Hodnocení ekologických rizik
04 – Hodnocení účinků
Mgr. Jana Vašíčková, Ph.D.
vasickova@recetox.muni.cz
Osnova
Hodnocení účinků:
• Obecné zákonitosti
• Závislosti dávka - odpověď
• Testy toxicity - vodní, sedimentové a akvatické testy
• Hodnocení účinků - populace, ekosystémy
Hodnocení účinků
Fáze Analýzy rizik
• Analýza je proces, který zkoumá dvě hlavní složky rizika, expozice a
účinků a jejich vztahy mezi sebou navzájem
• Cílem je poskytnout data nezbytné pro stanovení nebo předpovídání
ekologické odezvy na stresory za podmínek expozice
• Produktem fáze analýzy jsou souhrnné profily, které popisují expozici a
vztah mezi stresorem a odpovědí.
• Tyto profily tvoří základ pro odhad a popis rizika v charakterizaci rizik.
• Průběh fáze analýzy:
– Selekce dat, která budou použita na základě jejich užitečnosti pro
vyhodnocení hypotéz
– Analýza expozice - zkoumání zdroje stresorů, distribuci stresorů v životním
prostředí a míru společného výskytu nebo kontakt
– Analýza dopadu - zkoumání vztahu stresor-odpověď, důkazy kauzality a
vztah mezi měřenými efekty a hodnocenými endpointy
Expozice v ekotoxikologii a v EcoRA
expozice v HHRA:
C8580 Analýza rizik
Dr. Pavel Čupr
Hodnocení účinků
• Hodnocením účinků se rozumí posouzeni vlivu stresoru (a jeho různé
míry působeni, různé doby a časovaní) na živy organismus - receptor.
• Nezbytným zjištěním je jaký učinek má kontaminant na sledovaný
receptor.
• Hodnocený biologický receptor = biologický systém, který bude využit
jednak k identifikaci existujících nebo potenciálních účinků stresoru
(fáze hodnoceni účinků) a na kterém bude dokumentovaná
nebezpečnost stresoru pro hodnocené zájmové území a jeho
ekosystémy (fáze formulace problému nebo hodnoceni účinků).
• Před vlastním posuzovaným účinku je nutné definovat (ve fázi
formulace problému EcoRA) organismy (receptory), pro které bude
hodnoceni účinku provedeno.
Chemikálie v
prostředí
Biodostupnost
“Expozice”
akutní
chronická
Toxikokinetika
Biotransformace, bioaktivace,
metabolismus, vylučování …
Cílové místo
“Efekt”
Hladiny, osud,
procesy
Chemikálie v
organismu
biomonitoring
Základní kritéria pro výběr vhodných biologických receptorů
• Hodnoceným biologickým receptorem myslíme biologicky systém, který
bude využit jednak k identifikaci existujících nebo potenciálních učinků
stresoru a na kterém bude dokumentovaná nebezpečnost stresoru pro
hodnocené zájmové území a jeho ekosystémy.
• Cilovym parametrem (endpointem) hodnoceni je míněn znak hodnoceného
biologického systému, kteremu je podřizena metodika hodnocení, a ktery je
jednoznačně parametrizován.
• Výběr indikátorových systémů pro dany environmentální problém musí
probíhat podle standardizovanych postupů a musi byt obhajitelny
předevšim jako reprezentativni pro hodnocenou situaci.
• Citlivost a způsob zastoupeni vybraných modelů musí při hodnoceni
vylučovat falešně negativní výsledky, vybraná sada biologických receptorů
musí vest k interpretacím závažným pro zájmové území a v něm zahrnuté
ekosystémy.
• Jeden typ modelového biologického receptoru může byt současně
hodnocen vice cílovými parametry nebo tyto mohou byt členěny na primární
a sekundární dle priority poskytované informace.
Hodnocení účinků
• Bude účinek téže dávky u daného druhu stejný organismu vždy stejný?
• Liší se v citlivosti jednotlivé druhy mezi sebou?
• Jaký vliv na účinek mají další ekologické faktory?
• Typ účinku se liší jednak podle chemické látky, jednak podle
sledovaného receptoru
– nutno vybrat vhodný receptor
– účinek kontaminantu odpovídajícím způsobem charakterizovat a
kvantifikovat
• Hodnocení účinků kvantitativně spojuje koncentrace kontaminantů se
škodlivými účinky v receptorech, dále podává informace o vztahu dávka
odpověď.
Vztahy Dávka - Odpověď
Toxikant působí škodlivý efekt v biologickém systému
- po vstupu do prostředí dosahuje látka určitých koncentrací v
prostředí
- toxický efekt je vyvolán dávkou v těle - působení koncentrace látky
v těle po definovanou dobu
- Osud jedu v organismu – toxikokinetika
- Účinky jedu na organismus – toxikodynamika
Toxikologie – práce s dávkami v těle
mg/kg hmotnosti (mg/kg b.w. - body weight), mg/kg b.w./day
Ekotoxikologie –práce s koncentracemi v prostředí
v prostředí měříme koncentrace ne dávky
Vztahy Dávka - Odpověď
Toxikant působí škodlivý efekt v biologickém systému
Příklady efektů?
