
medicíny AV ČR zabývají
funkční organizací
buněčného jádra.
582 Vesmír 83, říjen 2004 | http://www.vesmir.cz
kde se v buňce vytvářejí makromolekulární
komplexy, které právě studujeme (obr. 6).
Metody světelné mikroskopie nám poskytují
prostředek ke studiu uspořádání a dynamiky
buněčných struktur, nicméně jejich rozlišení
je příliš omezující („jen“ v řádu desetin
mikrometrů). Zvýšit jej lze jinými mikroskopickými
přístupy. Z nich jsou nejrozšířenější
metody elektronové mikroskopie („vidí“ v řádu
desetin nanometrů, tedy tisíckrát více než
optické). Zmíníme se o třech, které mají velké
uplatnění v biomedicínském výzkumu: o počítačové
tomografii, korelaci souběžné světelné
a elektronové mikroskopie a nativní elektronové
kryomikroskopii.
Počítačová tomografie v elektronové mikroskopii
umožňuje ze sady snímků pořízených
pod různými úhly pohledu rekonstruovat
prostorový obraz vzorku (princip je
popsán v Mikroskopii dnes, Vesmír 83, M9,
2004/3). Existuje množství vědeckých problémů,
pro jejichž řešení je počítačová tomografie
optimální nástroj. Jako příklad uvádíme
studium organizace replikačních domén
v jádře lidské buňky (obr. 3), jejichž velikost
a uspořádání jsou vhodné pro tomografickou
analýzu. V České republice zatím bohužel
moderní elektronový mikroskop s automatickou
tomografickou výbavou postrádáme.
Jiným nepochybně perspektivním přístupem
je srovnávací (korelativní) světelná a elektronová
mikroskopie, která studuje jediný jev
pomocí současného použití světelné a elektronové
mikroskopie. Zatímco světelná mikrosko�
�� �� �� ��
����������������������
�������
���������
��������
������
�
�
�
�
�
1. FRAP analýza
pohybu jednoho ze
sestřihových faktorů
nahromaděného
v jaderných skvrnách
(speckles; viz např.
Vesmír 79, 438,
2000/8) v živé
buňce. Na obrázcích
je jádro savčí buňky
před (A) a ihned
po (B; v čase t = 0 s)
vybělení fluorescence
v oblasti odpovídající
jedné jaderné skvrně
(v bílém kroužku),
následně pak
v průběhu (C) a po
dokončení (D) obnovy
fluorescenčního
signálu ve vybělené
oblasti. Intenzita
fluorescence v této
oblasti byla měřena
v časových intervalech
0,5 s. Naměřená
časová závislost
postupného obnovení
fluorescence obsahuje
důležité informace.
Kromě podílu
volně pohyblivých
molekul sledovaného
proteinu z ní lze
určit i rychlost jejich
difuze nukleoplazmou
a dynamiku vazby
proteinu na jaderné
skvrny. Je zřejmé,
že s výjimkou malé
pevně vázané frakce
se molekuly proteinu
v jaderných skvrnách
rychle obměňují
(nepublikované
výsledky J. Večeřové,
pořízené v laboratoři
T. Misteliho v USA).
Měřítko: 5 µm.
2. A – Elektronová kryomikroskopie izolovaného chromatinu. DNA se v buněčném
jádře nachází v komplexu s množstvím proteinů, zejména histonů, které
tvoří malé proteinové cívky – nukleozomy –, okolo nichž je DNA v pravidelných
intervalech navinuta a vytváří chromatinové vlákno. Jednotlivé části snímku
představují segmenty různé velikosti tohoto vlákna. Protože jsou zachovány ve
své původní trojrozměrné konformaci, jsou nukleozomy zachyceny v různých
projekcích (příklad pohledu zpředu je označen šipkou, příklad pohledu z boku
hvězdičkou). Měřítko: 20 nm. B – Snímek minikroužku DNA pořízený elektronovým
kryomikroskopem; 156 párů bází dlouhá molekula DNA uzavřená do cirkulární
formy a vytvářející miniaturní obruč o průměru přibližně 16 nm. Protože ve
vitrifikované vrstvě může být volně orientovaná, lze najít i projekce čistě boční,
kde se kruh mění v úsečku.
