Historie a metody genomiky Eduard Kejnovský a Roman Hobza 1891 Henking pracoval na spermatogenezi u Pyrrhocoris apterus Polovina dceřiných buněk měla jeden element (chromosom) navíc X bylo označení neurčitosti pozorovaného 1902 McClung označil tento element jako „accessory“ chromosom (X chromosome) Objev pohlavních chromosomů sex_chromosome_real Tenebrio molitor, Coleoptera ( F = AAXX, M = AAXY ) mealworm wilson Chromosomální determinace pohlaví (1905) Nettie Stevens Edmund Wilson 1928 - Fred Griffith: experimenty na Streptococcus pneumonia Dva kmeny: Smooth (S) - virulentní Rough (R) - nevirulentní Přeměna neškodných bakterií ve virulentní Injeckce R a teplotně inaktivovaných S bakterií - myši zemřely a obsahovaly S bakterie 01-12 1944 - Avery, MacLeod, and McCarty •Smíchali R kmen s DNA z S kmene a izolovali S bakterie •Přidali DNase - inhibice transformace •Přidali proteasy - transformace proběhla •DNA určena jako “transformační princip” • Sekvenování genomů •1988 americký kongres stál u zrodu Genbank genbankgrowth • • Proč sekvenovat dál? •Komparativní genomika •Biomedicínský výzkum •Osobní genom Frederick Sanger 1975 - Dideoxy sekvenační metoda 1977 – osekvenoval Φ-X174 (5,368 bp) 1980 – dostal druhou Nobelovu cenu za chemii Později (polovina 80-tých let) osekvenoval bakteriofága λ pomocí shotgun metody (48,502 bp) Sekvenování genomů •1986 Leroy Hood: první automatický • sekvenátor • •1986 Human Genome Initiative – •1990 započat projekt sekvenování • lidského genomu (předpokládaná • doba 15 let) • beyondhgp reflections_hood Leroy Hood Sekvenování genomů •1995 John Craig Venter sekvenoval první bakteriální genom • •1996 první eukaryotický genom (kvasinka) sekvenován 1102_Horz_Venter_top_R John Craig Venter Craig Venter Global Ocean Sampling Expedition Synthetic genomics Human Longevity Inc Craigventer2.jpg (3328×4992) http://www.youtube.com/watch?v=J0rDFbrhjtI •1997 sekvence E. coli • •1998 Caenorhabditis elegans genom (první • multicelulární genom) • •1999 lidský chromozom 22 sekvenován Sekvenování genomů 2010 Ideální lidský genom sekvenován 2010 Ideální lidský genom sekvenován Sekvenování genomů •2000 Drosophila melanogaster genom • •2001 Human Genome Sequencing: předběžná sekvence lidského genomu covermed Sekvenování genomů •duben 2003 Lidský genom. Sekvence myšího genomu. • •duben 2004 • Sekvence krysího genomu mosaic The Race for the $1000 Genome. Science 311: 1544 – 1546, 2006 Honba za sekvencemi ØHuman genome (first draft) – $300 million (2001) ØRhesus macaque – $22 million (2006) ØMammalian genome – $100,000 (by the end of 2006) Ø Honba za sekvencemi •X prize foundation •10,000,000$ tomu, kdo osekvenuje během 10 dnů sto lidských genomů (Hawking…..) Redukce kopmlexity Hi-Cot selection Redukce kopmlexity Methylation filtration (MF) E. coli McrBC (5mC restriction) Sheath fluid Deflection plates Excitation light Waste Right collector Left collector Laser Scattered light Fluorescence emission Relative fluorescence intensity Chromosomes in suspension Flow sorted chromosomes Flow karyotype Flow chamber Flow sorted chromosomes Redukce kopmlexity – třídění chromosomů Laserová mikrodisekce Výhody: vysoká čistota Nevýhody: malý počet chromozomů, pracnost LASER Aplikace Separované chromosomy 102 copies 104 copies 106 - 107 copies 103 copies •Cytogenetic mapping •BAC libraries •454-sequencing •Physical mapping using PCR Linear amplification Chromosomálně specifické genomové knihovny Malování chromosomů – chromosome painting • Metody sekvenování sanger1 sanger2 Porous GEL + _ LASER DETECTOR aggctcctctcccacc a ag agg aggc aggct aggctc …….. •http://www.454.com Genome Sequencer 20 System 454 pyrosequencing (2005) DNA library preparation Fragmentace DNA Ligace adaptoru Vychytání DNA molekul denaturace emPCR Vznik emulze (olej) emPCR emPCR Vychytání kuliček Vychytání kuliček denaturace Sekvenační primer Disperze na sklíčko Disperze na sklíčko Parametry mikroreaktorů Parametry mikroreaktorů • sekvenace sekvenace sekvenace sekvenace sekvenace sekvenace sekvenace sekvenace SOLID (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) • 2-base encoding sequencing (2007) Solexa (2007) • • HELICOS (2008) True Single Molecule Sequencing (tSMS) Coming soon: 15-minute, $100 human genome sequencing Single Molecule Real-Time (SMRT) Pacific Biosciences 20 zeptolitrů Další technologie •Nanopore sekvenování •Mikroelektroforéza •Sekvenování na bázi microarray