• změna zdravotního stavu
• pokles příjmu potravy
• snížení reprodukční schopnosti
• mortalita
V experimentu se hodnotí POZOROVATELNÝ (měřitelný) PARAMETR =
ENDPOINT
• charakterizuje účinek a má k účinku jasný vztah
• % přežívajících jedinců po působení dávky (efekt – mortalita)
• počty vajíček po působení dávky (efekt - reprodukční toxicita)
Endpoint může být „kvalitativní“ (nemusí být kvantifikovatelný):
- př. iritace na kůži ANO/NE
- kategorizace NEJHORŠÍ / LEPŠÍ / NEJLEPŠÍ
Pro srovnání toxicity různých látek (vzorků) se užívají
parametry odvozené z křivky dávka-odpověď
1) Parametry odvozené přímo z experimentálních dat
LOEC/L Lowest Observable Effect Concentration/L
- první nejnižší koncentrace použitá v experimentu, která vyvolala
významné efekty
NOEC/L No Observable Effect Concentration/Level
- podobně: koncentrace použitá v experimentu …
Nedostatky - subjektivní
– závisí na zvolených koncentracích
– jiný experiment  jiné výsledky (koncentrační rozmezí, ředicí faktor
rozdíly mezi koncentracemi 2x, 5x, 10x…)
Pro srovnání toxicity různých látek (vzorků) se užívají
parametry odvozené z křivky dávka-odpověď
2) další parametry odvozené z křivky dávka – odpověď
ECx (x=1,5,10,25,50,75,90,99 apod.)
- ne vždy je v experimentu dosaženo „přesně 5% efektu“
- parametry se počítají (z „modelované křivky“)
STANDARD - Hodnoty odvozené pro 50% efekt
- nejčastěji užívány pro srovnání toxicity (!)
- odhady v oblasti 50% efektů zatíženy nejmenší chybou
Parametry
LC50 – koncentrace (C) způsobující 50% letalitu (L)
LD50 – dávka (Dose) způsobující 50% letalitu (L)
EC50 – koncentrace způsobující 50% efekt (E)
IC50 – koncentrace způsobující 50% inhibici (I)
Metody hodnocení účinků
Obecné metody hodnocení účinku
• Tři obecné přístupy
– Literární rešerše
– Testování toxicity
– Terénní studie
Literární rešerše
• Obrovské množství publikovaných a nepublikovaných informací o
vztahu dávka-odpověď
– Relativně rychlá a cenově dostupná cesta pro hodnocení existujících hladin
kontaminantů a jejich potenciálních škodlivých účinků
– Druhově specifické informace pro receptory z dané hodnocené oblasti jsou
často nedostupné
Zdroje
https://cfpub.epa.gov/ecotox/
https://www.efsa.europa.eu/en/topics/topic/pesticides
https://www.efsa.europa.eu/en/search/site/%22public%20consultation%20on
%20the%20active%20substance%22?solrsort=ds_published_date%20desc&r
esults_per_page=20&page=0
https://sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/en/
http://www.piskac.cz/ETD/
https://www.echemportal.org/echemportal/page.action?pageID=9
https://www.atsdr.cdc.gov/
https://www.freshwaterecology.info/
https://toxnet.nlm.nih.gov/
Testování toxicity
• Může získat údaje o indikaci potenciálních účinků a vytvářet tak spojení mezi
kontaminanty a v terénu pozorovanými škodlivými ekologickými účinky
• Výběr testu by měl být založen na:
– Typu habitatu
– Zájmové složce prostředí
• Voda, sediment, půda a složení (složení)(tvrdost, mechanické
vlastnosti….)
– Na základě definovaných receptorů (organismus, populace, společenstvo,
ekosystém)
– Hodnoceném endpointu (smrt organismu, snížení reprodukce, fekundity,
počet jedinců)
– Typu hodnoceného kontaminantu
METODY HODNOCENÍ EFEKTŮ
Praktické metody stanovení ekotoxicity
- laboratorní biotesty in vitro
- laboratorní biotesty in vivo - jednodruhové
- laboratorní mikrokosmy
- manipulované a kontrolované mezokosmy
- polní studie
- reálné ekosystémy
Roste obtížnost průkazu
KAUZALITY
Cílem ekotoxikologických analýz je poznání efektů, které
způsobuje přítomnost stresorů na organismy v prostředí
- suborganismální úroveň laboratoř
- jednotlivé organismy laboratoř
- populační efekty laboratoř
mikro/mezokosmy
- efekty ve společenstvech mikro/mezokosmy
polní studie
terénní pozorování
- ekosystémové efekty terénní pozorování
ekologická reálnost, relevance obtížnost stanovení
Hodnocení efektů v ekotoxikologii
Testování toxicity
• Laboratorní a terénní metody
– Měří účinky u endpointů - přežití, růst, reprodukce
– Může testovat individuální kontaminanty nebo složky prostředí obsahující
směsi kontaminantů
– Akutní a chronické testy
– Akvatické, terestrické a mikrobiální testy
– Endpointy zahrnují mortalitu, snížení reprodukce, snížení růstu, genetické
poškození
1) Standardní biotesty
2) Alternativní biotesty
3) Další biotesty (specifické mechanismy, in vitro testy)
4) Testy procesů (biodegradabilita, bioakumulace ...)
5) Testy orgánové toxicity s laboratorními zvířaty
obratlovci, savci "humánní toxikologie"
6) Experimentální mikro a mezokosmy
7) Polní studie
Laboratorní
ekotoxikologické
biotesty
In situ
hodnocení
efektů
"Experimentální (zpravidla laboratorní) metody stanovení toxického působení
stresorů (toxických látek) na přírodní organismy"
Ekotoxikologické biotesty
Ekotoxikologické biotesty
– Nástroje pro hodnocení účinků:
• nejběžnější, nejpoužívanější, nejvíce propracovaný systém
– Standardní nástroje
• Jednodruhové  jeden konkrétní kmen  standardní jedinci (uniformní věk,
velikost apod.)
• Zcela optimální podmínky
– potrava, teplota, pH, světlo
– bez dalšího biotického stresu (predátoři, infekce..)