) Významné zlepšení v tomto směru představuje metoda mrazové substituce.
Změny probíhající ve vzorku během nahrazování vody při nízké teplotě a následném
zalití však dovolují hovořit o uchování nativního obrazu vzorku pouze
v omezeném rozlišení.
C
BA
D
BA
pie dovoluje pozorovat živé buňky, a tedy sledovat
např. časový průběh studovaného jevu,
elektronová mikroskopie díky vysoké rozlišovací
schopnosti odhaluje jemné detaily, které
by jinak zůstaly skryty. Světelněmikroskopický
obrázek se následně porovnává s elektronmikroskopickým
snímkem téže oblasti buňky
a studovaná struktura se detailně popíše
i z hlediska jejího uspořádání. V některých případech
tento přístup nejen zpřesní světelněmi-
3. Elektronmikroskopický obraz řezu lidskou buňkou
s místy nově se replikující DNA. Místa replikující se
DNA byla imunocytochemicky označena a zviditelněna
jako malé shluky stříbrných částic (příklady označeny
šipkou). Struktury tohoto typu jsou vhodné pro
tomografickou rekonstrukci (Anna Ligasová, nepublikované
výsledky). Cy – cytoplazma, N – jádro, Nu
– jadérko. Měřítko: 0,5 µm.
http://www.vesmir.cz | Vesmír 83, říjen 2004 583
kroskopická pozorování, ale pomůže odhalit
i chybné závěry založené pouze na výsledcích
světelné mikroskopie. Omezená rozlišovací
schopnost fluorescenčního mikroskopu např.
nedovolí jednoznačně určit, ve které části jadérka
probíhá transkripce ribozomálních genů
(obr. 7, s. 585). Matematické odstranění nezaostřené
části fluorescenčního signálu (dekonvoluce)
vede v tomto případě dokonce k chybnému
umístění aktivních ribozomálních genů
do fibrilárních center jadérka. Z elektronmikroskopického
snímku je však zřejmé, že transkripčně
aktivní geny jsou soustředěny výlučně
v denzních fibrilárních komponentách. Vysoké
prostorové rozlišení elektronové mikroskopie je
v tomto případě nenahraditelné.
Elektronová kryomikroskopie je zatím jediná
metoda elektronové mikroskopie, která
dokáže zobrazit biologický preparát v jeho nativním
(přirozeném) stavu. Při použití klasických
metod (Vesmír 83, 146, 2004/3) se musí
biologický vzorek nejdříve vhodně fixovat, popřípadě
šetrně zbavit vody (dehydratovat). To
jsou však pomalé procesy, které poskytují buněčným
strukturám dostatek času, aby se přeorganizovaly
nebo změnily svá uspořádání.5
Elektronová kryomikroskopie umožňuje
vodu v biologickém preparátu zachovat. Při
teplotě okolo –180 °C je parciální tlak nasycených
vodních par tak malý, že se voda nevypařuje
ani v hodnotách vakua elektronového
mikroskopu (resp. vypařuje se, ale velmi
málo). Současně se veškeré chemické reakce
zcela zastaví. Kdyby bylo možné biologický
vzorek „zmrazit“, a potom jej při dostatečně
nízké teplotě pozorovat v elektronovém mikroskopu,
zůstal by hydratovaný, tedy ve svém
přirozeném stavu (zůstala by zachována jeho
původní jemná struktura). Jakkoli to zní jednoduše,
pro úspěšné uplatnění tohoto přístupu
bylo třeba řešit řadu zásadních problémů.
Při obyčejném zmrazení biologického materiálu
vznikají krystaly ledu, což vytváří mnoho
artefaktů, od přerozdělení rozpustných
složek až po mechanická poškození. Dosáhne-li
však rychlost ochlazování zhruba milion
stupňů za sekundu, vzniká nekrystalické pevné
skupenství vody, amorfní led, který nemá
na strukturu vzorku vliv. Tento proces se na���
������
���������������
������������������
�����
4. Fotoaktivovatelný
GFP (PA-GFP).
CFP a PA-GFP
byly připojeny
k bílkovinám,
které se nacházejí
ve specifických
jaderných strukturách
– Cajalových tělískách
(Vesmír 79, 563,
2000/10).
