C6200-Biochemické metody 09_luminiscenČní metody Petr Zbořil Luminiscenční pochody •Emise záření –Přechod elektronů z excitovaného stavu do základního •Způsob dosažení excitovaného stavu (elektronu či atomu – ionty a radikály) –Absorpcí fotonu – fotoluminiscence •Fluorescence, fosforescence – UV, VIS •Radioluminiscence – scintilátory, fosforescence •XRF – RTG fluorescence –Chemickou reakcí – chemiluminiscence •Včetně biochemických - bioluminiscence –Radioaktivním rozpadem (excitace jádra) Fluorescence a fosforescence excitace1 k1 k4 k5 k4 k3 A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k2 k3 k4 A hn hn hn Fluorescence a fosforescence excitace Základní pojmy Excitace a emise emise Interakce s rozpouštědlem Singletový excitovaný stav Singletový základní stav Základní pojmy Stockesův posun – ztráty energie po dobu excitovaného stavu nm Dl F Absorpce Emise Základní pojmy 2 l3 l2 l1 Základní pojmy Kvantový výtěžek fluorescence F = počet kvant emitovaných/počet kvant absorbovaných F F = ke/(ke + S kk) ke = rychlost emise kk = rychlost konverzních procesů Intenzita fluorescence látky = f (e, F, N) Základní pojmy Doba života excitovaného stavu Doba potřebná k poklesu fluorescence na hodnotu 1/e I0 Střední doba života t If = I0 e – t/ t ln (I0/If) = t/t lifetime Přirozená doba života to Definovaná pro F = 1 ∞ t0 = 2,88.10-9.n2.nA2 . ∫ e(n)dn 0 n- refrakční index rozpouštědla e – molární abs. koeficient n – vlnočet abs. maxima A n Základní pojmy Střední doba života fluorescence Fluorescein 4,6 ns Chininsulfát 15 – 40 ns NADH 0,5 ns F = t/t0 Biochemicky významné fluorofory fluorofory Instrumentace schémaflu Instrumentace mercury xenon lamp Zdroj: Xenonová lampa – O3! Rtuťová výbojka Laser Světelné diody - LED (430, 450, 505, 592, 612 a 637 nm) lasery_a_barviva Instrumentace bandpass Monochromátor - mřížka - filtry shorpass Variace přístrojů •Základní typ •Scintilační – čítač fotonů •Časosběrné (time-resolved) •Polarizační •Destičkové – seriová měření •Vybavení světlovodnými vlákny •Cytometry •Fluorescenční mikroskopie •Další speciální – oximetry Instrumentace Shimadzu RF-5301PC – spektrofluorimetr Shimadzu Instrumentace schemafluo Instrumentace Měření střední doby života fluorescence mereni_lifetime Podmínky fluorescence Fenolftalein Fluorescein Struktura Vliv okolí fluoroforu •Vliv polarity •Emisní spektra aduktu badanu (B6057 - 6-Bromoacetyl-2-dimethylaminonaftalen) s 2-merkaptoetanolem •1) toluen •2) chloroform •3) acetonitril •4) etanol •5) metanol •6) voda • Vliv okolí fluoroforu •Vliv polarity •Emisní spektra derivátu g •v cyklohexan-isopropanol Vliv okolí fluoroforu •Vliv polarity •Spektra PRODANu v rozpouštědlech a v cyklodextrinu http://www.odinity.com/hostguest-complexes-containing cyclodextrins-dyes/ Vliv okolí fluoroforu Závislost fluorescence na teplotě (viskositě) 20 40 °C F 80 40 Podmínky fluorescence Stabilita fluorescenčního signálu chininsulfátu 40 80 min F 80 40 Podmínky fluorescence 1 Rayleighův rozptyl (Tyndalův rozptyl) 2 Fluorescenční emise 3 Ramanův rozptyl 1 3 2 Excitace 450 nm Emisní spektrum 450 nm 600 nm 3 Aplikace •Stanovení koncentrací a změn – rychlost •Proteinová dynamika a denaturace •Rychlá solvatační kinetika •Dynamika skládání bílkovin •Struktura a flexibilita membrán •Vazba antigen-protilátka, cytologie •Fluorescenční mikroskopie •Selektivní detekce u chromatografie a elektroforesy •Detekce při sekvenaci DNA, RT PCR •FISH •Stanovení Ca2+ a Mg2+ nebo H2O2 uvnitř buněk a organel •Měření membránových potenciálů • Kvantitativní fluorimetrie Závislost intenzity fluorescence na koncentraci látky F = f (I, e, c, F) F = I0 F [1 – 10-ecd] jestliže c ® 0 F = I0 F.2,3.ed.c F c Kvantitativní fluorimetrie aminy Stanovení koncentrace aminokyselin 20.000 Kč/g 390/464 nm (395/475) 340/455 nm 2,3-Naphthalenedicarboxaldehyde | 3-(4-carboxybenzoyl)quinoline- 2-carboxaldehyde 450/550 nm Kvantitativní fluorimetrie CBCQA-protein Stanovení bílkovin CBCQA - 3-(4-carboxybenzoyl)quinoline-2-carboxaldehyde CBCQA Kvantitativní fluorimetrie Detekce bílkovin v gelu (barevně: Coomasie blue, stříbrné barvení) Fluorimetricky: SYPRO Orange (Molecular probes) – citlivost 1 – 2 ng Kvantitativní