Hlavním požadavkem ekotoxikologické studie je
průkaz KAUZALITY mezi expozicí (látkou) a efektem
(= nejčastěji průkaz „jak se toxicita mění s dávkou“ – dávka/odpověď)
• Jaké vlastnosti má mít „modelový“ organismus pro
standardizovaný biotest ?
 snadná dostupnost (laboratorní kultury, komerční dostupnost ...)
 snadné uchování a chov v laboratorních podmínkách do
dostatečných množství pro experimenty (rychlý reprodukční cyklus)
 Známá biologie druhu a genetika příslušné kultury
 jsou prostudovány relativní citlivosti druhu / kultury k různým třídám
toxických látek
 citlivost druhu by měla být dobrým reprezentantem příslušné skupiny
organismů
 Daphnia  korýši / bezobratlí
 Zebřička  kaprovité ryby / obratlovci
Ekotoxikologické biotesty
OECD guidelines
http://www.oecd.org/document/40/0,3746,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html
Test No. 201: Alga, Growth Inhibition Test 11 July 2006
Test No. 221: Lemna sp. Growth Inhabition Test 11 July 2006
Test No. 202: Daphnia sp. Acute Immobilisation Test 23 Nov 2004
Test No. 211: Daphnia magna Reproduction Test 16 Oct 2008
Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test 17 July 1992
Test No. 204: Fish, Prolonged Toxicity Test: 14-Day Study 04 Apr 1984
Test No. 210: Fish, Early-Life Stage Toxicity Test 17 July 1992
Test No. 212: Fish, Short-term Toxicity Test on Embryo and Sac-Fry Stages 21 Sep 1998
Test No. 215: Fish, Juvenile Growth Test 21 Jan 2000
Test No. 229: Fish Short Term Reproduction Assay 08 Sep 2009
Test No. 230: 21-day Fish Assay 08 Sep 2009
Test No. 231: Amphibian Metamorphosis Assay 08 Sep 2009
Aquatic organisms
Test No. 218: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Sediment 23 Nov 2004
Test No. 219: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Water 23 Nov 2004
Test No. 233: Sediment-Water Chironomid Life-Cycle Toxicity Test Using Spiked Water or Spiked
Sediment
23 July 2010
Test No. 225: Sediment-Water Lumbriculus Toxicity Test Using Spiked Sediment 15 Oct 2007
Sediment organisms
Organization for Economic Cooperation Development
Soil organisms
Test No. 208: Terrestrial Plant Test: Seedling Emergence and Seedling Growth Test 17 Aug 2006
Test No. 227: Terrestrial Plant Test: Vegetative Vigour Test 17 Aug 2006
Test No. 207: Earthworm, Acute Toxicity Tests 04 Apr 1984
Test No. 220: Enchytraeid Reproduction Test 23 Nov 2004
Test No. 222: Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei) 23 Nov 2004
Test No. 228: Determination of Developmental Toxicity of a Test Chemical to Dipteran Dung
Flies(Scathophaga stercoraria L. (Scathophagidae), Musca autumnalis De Geer (Muscidae))
16 Oct 2008
Test No. 232: Collembolan Reproduction Test in Soil 08 Sep 2009
Test No. 226: Predatory mite (Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer) reproduction test in soil 16 Oct 2008
Test No. 216: Soil Microorganisms: Nitrogen Transformation Test 21 Jan 2000
Test No. 217: Soil Microorganisms: Carbon Transformation Test 21 Jan 2000
Test No. 213: Honeybees, Acute Oral Toxicity Test 21 Sep 1998
Test No. 214: Honeybees, Acute Contact Toxicity Test 21 Sep 1998
Test No. 205: Avian Dietary Toxicity Test 04 Apr 1984
Test No. 206: Avian Reproduction Test 04 Apr 1984
Test No. 223: Avian Acute Oral Toxicity Test 23 July 2010
Other tests
OECD guidelines
http://www.oecd.org/document/40/0,3746,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html
Organization for Economic Cooperation Development
ISO guidelines
Aquatic microorganisms
ISO 10712:1995 Water quality -- Pseudomonas putida growth inhibition test (Pseudomonas cell multiplication inhibition test)
ISO 11348-1:2007 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent
bacteria test) -- Part 1: Method using freshly prepared bacteria
ISO 11348-2:2007 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent
bacteria test) -- Part 2: Method using liquid-dried bacteria
ISO 11348-3:2007 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent
bacteria test) -- Part 3: Method using freeze-dried bacteria
ISO 13641-1:2003 Water quality -- Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria -- Part 1: General test
ISO 13641-2:2003 Water quality -- Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria -- Part 2: Test for low biomass concentrations
ISO 13829:2000 Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu-test
ISO 16240:2005 Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water -- Salmonella/microsome test (Ames test)
ISO/DIS 11350 Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water -- Salmonella/microsome fluctuation test (Ames
fluctuation test)
ISO 15522:1999 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water constituents on the growth of activated sludge microorganisms
ISO 21338:2010 Water quality -- Kinetic determination of the inhibitory effects of sediment, other solids and coloured samples on the light
emission of Vibrio fischeri (kinetic luminescent bacteria test)
ISO 8192:2007 Water quality -- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation
ISO 9509:2006 Water quality -- Toxicity test for assessing the inhibition of nitrification of activated sludge microorganisms
International
Standardization
Organization
ISO guidelines
International
Standardization
Organization
Aquatic plants
ISO 20079:2005 Water quality -- Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on duckweed (Lemna minor) --
Duckweed growth inhibition test
ISO 8692:2004 Water quality -- Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae
ISO/CD 16191 Water quality - Determination of the toxic effect of sediment and soil on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum Myriophyllum
test
ISO 10253:2006 Water quality -- Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum
ISO 10710:2010 Water quality -- Growth inhibition test with the marine and brackish water macroalga Ceramium tenuicorne
ISO 14442:2006 Water quality -- Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and
waste water
ISO/DIS 13308 Water quality -- Toxicity test based on reproduction inhibition of the green macroalga Ulva pertusa
ISO/TR 11044:2008 Water quality -- Scientific and technical aspects of batch algae growth inhibition tests
ISO guidelines
International
Standardization
Organization
ISO guidelines
International
Standardization
Organization
ISO guidelines
Aquatic invertebrates
ISO 6341:1996 Water quality -- Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) -- Acute toxicity test
ISO 10706:2000 Water quality -- Determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
ISO/DIS 14380 Water quality -- Determination of the acute toxicity to Thamnocephalus platyurus (Crustacea, Anostraca)
ISO/CD 16303 Water quality -- Determination of toxicity of fresh water sediments using Hyalella azteca
ISO 10872:2010 Water quality -- Determination of the toxic effect of sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of
Caenorhabditis elegans (Nematoda)
ISO 16712:2005 Water quality -- Determination of acute toxicity of marine or estuarine sediment to amphipods
ISO 20665:2008 Water quality -- Determination of chronic toxicity to Ceriodaphnia dubia
ISO 20666:2008 Water quality -- Determination of the chronic toxicity to Brachionus calyciflorus in 48 h
ISO 14669:1999 Water quality -- Determination of acute lethal toxicity to marine copepods (Copepoda, Crustacea)
ISO/DIS 14371 Water quality -- Determination of freshwater-sediment subchronic toxicity to Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda)