Zatímco CFP je
snadno viditelný,
PA-GFP je před
aktivací v podstatě
nedetekovatelný. Po
fotoaktivaci laserem
o vlnové délce 405 nm
se molekuly PA-GFP
v místě aktivace
„rozsvítí“ a lze
pozorovat jejich pohyb
v buněčném jádře.
Měřítko: 5 µm.
OPTICKÁ PINZETA
Aby naše informace o pohybu a interakcích
sledovaných molekul byly úplnější,
bylo by dobré změřit síly a energie nezbytné
k vytvoření makromolekulárních
komplexů nebo k přeskupení struktur,
jejichž součástí jsou sledované bílkoviny.
Jedním z moderních přístrojů, který
umožňuje tyto velmi malé síly (a tedy nepřímo
i energie) měřit, je optická pinzeta.
Její princip objevil Arthur Ashkin koncem
sedmdesátých let minulého století.
V čem spočívá? Několikamikronový průhledný
objekt, který se nachází v silném
světelném paprsku s určitým rozdělením
intenzity, bude vždy vtahován do místa
s největší intenzitou. Jestliže tedy někde
v prostoru vytvoříme bod, kde bude intenzita
světla výrazně vyšší než v blízkém
okolí, průhledný mikroobjekt bude
do tohoto bodu přitažen a nebude z něj
moci uniknout, dokud jej nějaká vnější
síla z této „optické pasti“ nevytáhne. Vytvořit
takový bod je možné pomocí zaostření
intenzivního laserového svazku
objektivem světelného mikroskopu s velkou
numerickou aperturou (obr. A).* Optická
past funguje jako velice citlivý detektor
síly, neboť síla F nutná k vychýlení
objektu z klidové polohy v optické pasti
je přímo úměrná velikosti vychýlení x, tedy
F = k . x. Konstanta k závisí na mnoha
parametrech (tvaru a velikosti objektu,
intenzitě laserového paprsku ad.) a lze ji
určit kalibrací optické pinzety. Změříme-li
pak s velkou přesností velikost vychýlení
objektu z centra optické pasti (souA
– Schéma optické pinzety. Laserový paprsek (červeně) je odražen dichroickým zrcadlem
(d) do objektivu mikroskopu a zaostřen. V ohnisku vzniká optická past, v níž je chycena
malá kulička. Druhá kulička je upevněna v miniaturní pipetě a mezi nimi je upevněn vzorek
(např. chromatinové vlákno). Obraz kuličky je promítán osvětlovacím systémem mikroskopu
(žlutě) na detektor polohy kuličky (modře). Pohybem pipety (ve směru šipky) se natahuje
vlákno a vychýlení kuličky v optické pinzetě lze zaznamenat elastickou křivkou. Dosáhneme-li
při zkoumání chromatinu určité prahové síly, nukleozom se zbortí (viz legendu
k obr. 2) a náhle se uvolní zhruba 25 nm DNA, což se projeví „zuby“ na grafu (B).
��� ��� � ��� ���
��
��
��
��
��
��
��
�
�
���������
��������������������������
časné metody umožňují přesnost až jednoho
nanometru), budeme moci určit velikost
síly, která na objekt působí. Takto je možné
měřit síly řádu pikonewtonů (10–12 N)
a zjistit např. elastické vlastnosti proteinových
komplexů s DNA (obr. B). Podobné
experimenty umožnily určit sílu, kterou
je schopna vyvinout RNA-polymeráza během
přepisu DNA do RNA, nebo síly spjaté
s „kráčením“ kinezinu (typ molekulárního
motoru, viz Vesmír 75, 309, 1996/
06) podél mikrotubulu.
*) Numerická apertura charakterizuje optickou soustavu
v souvislosti s její rozlišovací schopností, hloubkou ostrosti
a množstvím světla, které jí projde za určitý čas. Čím je
větší, tím více detailů soustava rozlišuje a tím více světla jí
prochází.
A B
584 Vesmír 83, říjen 2004 | http://www.vesmir.cz
zývá vitrifikace a její použití na biologický
materiál bylo klíčovým krokem pro zavedení
metod elektronové kryomikroskopie v biologii.
