C6200-Biochemické metody 08C_elektronová spektra molekul Petr Zbořil Elektronová spektra molekul 325px-Franck-Condon-diagram.png Velké množství možných přechodů Franck-Condonův princip = elektronové přechody rychlé = hmotné jádro, pomalé Nemění se geometrie Jablonskiho diagramy Příspěvky vibrací a rotací v molekule vibrace Resonanční podmínka DE = hn DE = DEel + DEvib + DErot – velké množství možností Poloha pásu – l = f(DE), výška – pravděpodobnost přechodu Pásová spektra molekul franck-condon_absorption_spectra2.png Typy přechodů prechody1 p s n Posice pásu – D E = hc/l Energie přechodů s s* příklad C-H: vysoké energie, odpovídá 125 nm n p* e = 10 – 100 L.mol-1cm-1 p p* e = 1000- 104 L.mol-1cm-1 nejobvyklejší případ, energie odpovídá 200 – 700 nm n s* méně časté, energie odpovídá 150 – 250 nm Charge transfer přechody – anorganické komplexy, interakce mezi elektron. donorem a akceptorem – vysoký mol. abs. koeficient prechody1 Konjugované systémy – štěpení hladin MO Compound name Condensed formula Wavelength absorbed Ethene, ethylene CH2::CH2 171 nm 1,3-butadiene CH2::CHCH::CH2 217 nm Trans 1,3,5-hexatriene CH2::CHCH::CHCH::CH2 274 nm b-carotene see structure below 425 nm Gaussovský tvar absorbční křivky •Četnost přechodů – velikost absorbce ≈ pravděpodobnost •Aditivita – různé chromofory (formy) ve vzorku • • Chromofory •Skupiny odpovědné za absorpci záření –Přítomné elektrony – orbitaly – přechody –Poloha (l) a výška maxima absorpčního pásu •Relativita pojmu –Více chromoforů v molekule –Makromolekuly – bílkoviny mají více možností •Další vlivy – auxochromy –Skupiny ovlivňující polohu (l) a výšku maxima absorpčního pásu – Auxochromy •Skupiny posouvající λ maxima –Bathochromní efekt – tzv. „červený posun“ –Hypsochromní efekt – tzv. „modrý posun“ •Skupiny posouvající výšku maximální absorpce –Hyperchromní efekt – zvýšení maxima –Hypsochromní efekt – snížení maxima •Analogické názvy pro efekty vyvolené změnami prostředí apod. – Biochemicky významné chromofory chromofory1 Ovlivnění spekter •Vnitřní vlivy – elektronová struktura –Oxidoredukce –Acidobazické děje • •Vnější vlivy –Interakce s prostředím – polarita, ionty RESPIRACE-ETC+Fp-UQ Spektra UQ • Ultraviolet absorption spectra of (a) 2-octaprenyl-3-methyl-6-methoxy-1,4-benzoquinone and (b) ubiquinone in ethanol, before and after reduction with sodium borohydride. Solid line, quinone; broken line, quinol RC-NAD-k20o20 Vliv polarity na absorpční maximum n p* modrý posun v polárním prostředí Zvýšená solvatace n páru snižuje energii n orbitalu p p* červený posun v polárním prostředí Zvýšená solvatace excitovaného stavu snižuje jeho energii Význam spektrofotometrie •Stanovení koncentrace látek •Stanovení změn koncentrace v čase •Kvantifikace F- světelný tok Fa F0 - prošlé a přicházející světlo • též I a I0 Lamber-Beerův zákon A = e . c . b beeranim Využití pro kvantitativní analýzu: 1)Při znalosti e: c = A/e.d 2)Kalibrační přímka c A Kvantitativní parametry •I0 a I - paprsek prošlý referenčním vzorkem (blankem) a vzorkem měrným •100.I/I0 = T (%), transmitance •A = - log T = log I0/I •Pro 50% T, I0/I = 2 •A = 0,3 – nejpřesnější •Spolehlivý rozsah A – 0,2 – 0,7 • • Instrumentace • • • • • • • •Hlavní součásti jednoduchého přístroje Instrumentace • • • • • • • •Blokové schema spektrofotometru Instrumentace •Obecné použití –Víceúčelové –Speciální varianty v jednotlivých částech obecného schematu – viz dále •Speciální užití –Jednoúčelové – denzitometry, scanery apod. –Detektory – součásti jiných zařízení –Variace na obecné schema Instrumentace •Přístroje jednodušší –Kolorimetry, fotometry –Filtry, detektory - vizuální •Kvalitnější – spektrofotometry –Monochromátory složitější –Světlovodná vlákna – citlivost, eliminace rozptylu –Parametry kvality – viz dále –Speciální vybavení a konstrukce (seriová měření – průtokové kyvety, destičky apod.) Zdroje deuterium Rozsah a intenzita emitovaného záření vyzařovací charakteristika volba zdroje Rtuťová výbojka – UV spektrum Halogenová žárovka – viditelné spektrum Laser – monochromatické LED Deuteriová lampa – UV spektrum xenon Xenonová výbojka – UV + viditelné