ISO 7828:1985 Water quality -- Methods of biological sampling -- Guidance on handnet sampling of aquatic benthic macro-invertebrates
ISO 8265:1988 Water quality -- Design and use of quantitative samplers for benthic macro-invertebrates on stony substrata in shallow freshwaters
ISO 8689-1:2000 Water quality -- Biological classification of rivers -- Part 1: Guidance on the interpretation of biological quality data from surveys of
benthic macroinvertebrates
ISO 8689-2:2000 Water quality -- Biological classification of rivers -- Part 2: Guidance on the presentation of biological quality data from surveys of
benthic macroinvertebrates
ISO/DIS 10870 Water quality -- Guidelines for the selection of sampling methods and devices for benthic macroinvertebrates in fresh waters
ISO/WD 16778 Water quality -- Calanoid copepod development test with Acartia tonsa
ISO guidelines
International
Standardization
Organization
ISO guidelines
Aquatic vertebrates
ISO 15088:2007 Water quality -- Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio)
ISO 7346-1:1996 Water quality -- Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio HamiltonBuchanan
(Teleostei, Cyprinidae)] -- Part 1: Static method
ISO 7346-2:1996 Water quality -- Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio HamiltonBuchanan
(Teleostei, Cyprinidae)] -- Part 2: Semi-static method
ISO 7346-3:1996 Water quality -- Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio HamiltonBuchanan
(Teleostei, Cyprinidae)] -- Part 3: Flow-through method
ISO 10229:1994 Water quality -- Determination of the prolonged toxicity of substances to freshwater fish -- Method for evaluating the effects
of substances on the growth rate of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum (Teleostei, Salmonidae))
ISO 12890:1999 Water quality -- Determination of toxicity to embryos and larvae of freshwater fish -- Semi-static method
ISO 21427-1:2006 Water quality -- Evaluation of genotoxicity by measurement of the induction of micronuclei -- Part 1: Evaluation of
genotoxicity using amphibian larvae
ISO 21427-2:2006 Water quality -- Evaluation of genotoxicity by measurement of the induction of micronuclei -- Part 2: Mixed population
method using the cell line V79
ISO 23893-1:2007 Water quality -- Biochemical and physiological measurements on fish -- Part 1: Sampling of fish, handling and preservation of
samples
ISO/TS 23893-2:2007 Water quality -- Biochemical and physiological measurements on fish -- Part 2: Determination of ethoxyresorufin-Odeethylase
(EROD)
ISO/CD 23893-3 Water quality -- Biochemical and physiological measurements on fish -- Part 3: Determination of vitellogenin
ISO guidelines
International
Standardization
Organization
ISO guidelines
Soil microorganisms
ISO 10381-6:2009 Soil quality -- Sampling -- Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under aerobic conditions for the assessment of
microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 14240-1:1997 Soil quality -- Determination of soil microbial biomass -- Part 1: Substrate-induced respiration method
ISO 14240-2:1997 Soil quality -- Determination of soil microbial biomass -- Part 2: Fumigation-extraction method
ISO 16072:2002 Soil quality -- Laboratory methods for determination of microbial soil respiration
ISO 17155:2002 Soil quality -- Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves
ISO 15685:2004 Soil quality -- Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification -- Rapid test by ammonium oxidation
ISO 14238:1997 Soil quality -- Biological methods -- Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on
these processes
ISO 23753-1:2005 Soil quality -- Determination of dehydrogenase activity in soils -- Part 1: Method using triphenyltetrazolium chloride (TTC)
ISO 23753-2:2005 Soil quality -- Determination of dehydrogenase activity in soils -- Part 2: Method using iodotetrazolium chloride (INT)
ISO/DIS 11063 Soil quality -- Method to directly extract DNA from soil samples
ISO/TS 29843-1:2010 Soil quality -- Determination of soil microbial diversity -- Part 1: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) and phospholipid
ether lipids (PLEL) analysis
ISO/PRF TS 29843-2 Soil quality -- Determination of soil microbial diversity -- Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the simple
PLFA extraction method
ISO/TS 10832:2009 Soil quality -- Effects of pollutants on mycorrhizal fungi -- Spore germination test
ISO/TS 22939:2010 Soil quality -- Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using fluorogenic substrates in micro-well plates
ISO 11266:1994 Soil quality -- Guidance on laboratory testing for biodegradation of organic chemicals in soil under aerobic conditions
ISO 15473:2002 Soil quality -- Guidance on laboratory testing for biodegradation of organic chemicals in soil under anaerobic conditions
ISO 14239:1997 Soil quality -- Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions
ISO guidelines
International
Standardization
Organization
ISO guidelines
Soil invertebrates
ISO 11268-1:1993 Soil quality -- Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) -- Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate
ISO 11268-2:1998 Soil quality -- Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) -- Part 2: Determination of effects on reproduction
ISO 11268-3:1999 Soil quality -- Effects of pollutants on earthworms -- Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations
ISO 11267:1999 Soil quality -- Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants
ISO 16387:2004 Soil quality -- Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) -- Determination of effects on reproduction and survival
ISO 15952:2006 Soil quality -- Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) -- Determination of the effects on growth by soil contamination
ISO 20963:2005 Soil quality -- Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) -- Determination of acute toxicity
ISO 17512-1:2008 Soil quality -- Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour -- Part 1: Test with earthworms
(Eisenia fetida and Eisenia andrei)
ISO/DIS 17512-2 Soil quality -- Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour -- Part 2: Test with collembolans
(Folsomia candida)
ISO 23611-1:2006 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 1: Hand-sorting and formalin extraction of earthworms
ISO 23611-2:2006 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and Acarina)
ISO 23611-3:2007 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 3: Sampling and soil extraction of enchytraeids
ISO 23611-4:2007 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 4: Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting nematodes
ISO/DIS 23611-5 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 5: Sampling and extraction of soil macro-invertebrates
ISO/DIS 23611-6 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 6: Guidance for the design of sampling programmes with soil invertebrates
ISO guidelines
International
Standardization
Organization
ISO guidelines
Plants
ISO 11269-1:1993 Soil quality -- Determination of the effects of pollutants on soil flora -- Part 1: Method for the measurement
of inhibition of root growth
ISO 11269-2:2005 Soil quality -- Determination of the effects of pollutants on soil flora -- Part 2: Effects of chemicals on the
emergence and growth of higher plants
ISO 17126:2005 Soil quality -- Determination of the effects of pollutants on soil flora -- Screening test for emergence of
lettuce seedlings (Lactuca sativa L.)