Při vitrifikaci se vzorek zchladí (a tedy
fixuje) během několika desítek mikrosekund,
což mimo jiné umožní zavést tzv. časově rozlišenou
elektronovou mikroskopii. Můžeme
si představit, že studovanou biologickou reakci
spustíme a vzorky budeme připravovat
vždy po uplynutí určitého časového intervalu.
Časové rozlišení se bude pohybovat v řádech
jednotek až desítek sekund, ale stále to je
o několik řádů rychleji než při přípravě vzorku
standardní metodou.
Amorfní led je bohužel nestabilní struktura,
která při překročení mezní (devitrifikační)
teploty přechází do formy krystalické. Proto
se po vitrifikaci vzorku musí všechny operace
provádět při teplotě nižší než devitrifikační
(–130 °C) a elektronový mikroskop musí být
přizpůsoben pro práci za těchto teplot. Dnes
jsou nezbytná kryovybavení k elektronovým
mikroskopům běžně dostupná i v České republice
a některá pracoviště u nás jsou jimi
již vybavena.
Existují dvě základní techniky elektronové
kryomikroskopie. Mikroskopie tenké vrstvy
a mikroskopie nativních hydratovaných ultratenkých
řezů. Mikroskopie tenké vitrifikované
vrstvy se používá především ke studiu izolovaných
proteinových a nukleoproteinových
komplexů a částic až do velikosti asi 200 nm.
Umožňuje dosáhnout subnanometrového rozlišení
při zachování zcela nativního stavu biologického
komplexu (obr. 8). Tato procedura
nedovoluje dodatečné kontrastování těžkými
kovy, a výsledný kontrast snímků je proto velice
slabý. Naštěstí pokrok v zobrazovací kvalitě
elektronových mikroskopů, zejména konstrukce
vysokokontrastních objektivových
čoček a vysoce koherentních zdrojů elektronů,
umožňuje využít fázový kontrast. Tím
lze bez dodatečného kontrastování zviditelnit
i takové struktury, jako jsou DNA nebo
chromatinové vlákno (obr. 2). Navíc skutečnost,
že je preparát zachován ve svém původním
prostorovém uspořádání, umožňuje jeho
věrnou rekonstrukci. Byly to právě výsledky
elektronové kryomikroskopie (obr. 2A), které
vedly k zásadní změně pohledu na uspořádání
30nm chromatinového vlákna a vyústily
v zavedení „cikcak“ modelu.6
Pro pozorování nativních preparátů tkání
nebo buněk se používá elektronová kryomikroskopie
nativních hydratovaných řezů. Jak
napovídá název techniky, jde o přípravu ultratenkých
(~50 nm) řezů vitrifikovaného biologického
materiálu. Metoda zahrnuje množství
technologicky velice náročných postupů,
od samotné vitrifikace „objemného“ vzorku
přes ultratenké krájení a operace s řezy při velmi
nízkých teplotách po vlastní pozorování
v elektronovém mikroskopu. Přestože se tato
velmi složitá metoda vyvíjí již více než dvacet
let, zvládají ji pouze nejmodernější laboratoře.
Po přípravě ultratenkých řezů nebo tenké
vitrifikované vrstvy následuje bez jakýchkoli
dodatečných operací pozorování v elektronovém
mikroskopu. I tady nastává řada obtíží,
neboť vzorek je nesmírně citlivý na elektrono-
5. Modely detekce nezářivého přenosu excitační energie (FRET) mezi molekulami
CFP a YFP. A – Pokud se molekuly CFP a YFP připojí k bílkovinám, které spolu
interagují, mohou se CFP a YFP přiblížit na vzdálenost okolo 5 nm. Při vhodné
orientaci obou molekul může dojít k nezářivému přenosu excitační energie, při
němž se excitační energie z donoru (CFP) přenese na akceptor (YFP), který ji
následně vyzáří a toto záření je detekováno. B – Alternativní postup nepřímého
měření FRET; akceptor (YFP) se „zničí“ silným laserovým pulzem. FRET se po
fotodestrukci akceptoru projeví zvýšením fluorescence donoru (CFP) o energii,
která byla před fotodestrukcí přenášena na akceptor.