fluorimetrie ethidium Detekce nukleových kyselin Ethidium bromid – ds DNA SYBR Green – (ss DNA), RNA detekceDNA rRNA 16 a 23s barvená SYBR Green II Molecular Probes Kvantitativní fluorimetrie SYBR green I – asymetrické cyaninové Barvivo Interkaluje přednostně do ds DNA, méně ss DNA , nejméně RNA Absorbuje modré λmax = 497 nm emituje zelené λmax = 520 nm Kvantitativní fluorimetrie Detekce bílkovin SYPRO Orange Fluorogenní substráty galaktosidasy galatosidasy1 Galaktosidasy 4-methylumbelliferyl-a-galaktosid Fluorescein-digalaktosid Fluorogenní substráty peroxidase resorufin Peroxidasy – amplex red, vznik resorufinu Fluorogenní substráty peptidasy1 Proteinasy, peptidasy 1)Fluorescenční konjugáty proteinů a peptidů 2) peptidasy Fluorogenní substráty PLA Fosfolipasa A Fluorogenní substráty Barvení bílkovin – horní část – Sypro Tangerine Produkty reakce s fluorogenním substrátem b-glukuronidasy ELF 97 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí Přirozené fluorofory (Tyr, Try) – fluorescence závislá na polaritě prostředí obklopující fluorofor H2O H2O F nm Emisní spektrum Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí t (min) F310 substrát > Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí fluosceinspek fluopH Fluorescenční konjugáty Karboxyfluorescein – (494/520 nm) Absorpce/emise fluoresceinu při pH 9 CF OG CF-karboxyfluorescein OG oregon green oregongreen Oregon Green - (496/524 nm) karoxyfluo Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí tetrametrhod tetrametrhodspek kumarrin Fluorescenční konjugáty Teramethylrhodamin – 545/580 nm) kumarinspek Kumariny – 350/450 nm) Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí dansyl dansylspek benzoxadiazol Fluorescenční konjugáty bezoxadiazolspek Dansyl Benzoxadiazol –N-sukcinimid Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí konjugace Fluorescenční konjugáty konjug Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí •Termický posun – DSF –Stabilita – mutanti, úpravy, ligandy … PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit Fluorescenční sondy • • • • • • •ANS – 1,8-anilinonaftalensulfonát • Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí Interakce makromolekul s ligandy polarita F koncentrace makromolekuly Ligand volný Ligand vázaný L + M « LM Kd = Lf.Mf/LM Použití fluorimetrie ke sledování vazby F = Ff + Fb F = [Lf] .Ff + [Lb].Fb F = ([Lt] - [Lb]) Ff + [Lb].Fb F = [Lt].Ff – [Lb].Ff + [Lb].Fb F = Fo + [Lb].(Fb – Ff) [Lb] = (F – Fo)/ (Fb – Ff) Ff, Fb – fluorescence volné, vázané frakce Fb, Ff –kvant. Výtěžek fluorescence vázaného, volného ligandu [Lb], [Lf] – koncentrace vázaného, volného ligandu [Lt] – celková koncentrace ligandu F – celková fluorescence Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí parinar AOC16 Interakce makromolekul s ligandy Použití fluorescenčních analogů FluorescPL Kys. cis-parinarová Anthroyloxypalmitát Fluorescein-PE Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí Použití značené makromolekuly Fluorescence značené bílkoviny F Koncentrace ligandu Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí •Fosforylace proteinů • • • • •Vliv chelatace – rigidnější struktura Fluorescence a cytochemie • • • • • • • •Značení bílkovin, protilátek •Značení nukleotidů, primerů Fluoreskující proteiny •GFP 395 (475) – 509 nm o oAequorea victoria i jiné o238 AA oFluorofor reakcí 3 AA oLokalizace proteinů oReportér (exprimovaný gen) oMutanty – změna barvy o– YFP (T203Y), CFP (Y66W) – Přenos energie •Energie excitovaného stavu –Vyzáření většiny, disipace menší části –Disipace větší části – vyzáří málo ev. nic –Odevzdání sousední molekule nefluoreskující •Zhášení (quenching – Q) –Jiná látka – zhášedlo (quencher) – I, O2, –Identická molekula – samo(auto)zhášení (selfquenching) –Odevzdání sousední molekule (skupině) fluoreskující, ta pak emituje vlastní záření (jiná l) •FRET – • • Využití zhášení •Stanovení enzymové aktivity Fluorescenční rezonanční transfer energie (Försterův přenos) transfer2 Nezářivý přenos energie z donoru na akceptor (1 – 10 nm) Fluorescenční rezonanční transfer energie schematrans F nm DONOR A F Fluorescenční rezonanční transfer energie schematrans F nm DONOR