ISO 22030:2005 Soil quality -- Biological methods -- Chronic toxicity in higher plants
ISO/CD 29200 Soil quality -- Assessment of genotoxic effects on higher plants -- Micronucleus test on Vicia faba
ISO guidelines
International
Standardization
Organization
Vztahy Dávka (koncetrace) - Odpověď
Note
No Observed Effect Concentration (NOEC)
Lowest Observed Effect Concentration (LOEC)
ECx ( x % effects concentration)
LCx ( x % lethal concentration)
Využití křivky dávka - odpověď
Srovnání toxicity různých látek
Problém: různé směrnice (sklon) křivky Dávka-Odpověď
 Pro interpretaci je nutno uchovat (ukázat) data celé křivky
Příklad:
Na základě EC50 není rozdíl
ALE
látka 1 vykazuje efekty ve
významně nižších koncentracích
(bude mít nižší LOEC/NOEC]
Výsledkem hodnocení toxicity jsou
„KONCENTRACE“
• Vyjádření KONCENTRACÍ při hodnocení TOXICITY
• (1) čisté látky a definované směsi látek
(barvy, produkty chemické výroby ...)
KONCENTRACE hmotnostní nebo molární
– mg/L, ug/L, mmol/L (=mM), nmol/L (=nM) apod.
• (2) vzorky z prostředí a jejich extrakty (výluhy apod.)
- KONCENTRACE původní matrice
př. Voda …. EC50 = 1% (100x ředěná voda vyvolává 50% efekt)
- KONCENTRACE EXTRAKTU (% ředění ...)
Adverse Outcome Pathways (AOP)
• AOP je uspořádané vyjádření biologických událostí vedoucích k
nepříznivým účinkům, a je považováno za důležité pro hodnocení rizika.
• Dosavadní znalosti jsou použity pro kauzální spojení dvou klíčových
událostí: molekulární iniciační události (MI) a nepříznivý výsledek (AO),
které se vyskytují na úrovni biologické organizace
• popisuje řetězec kauzálně spojených akcí na různých úrovních
biologické struktury, které vedou k nepříznivému vlivu na zdraví nebo
ekotoxikologického účinek.
• http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/adverse-outcome-pathways-
molecular-screening-and-toxicogenomics.htm
Adverse Outcome Pathways (AOP)
Organism
Traditionally – Evaluation of adverse effects using the whole organism models
New – Ex vivo / in vitro / In chemico / In silico Methods
Key task/question:
How to link MECHANISTIC INFORMATION with APICAL ENDPOINTS ?
Adverse Effects
Death
Inhibition of Growth
Altered Reproduction
Tumor
Skin irritation
…
Chemical
Macro-
Molecular
Interaction
Cellular
Response
Organ
Response
Organism
Response
Population
Response
Molecular
Initiating
Event
Key
Event 1
Key
Event 2
Adverse Outcome
Tissue
Effect
Key
Event 3
Chemical
Property
Receptor/Ligand
Interactions
DNA Binding
Protein
Oxidation
Gene Activation
Protein
Production
Altered
Signaling
Altered Physiology
Disrupted Homeostasis
Altered Development / Function
Lethality
Impaired
Development
Impaired
Reproduction
Altered Sex
Ratio
Extinction
Toxicity Pathway
Mode of Action
Adverse Outcome Pathway
In silico, In chemico, In Vitro, Ex vivo In vivo
Základní úrovně pro EcoRa
• Organismus
• Populace
• Ekosystém- základní modelovou jednotkou v EcoRa
– Nejkomplexnější jednotka
– Zahrnuje živé i neživé složky
– Zahrnuje mezidruhové vztahy
– Zahrnuje vlivy vedlejších faktorů
– Přechod k regionálnímu hodnocení
Základní úrovně pro EcoRa
ALE: … realita & cíl ekotoxikologie je
 Chránit populace v ekosystémech
BIOTA
POPULACE
SPOLEČENSTVA
(interakce mezi populacemi)
EKOSYSTÉMY
Hodnocení účinků na úrovni populace, společenstva,
ekosystémů
Efekty na biochemické a úrovni organismů
- relativně snadno popsatelné a stanovitelné
- dobrá kvantifikace
Efekty na úrovni populací a společenstev
- obtížně studovatelné a kvantifikovatelné
- komplexnost a variabilita
- dobře prokazatelné až velké změny
- pomalé projevy
- organismální efekty nejsou vždy interpretovatelné
- obtížně prokazatelná kauzalita "toxikant <-> efekt"
- obtížně predikovatelné
• Ecosystems are NOT more complex than we think.