Přímé měření emise akceptoru po excitaci donoru (A) je velmi vhodné pro měření
v živých buňkách, nicméně náročné na pečlivé a zdlouhavé provádění celé
sady kontrolních měření. Nepřímá metoda detekce FRET pomocí zvýšení fluorescence
donoru po fotodestrukci akceptoru (B) poskytuje velmi dobré výsledky
převážně u fixovaných preparátů (obr. 6). Další technika pro detekci FRET je
založena na měření toho, jak se zkracuje dohasínání fluorescence donoru při realizaci
přenosu energie z donoru na akceptor. Rychlost dohasínání fluorescence
donoru je možné měřit v živých buňkách, navíc i v případě fluorochromů s velmi
podobnými spektry. Tento přístup však vyžaduje technicky i finančně náročné
vybavení pro detekci s nanosekundovým časovým rozlišením, a není proto běžně
dostupný.
���
����
���
������
���
����
���
����
���
����
���
��������������
���������������
�
�
������
���
����������
���
�����
�����������������������
������������������
����������������������
������������������������
���������������
����������������������
����������������������
���������������
6. Nezářivý přenos
excitační energie
(FRET) v buněčném
jádře. A – CFP a YFP
byly připojeny
k bílkovinám, které
spolu v buňce
interagují. Tyto
bílkoviny se hromadí
v Cajalových
tělískách. FRET byl
měřen nepřímou
metodou (obr. 5B).
Po fotodestrukci
akceptoru (YFP) ve
vybrané oblasti buňky
o velikosti asi 4 × 5 µm
(bílý obdélník) se
FRET projeví jako
zvýšený signál
donoru (CFP) v dané
oblasti. Buněčné
jádro je naznačeno
přerušovanou
čárou. B – Pohled na
stejnou buňku jako
na obrázku A. Profily
intenzit donoru
před fotodestrukcí
akceptoru a po ní
jasně ukazují zvýšení
fluorescence pouze
v tělískách, ve kterých
byl akceptor zničen
(bílé šipky). Měřítko:
5 µm.
B
A
http://www.vesmir.cz | Vesmír 83, říjen 2004 585
vý svazek. Kromě jiného zvyšuje jeho interakce
s elektrony lokální teplotu a to může vést
k následné krystalizaci vody. Vyhledávání
vhodné oblasti vzorku i vlastní snímkování se
proto musí provádět při minimální intenzitě
svazku elektronů a typická celková dávka by
neměla přesáhnout 1000 elektronů na čtvereční
nanometr (tj. stokrát až tisíckrát méně než
u klasického preparátu). To značně zvyšuje
nároky na citlivost snímání signálu. Mikroskopy
jsou proto v poslední době vybavovány
citlivými CCD-kamerami, jejichž zavedení
dokonce umožnilo realizovat elektronovou
kryotomografii. Vůbec nejobtížnější je pravděpodobně
interpretace získaných snímků.
Za dobu padesáti let si biologové zvykli na
vysoce kontrastní obrázky buněk a buněčných
struktur a nebylo nikdy pochyb, kde například
je v buněčném jádře heterochromatin
a kde euchromatin. Na nekontrastovaných řezech
však tento rozdíl mizí a musí se hledat
rozdíly jiné, například texturální (zrnitost,
vláknité uspořádání ap.).7 Naproti tomu lze
na nativních hydratovaných řezech pozorovat
detaily, které jsou v klasickém preparátu
překryty kontrastními barvivy, a hlavně jsou
odstraněny všechny artefakty, které vznikají
při přípravě vzorku standardními technikami.
Je nesporné, že přínos této techniky odpovídá
úsilí a prostředkům věnovaným na její
vývoj. Některé vědecké výsledky nešlo získat
jiným způsobem, např. údaje o uspořádání
nukleozomů v tekutých krystalických fázích.