A F AKCEPTOR Fluorescenční rezonanční transfer energie F nm A Fo F Donor h = 1 – F/Fo Fluorescenční rezonanční transfer energie transfer1 h= Ro6/(Ro6 + R6) Ro6 = 1,66.10-33.t.J/n2n2 t – doba života exc. stavu J – překryvový integrál n – refraktivní index rozpuštědla n – vlnočet emise donoru 7 Fluorescenční rezonanční transfer energie Použití – změření vzdálenosti mezi dvěma molekulami v bílkovině Tryptofan (290/340) vs. NADH (340/450 nm) • Fluorescenční rezonanční transfer energie prikladtransfer2 Hybridizační sondy Fluorescenční in situ hybridizace – FISH Hybridizační sondy Molekulové majáky Hybridizační sondy Dynamika membrán •Fluorescence recovery after photobleaching Dynamika membrán • • • • • • •FRAP –Rychlost – průběh obnovení –Výtěžek (recovery) Fluorescenční anizotropie polar_princip Fluorescenční anizotropie polarf Polarizační filtry Fluorescenční anizotropie polar2 Fluorescenční anizotropie polarizace Fluorescenční anizotropie Rotační relaxační čas Fluorescenční anizotropie r = Iv – Ih Iv + 2Ih ro/r = 1 + 3t/r t, střední doba života fluorescence r, rotační relaxační čas molekuly ro – anizotropie nepohyblivé molekuly r = Vh/RT V objem h viskozita ro/r = 1 + 3tRT/Vh ro = (3 cos2a -1)/5 a excitace Polarizace fluorescence p = Ih – Iv Ih + Iv Fluorescenční anizotropie Využití: Interakce makromolekuly s ligandem - bílkovina, NA, membrána E – S (K, I), Ag – Ab, hormon – receptor F mg makromolekuly r polarizace Fluorescenční anizotropie Využití: Měření viskozity prostředí ro/r = 1 + 3tRT/Vh ro/r = 1 + K/h h = 2,4r/(0,362 – r) r 20 30 40 50 °C Fl. anizotropie DPHT Vázaného v liposomech DPPC Fosforescence excitace1 k1 k4 k5 k4 k3 A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k2 k3 k4 A hn hn hn singlet Multiplicita M = 2S + 1 Fosforescence fosfo1 Střední doba života t 10-4 – 100 s tryptofan Fosforescence Kvantový výtěžek fosforescence FP = k3/(k3 + k2 + k4) Ff = k2/(k3 + k2 + k4) Ff/ FP = k2/k3 k1 k4 k5 k4 k3 A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k2 k3 k4 A hn hn hn F 100 200 300 °K fluorescence fosforescence Fosforescence schémaflu Experimentální uspořádání Fosforescence N2 Vzorek Rozpouštědla rigidní skla bez krystalů (ethanol, metanol, voda:ethylenglykol., atd Fosforescence Aplikace fosforescence fosf_latky Fosforescence fosfatasa Fosforescence alkalické fosfatasy 3 Try, pouze Try 109 fosforeskuje 1 – nativní enzym 2 – enzym po odstranění Zn 1 2 Chemiluminiscence •Při reakci musí vznikat dostatek energie, aby došlo k excitaci elektronů. Proto musí být reakce exotermní a obvykle je to oxidace. •Energie se využije pro excitaci elektronů, uvolní-li se jako teplo chemiluminiscence se neobjevuje. •Excitovaný produkt musí být schopný ztrácet svoji energii buď ve formě fotonu, nebo ji převádět na fluoreskující sloučeniny. Přímá emise fotonu z excitovaného produktu obvykle poskytuje krátké záblesky světla, zatímco transfer energie na fluoreskující sloučeniny se většinou projevuje jako dlouhodobá (v minutách) světelná emise. • Chemiluminiscence •Přístrojové vybavení: •od jednoduchých luminometrů až po vysoce automatizované chemiluminiscenční analyzátory, ve kterých se provádí imunochemické reakce s chemiluminiscenční detekcí. •Standardní luminometry se do určité míry podobají fluorimetrům. Před měřicí kyvetou ovšem nemají žádný zdroj světla ani filtr. Uspořádání za kyvetou odpovídá fluorimetrům (filtr, fotonásobič). Téměř všechny luminometry mají také nastřikovací zařízení, protože u zábleskové chemiluminiscence je nutné provést měření ihned po nástřiku reagencií. Některé luminometry měří luminiscenci v mikrotitračních destičkách. Chemiluminiscence •Jednoduchý luminometr • Chemiluminiscence •Luminometr na destičky • Chemiluminiscence Chemiluminiscence luminol luminol1 Luminol luminol2 Chemiluminiscence Luciferin světlušky luciferin Chemiluminiscence Chemiluminiscence Aequorin – Aequorea victoria Aequorin – chemiluminiscence - fuze s GFP – fluorescence aequorea Chemiluminiscence celenter Aequorin – Aequoria victoria Prostetická skupina - typ luciferinu aequor_coeln Chemiluminiscence aeq_spek Aequorin – Aequoria victoria aequo_anim Průnik vápníku do mitochondrií Aktivuje oxidaci