They are more complex than we CAN think.
Hodnocení účinků na úrovni populace, společenstva,
ekosystémů
Variabilita v populacích … je přirozená
Základní „měřitelné“ PARAMETRY populací
(demografické parametry)
Populace - Jedinci téhož druhu, kteří obývají ve stejném čase stejné
území (lokalitu)
Primární parametry
• natalita: počet jedinců za jednotku času (a nejčastěji jedince)
• mortalita: počet jedinců kteří zemřou za jednotku času (a nejčastěji jedince)
(JINAK: za jak dlouho zemře příslušný jedinec)
• měřítko velikosti (performance) – úspěšnost – specifický parametr pro různé
druhy (např. velikost, počet jedinců, počet semen, květů, množství biomasy aj.)
Sekundární parametry - odvozené z primárních
• závislost natality, mortality, performance na výchozí velikosti
• frekvence (četnost / jak často?) přechodu z jedné velikostní třídy do druhé
(~ rychlost růstu populace: oba uvedené body vyjadřují totéž, jen v pojetí kvantitativním a
kvalitativním)
EKOTOXIKOLOGIE V POPULACÍCH
Vlastnosti na úrovni jedince, které jsou klíčové pro udržení/růst
populací:
- vyspělost k rozmnožování
(rychlost dosažení / růst / pohlavní dospělost)
- rozmnožování
(produkce gamet – počty, kvalita…)
Efekty toxických látek na úrovni jedince
 projevy na úrovni populací
- změny abundancí / počtů (snížení růstové kapacity)
- změny natality / fekundity
- změny demografie (př. stárnutí populace)
EKOTOXIKOLOGIE V POPULACÍCH
• Příklady:
1) selekce genů v populacích
- antibiotika-rezistentní bakterie (viz jinde)
- hmyz rezistentní na pesticidy (viz jinde)
- znečištění vzduchu - drsnokřídlec v Británii: tmavé vs. Světlé varianty
https://www.idnes.cz/technet/veda/cesti-a-britsti-vedci-objevili-duvod-drasticke-premeny-bileho-motyla-na-
muru.A110415_1567100_veda_vse
- rezistence (snížení citlivosti) k toxicitě kovů
2) změny v rozložení pohlaví v populacích („sex ratio“)
- pohlaví u člověka
- změny rozložení pohlaví u hmyzu
3) vliv toxických látek na velikost a rozmnožování
- Hg vs. ryby
Životní cyklus druhu a populační ekotoxikologie
• Citlivost různých vývojových stadií
- zásadní význam pro demografii populace
• Mladší stadia (embrya) bývají citlivější k vlivům toxikantů
- citlivost: rychle dělící se buňky u embryí a larev
- viz embryotoxicita
• Důsledek - snížení fekundity  stárnutí populace
– Výjimky - mechanická ochrana (povrchové vrstvy)
• rezistence vajíček ryb (vs. vysoce citlivá embrya ryb)
• semena rostlin, klidová stadia dalších organismů
1) Experimentální studie reprodukční toxicity
- D. magna – 21 denní reprodukční test
- Žížaly – 4 týdenní reprodukční testy
- chvostoskoci Folsomia candida - reprodukční testy
2) Testy celoživotního cyklu
- Např. pakomáři Chironomus
(OECD guideline 233)
3) Modelování
(např. DEB modely)
Jak prostudovat účinky s dopady na populace ?
Hodnocení účinků na úrovni společenstva, ekosystémů
• Nejasné vymezení v terénu
• Praktická nemožnost kompletního popisu (nelze sestavit úplný seznam
druhů)
• Časová a finanční náročnost ekosystémového výzkumu
• Obtížný popis a kvantifikace jevů
• Typický pro ekosystémovou úroveň
• Definování škodlivosti na úrovni ekosystému je obtížné
– „zdravotní stav“ a jeho změny jsou těžce definovatelné
– Projevuje se vliv ostatních ekologických faktorů, ztěžují možnost určit vliv
samotného kontaminantu
– Negativní postižení jednoho druhu organismu vyvolá negativní odezvu u
řady dalších druhů, nebo současně pozitivní reakci u jiných druhů (kteří jsou
konkurenty)
– Účinek toxikantu nevede k likvidaci ekosystému ale přeměně na jiný
ekosystém -v něm se realizují jiné druhy, sukcesní vývoj
Společenstvo - biocenoza (Community)
• Soubor populací různých druhů, které spolu žijí v určitém prostředí
(biotopu) a vzájemně spolu interagují (existence vazeb)
• Příklady vztahů (interakcí) mezi populacemi druhů
– Kompetice (o potravu, o prostor, o světlo …)
– Symbioza
– Potravní vztahy / potravní řetězce
– atd. atd.
• -> důsledek: variabilita / přirozené kolísání počtů
Základní principy – ZPĚTNÉ VAZBY
ZPĚTNÉ VAZBY
pozitivní = nárůst „B“ způsobuje nárůst „A“
A+ B+
negativní = nárůst „B“ způsobuje pokles „A“
A- B+
Příklady:
- propojené populační cykly králíka a rysa (predátor)
+ další součásti biocenozy  další strana
Jak lze společenstva popsat / parametrizovat ?
• PARAMETRIZACE (měřitelné veličiny)
• Působení stresorů  změny v měřitelných parametrech
• Základní popis - parametry strukturní
• (Parametry funkční – viz dále: ekosystémová úroveň)
• Bohatá struktura (bohatost vztahů / biodiverzita)
 podmínka stability biocenozy i ekosystému
EKOTOXIKOLOGIE SPOLEČENSTEV
- struktura Strukturní
parametry
– parametry faunistické/floristické (druhové složení a zastoupení)
– prostorové a časové cykly
– vztahy ve společenstvu / společenstvo - prostředí
• Množství a abundance
– počty jedinců
– biomasa
– chlorofyl-a
– pokryvnost
– parametry vztažené na plochu (terestr.) a objem (akvat.)