Využití mikroskopů a nových mikroskopických
přístupů v buněčné biologii prodělalo
v posledních patnácti letech bouřlivý rozvoj,
který stále pokračuje. Zásadním způsobem
pomáhá hlouběji porozumět buněčným
funkcím, ať již v základním biologickém výzkumu
či v medicíně. Česká věda jej nemůže
opomíjet, chce-li hrát důstojnou roli na mezinárodní
vědecké scéně. Nutnou (avšak nikoliv
postačující) podmínkou pro to však je, že
se odpovídající přístrojové vybavení stane inventářem
našich laboratoří. Ö
�
�
�
7. Simultánní světelná a elektronmikroskopická lokalizace
míst transkripce ribozomálních genů na řezu
jadérkem lidské buňky. Ve fluorescenčním mikroskopu
(A) je jadérkový transkripční signál soustředěn do
malých ohnisek (červeně) rozptýlených uvnitř jadérka
(zeleně). Po použití elektronové mikroskopie (detailní
pohled v B, celé jadérko modrozeleně v C) je zřejmé,
že zlaté kuličky (černé tečky v B), které odpovídají
místům výskytu nově syntetizovaných ribozomálních
RNA, se nacházejí výhradně v jisté oblasti jadérka
označované jako denzní fibrilární komponenty (d). Na
počítačové kombinaci obou snímků (C) je patrné, že
ohniska fluorescence (červeně) naproti tomu zasahují
ještě jak do fibrilárních center (f), tak do granulární
části jadérka (g). Měřítko: 200 nm (B), 500 nm (C).
Obrázek je publikován s laskavým svolením Journal of
Cell Biology, The Rockefeller University Press.
GFP – JEDINEČNÁ SVÍTÍCÍ BÍLKOVINA
Molekula zeleného fluorescenčního proteinu
(GFP), izolovaná z mořské medúzy pohárovky
(Aequorea victoria), má podobu soudku o průměru
3 a výšce 4 nm, v němž je uzavřen unikátní
obsah: skupina tří aminokyselin (SYG – Serinu,
tYrosinu a Glycinu), která při osvícení modrým
světlem zeleně fluoreskuje. Je hodně jiných bílkovin,
které ve svém řetězci mají stejnou sekvenci
aminokyselin, a přesto nesvítí. V GFP „světlonoš
uzraje“, až když se po dokončení proteosyntézy
polypeptidový řetězec sbalí do podoby zmíněného
soudku. Téměř uprostřed, dokonale ochráněna
od okolních vlivů, se skupina SYG přemění
do cyklické podoby, oxiduje a začne fluoreskovat.
Na rozdíl od ostatních fluoreskujících bílkovin,
které jsou citlivé na světlo až po připojení nějaké exotické molekuly, je molekula
GFP schopna provést tuto kosmetickou změnu sama na sobě, modifikací
svých vlastních aminokyselin. Pro její využití ve vědě to má obrovský význam
– protože nepotřebuje žádný specifický enzym ze „své“ medúzy, lze GFP připravit
v libovolném organizmu. Oba konce GFP molekuly zůstávají navíc vně
soudku a jsou tedy volně přístupné. Na libovolný z nich lze proto další peptidovou
vazbou připojit jiné bílkoviny, a to již na genové úrovni. Stejně jako
při syntéze samotného GFP, po vytvoření fúzního proteinu z GFP a studované
bílkoviny se soudek GFP sám sbalí a připraví pánům vědcům k laskavému
použití. Sledování míst výskytu studované bílkoviny je pak triviální – stačí si
na ni posvítit modrým světlem, které budí fluorescenci GFP.
���������������
�����������������
����������������
��������
������ ��������
8. Příprava vzorku
pro elektronovou
kryomikroskopii
tenké vrstvy.
Mikroskopická síťka
pokrytá perforovanou
membránou (v detailu
jedno oko síťky) se
upevní do pinzety
a vzorek ve formě
suspenze (například
virus) se nanese
pomocí pipety na
membránu. Po
šetrném odsátí většiny
tekutiny vytvoří
jeho zbytek na síťce
velice tenkou vrstvu
(50–150 nm), která je
okamžitě ponořena do
zkapalněného etanu
o teplotě –180 °C
(šipka) a vzorek je
během několika
desítek mikrosekund
vitrifikován.
) Existují varianty techniky
tenké vrstvy, které využívají
i amplitudový kontrast (např.
negativní kryokontrastování), ale
jejich použití je omezené.
) Přímé „čtení“ takových snímků
bývá obtížné i pro odborníka,
a proto snímek nativního
kryořezu nezařazujeme.
C
B
A