spektrum deuterium mercury Rtuťová výbojka xenon lamp Xenonová výbojka Monochromátory •Filtry – kvalita (barevné x interferenční) •Hranol – lom světla l1> l2 Monochromátory •Mřížka – disperze nl = CD – AB nl = d(sina-sinb) Vzorek •Obecné – standartní kyvety –Variace – Thunbergovy, Dewarovy apod. •Speciální –Průtokové kyvety –Destičky – vícekanálové –Štěrbiny – mikroobjemy • • Spektrofotometrické kyvety kyvplast kyvtransp semikyv kyv1 kyv plastkyv Spektrofotometrické kyvety •A •a Rozpouštědla rozpouštědla Detektory fotonasobic Fotonásobič fotokatoda Fotometr s diodovým polem fmDiodarray diodarray2 Charakteristiky přístroje rozlišení1 Spektrální rozlišení – schopnost rozlišit dvě těsně přilehlé vlnové délky Rozlišení x rozlišovací schopnost – nepřímé S = 0,8xSmax – pro určitou Dl = rozlišení Charakteristiky přístroje Spektrální šířka přístroje – šířka pásu světla opouštějícího monochromátor měřená v polovině výšky píku (SBW), závisí na šířce štěrbin a disperzi mřížky, Obvykle < 2 nm Přirozená šířka pásu vzorku - šířka absorpčního pásu vzorku měřená v polovině výšky píku (NBW) – ovlivněno SBW – monochromatičnost rozlišení2 Charakteristiky přístroje pás Přesnost měření závisí na poměru SBW/NBW = 0.1 a menší (přesnost 99.5%) SBW 2 nm postačuje pro NBW 20 nm Chyba měření • • • • • • • • •Chyba DA/A – limit šumu a rozptylu Praktické aplikace •Stanovení koncentrací látek –Obecně – bílkoviny, NK –Speciálně – Hb, cytochromy •Stanovení forem látek –Ox-red – titrace, Em, disociační stavy - pKa •Určení změny koncentrace –Rychlost reakcí – enzymové (NAD+, umělé) •Detektor pro jiné metody – spřažené Stanovení bílkovin Absorpce v UV oblasti (Tyr, Try) – 280 nm Citlivost 50 μg Velmi rychlá metoda, nedestruktivní Interference: ruší NK, zákal C (mg/ml) = f(A280) C (mg/ml) = A280/e C (mg/ml) = 1,55.A280 – 0,76 A260 e (ml/mg) BSA = 0,63 Ig = 1,38 Ovalbumin = 0,70 Stanovení bílkovin biuret2 Biuretová metoda Citlivost 1-20 mg Interference: některé aminokyseliny, zwiterionty Lowryho metoda (595 nm) Citlivost 10 μg Zdlouhavost (2kroky) Interference: ruší sulfát amonný, glycin, SH reagenty, EDTA > 0.1 mM Stanovení bílkovin bicinchon1 Bicinchoninát Redukce Cu2+, pak komplex Citlivost vysoká 1 ug Pracná metoda – 2 kroky Interference: ruší EDTA, SH reagenty 562 nm Stanovení bílkovin coomasai1 Metoda podle Brafordové Citlivost vysoká 1 ug Rychlá metoda (náročná na pečlivost) Interference: ruší Triton X-100, SDS, Silně bazické pufry Posun maxima Ze 465 na 595 nm Enzymové reakce •Přirozené chromofory –Především oxidoredukce - NAD+, cytochromy •Umělé chromofory –Oxidoreduktasy – barviva (PMS, tetrazolia) –Hydrolasy – estery, amidy •Derivatizace produktů –Ketokyseliny + dinitrofenylhydrazin • • • Oxidoreduktasy •PMS – DCIP • Oxidoreduktasy •MTT test –Viabilita a metabolická aktivita buněk –Produkt redukce cytosolickým NAD(P)H MTT test •Mikrotitrační destička • Oxidoreduktasy •Indikační reakce Chromogenní substráty •Fosfatasy • • • • • • • • • Chromogenní substráty • •Glykosidasy • • • • • • Použití spektroskopie pro studium konformace bílkovin A nm Fluorescence Try, Tyr – 280 nm Závislost spektra na polaritě prostředí – zde polární Použití spektroskopie pro studium konformace bílkovin A nm Fluorescence Try, Tyr – 280 nm Závislost spektra na polaritě prostředí (červený posun v nepolárním prostředí) Perturbační spektra Problém rozlišení malých změn na silném pozadí Dvoupaprsková fotometrie (double-beam) •Problém koherentního paprsku •Štěpení časové – prostorové •Současné měření referentního a měrného paprsku –Možnost porovnání – diference •Náhrada počitačovým zpracováním •Dual-wavelength –dva monochromátory –jeden vzorek • Dvoupaprskový fotometr (double-beam) doubleBeam Diferenční spektroskopie A nm Diferenční spektroskopie A nm Diferenční spektroskopie A nm A nm DA nm Diferenční spektrum 1 2 2-1 Použití spektroskopie pro studium konformace bílkovin diference a – Try b – Tyr c - Phe voda DMSO A – Absorpční spektrum B – diferenční spektrum Derivace spekter • • • • • • • • Multikomponentní analýza •Překryv pásů – aditivní charakter A •Obálka jemných linií A = A(λ1) – A(λ2)