EKOTOXIKOLOGIE SPOLEČENSTEV
- struktura Charakterizace
DIVERZITY
• INDEXY
– Shannon-Wiener (H´ = - Ni/N ln (Ni/N) )
– Vyšší H´  vyšší diverzita
– Shannonův index vyrovnanosti (evenness)
(E = H´ / lnS)
– Vyšší E  vyšší vyrovnanost společenstva
– Margalefův index (D = (S-1) / lnN )
– ... a celá řada dalších indexů
• Poznámka: indexy jsou necitlivé na změny ve vzácných
druzích … málo jedinců  malý vliv na celkový index
Ni – počet jedinců jednoho druhu
N – celkový počet jedinců společenstva
S – počet druhů
KLÍČOVÉ DRUHY (Key / Keystone species)
• efekty na těchto druzích
 dramatické změny celé biocenózy
• Klíčové druhy
• zpravidla „predátoři“ (kontrola spodních pater)
• Př. Mořské hvězdice na skalách a kamenech
 pohyb a spásání biomasy / predátor
• Likvidace hvězdic
 přerůstání makrořas
 přemnožení mlžů (slávky)
• Př. Sladkovodní ryby ovlivňují fertilitu rostlin v terestrickém
ekosystému
Knight et al., NATURE (2005) 437: 880
• INDIKÁTOROVÉ DRUHY
• Druhy, jejichž (ne)přítomnost indikuje určitou vlastnost ekosystému
• citlivé druhy (např. pošvatky, horské ploštěnky, lišejníky)
• oportunní druhy (např. pakomáři, pijavky ...)
• Různé organismy indikují různé typy stresu
• Př. kontaminace živinami (dusičnany apod.)
• Makrozoobentos – saprobita / řasy, rozsivky – trofie (viz dále)
• Kontaminace toxickými látkami
• Lišejníky – čistota vzduchu
KLÍČOVÉ DRUHY (Key / Keystone species)
Příklady účinků a jejich vlivu na vztahy ve společenstvu (predátor - kořist)
- působení insekticidů ve vodním prostředí
 eradikace populací hmyzu (komáři)
 likvidace zdroje potravy pro dravé ryby
 hmyz - rychlé rozmnožování - návrat
 ryby - pomalé množení = dlouhodobý efekt
- likvidace terminálních predátorů (bioakumulace tox. látek)
 vyhubení vlků v severní Americe
 přemnožení jelenů
 neřízené spásání vegetace luk a lesů
 vyhubení dravců (DDT)
 přemnožení hlodavců
 neřízené spásání úrody na polích
Působení toxických látek  změny ekologických vztahů
Ekosystém
• Heterogennní systém složený z biotické složky (biocenozy,
biologický subsystém) a abiotické složky (ekotopu,
subsystém prostředí)
• Biota vs. prostředí – vztahy / zákonitosti
• Klíčová zákonitost v ekosystémech z pohledu studia
ekotoxikologie–
„Zákonitost určujících abiotických faktorů (ekologická
valence)“
EKOSYSTÉMY a účinky toxických látek
V ekosystémech lze sledovat (na rozdíl od manipulovaných
biotestů) pouze retrospektivní efekty
Posouzení vlivu na úrovni ekosystému
- zpravidla nelze hodnotit vztahy dávka – odpověď:
efekty mají kategoriální charakter (STRES +/-, EFEKT +/-)
- Při charakterizaci poškození je nutné vždy zajistit srovnání s
"normálními" hodnotami.
? existuje normální stav nebo vývoj ekosystému ?
Definice „Normálního stavu ekosystému“ není jednoduchá
• STACIONÁRNÍ STAV
– klidový stav, dlouhodobě ustálené hodnoty,
– není běžný: ekosystémy jsou přirozeně „variabilní“ (hodnoty se
dynamicky mění)
• STABILNÍ STAV
– stav, kdy okolní podmínky nemění podstatu věci (uvnitř může
docházet ke změnám/kolísání hodnot)
• DYNAMICKÁ stabilita / rovnováha: HOMEOSTÁZA
– stav, kdy se prostřednictvím AKCE/REAKCE udržuje dlouhodobě
stabilní stav
• ! SUKCESE
– ekosystémy nejsou nikdy „stacionární“ – prochází v čase vývojem:
– Cílem by měla být ochrana „plynutí“ – udržování HOMEORHÉZY
SUKCESE EKOSYSTÉMU
Sukcese je zákonitý sled změn druhového složení, který
vyúsťuje v náhradu jednoho ekosystému druhým
- změna prostředí ekotopu rozhoduje zda, kdy a jak rychle
sukcese probíhá, ALE samotný průběh je ovládán biocenozou
- sukcese končí ustáleným ekosystémem (klimax), v němž je na
jednotku dosažitelného toku energie produkováno nejvíce
biomasy a nejvíce symbiotických vztahů mezi organismy
(v klimaxu diverzita opět klesá)
Vypracovány a standardizovány komplexní postupy testování
- simulace přírodních podmínek
- model ekologických vztahů mezi organismy (potravní řetězce)
- hodnocení nepřímých efektů
(likvidace producentů  další efekty v ekosystému)
Experimentální uspořádání
- podle velikosti (řada překryů / nejednoznačné hranice)
: mikrokosmy voda - do 1 m3 stojaté, nebo 1 m tekoucí
půda – experimenty s půdním jádrem
: mezokosmy „větší než“ mikrokosmy
- rozdělení podle uspořádání
- laboratorní kontrolované podmínky
- přírodní podmínky
Vícedruhové hodnocení ekotoxicity
Existují i standardizovaná doporučení:
- mikrokosmy i mezokosmy
- využívána nejčastěji při hodnocení rizik pesticidů (prostředky na ochranu rostlin)
• US EPA Test Guidelines OPPTS 850.1900 Generic Freshwater Microcosm Test, Laboratory
• OECD – draft dokumenty
Postupy však obsahují spíše obecné požadavky
- aklimatizace a příprava systému
- obecné podmínky pro velikost
- složení a počty organismů
Každý výsledek z podobných studií je cenný
- doposud relativně málo dostupných dat (ve srovnání s "klasickými biotesty")
- ekonomicky i časově náročnější experimenty
- realizace a interpretace vyžaduje kvalitní ekologické vzdělání
- výsledky často nejsou veřejně dostupné (vlastnictví firem, které registrují pesticidy)
Stále jen „model“ – řada nedostatků
- Izolace od okolí (zamezení případné „rekolonizaci“)
- Vnější stěny (mikrokosmy) – rychlé střídání teplot (vs. Přírodní nádrže: stabilní) atd.
Standardizace mikro- a mezokosmových studií
Expensive & time consuming (e.g. Pesticide testing)
Variable results (natural variability …)
Higher ecological relevancy
Micro & Mesocosms
Příklad – laboratorní terestrický mikrokosmos
Příklad – akvatické mezokosmy
HODNOCENÉ PARAMETRY
- hodnocení v rámci jednotlivých druhů
- mortalita, růst
- reprodukce
- populační charakteristiky
- hodnocení společenstva – ekologické efekty
- strukturní parametry: taxonomie, indexy atd.
(v praxi jsou hodnoceny častěji než funkční p.)
- funkční parametry
zásoby – živiny, energie
procesy – produkce, respirace ...
Vyhodnocení výsledků mikro / mesokosmů
FUNKČNÍ PARAMETRY EKOSYSTÉMŮ
1) Zdroje a pohyb živin / energie
(autochtonní – vnitřní / allochtonní – externí)
• přenos energie = potravní sítě
– pastevně kořistnický / parazitický / dekompoziční
– producenti  konzumenti  destruenti/dekompozitoři
2) Procesy v ekosystémech
• Produkce Primární: CO2 + H2O + hv  (CH2O) + O2
Sekundární produkce (v potravním řetězci
• Respirace / dekompozice
Metriky sledování procesů:
balance / výměny koncentrací plynů - O2, CO2, NOy atd.
3) Resilience / Elasticita
• jednotka [1/ time unit]
• kapacita překonat stres & čas nutný k překonání stresu
– vyšší: rychle rostoucí a rozmnožující se druhy (phytoplankton)
– nižší: delší generační doba (bentické organismy, ryby)
Terénní studie
• Mohou identifikovat, které ekologické účinky se skutečně ději na dané
lokalitě
• Metody používané v terénních studiích mohou zahrnovat sběr
organismů, měřeni fyzikálních vlastnosti habitatů nebo také dálkový
průzkum
– Sběr organismů, měření fyzikálních vlastností, dálkový průzkum
• Data terénních studii obsahují:
– druhovou bohatost, diversitu, indexy podobnosti, biomasu, přítomnost
tolerantních a citlivých druhů, populační strukturu atd.
Hodnocení ekosystému
- charakterizace abiotických a biotických složek
- specifika akvatických a terestrických ekosystémů
Možnosti studia účinků v ekosystémech
- polní studie, biomonitoring
Akvatické ekosystémy Terestrické ekosystémy
Charakteristiky (parametry)
strukturní parametry - druhové složení, počty, abundance
funkční parametry - toky energií a látek
Možnosti hodnocení působení stresu
! Pro posouzení stresu je nutné srovnání s "kontrolou"
(1) srovnání "před a po" působení stresu
kontrola = stav ekosystému před působením
- předpokládá monitoring před působením stresu (sledování stavu
abiotické a biotické složky ekosystému)
- známe pozaďové hodnoty a "přirozený" stav
(2) srovnání exponovaného ekosystému s jiným
nezasaženým ("kontrolním") ekosystémem
klíčový je výběr kontrolního ekosystému:
- oba ekosystémy mají srovnatelné vlastnosti abiotické (terén, geologie,
nadmořská výška ...)
- za normálního stavu se předpokládají podobné biologické vlastnosti (tj.
shodná společenstva, potravní vztahy ...)
- Odvození závěrů je v tomto případě vždy složité (neexistují dva stejné /
stejně se vyvíjející ekosystémy)
Polní studie, biomonitoring
Polní studie, biomonitoring
Praktický postup při polní studii / biomonitoringu
(1) charakterizace lokality, průzkum přímo v terénu
(2) definice hodnocených parametrů příslušného ekosystému ve vztahu k
působení stresu
abiotické složky
- ve kterých složkách (voda, sediment, půda, vzduch) působí/il stresor ?
- kde lze předpokládat rezidua toxických látek ?
- biotické složky
definice organismů, které budou sledovány pro posouzení působení stresu:
- vztah k působení stresu (př. planktonní organismy – látky s tendencí zůstávat ve vodním
sloupci, tj. hydrofilní vs. sedimenty-hydrofobní)
- hodnocené skupiny (př. producenti – řasy; konzumenti – zooplankton, ryby; destruenti –
planktonní bakterie)
- klíčové druhy, bioindikátory ...
- parametry hodnocení
- strukturní (taxonomické parametry, biomasa, abundance ...)
- funkční (produkce/respirace, potravní řetězce ...)
Polní studie, biomonitoring
(3) definice odběrů (vzorkování, četnost, počty)
abiotických složek (voda, sedimenty, půda, vzduch)
biotických složek (producenti – konzumenti –
destruenti)
(4) realizace odběrů / analýzy / hodnocení
(5) srovnání EXPOZICE vs. KONTROLA, závěry