C6200-Biochemické metody 10A1_IR spektroskopie Petr Zbořil IR spektroskopie vibr Excitace vibračních a rotačních přechodů vibr2 Valenční vibrace Deformační vibrace n d IR spektroskopie N atomů = 3N stupňů volnosti Vibrační modus: molekulární pohyb, ve kterém atomy vibrují ve fázi se stejnou frekvencí Lineární molekuly: 3N -5 modů (odečet rotace) Nelineární molekuly 3N – 6 modů IR spektroskopie Podmínka viditelnosti absorpce v IR spektru – vibrace musí být provázena změnou dipólového momentu (např. asymetrické vibrace) (Elmg. záření je oscilující dipolový moment) dipol Podmínky viditelnosti IR •Absorpce záření jen u molekul s dipolmomentem, který se mění absorbcí kvant •Vektor el. pole vibrující molekuly se periodicky mění – absorbce záření s nímž je v resonanci: • ν = 1/2π . √ k/μ Hookův zákon •silová konstanta / redukovaná hmotnost •k = f(typu vazby) C-C ... 0,5 kNm-1, C=C ... 0,95, C≡C ... 1,5 •μ = m1.m2 / (m1 + m2) •Ev = k/2 (r-r0)2 = (v + ½) . h ν0 (aplik. Sch. rovnice) •Ev+1 = k/2 (r1-r0)2 = (v + ½) . h ν0 •∆ E = h ν = Ev+1 - Ev = h ν0 •Neaktivní •Neaktivní molekuly – jednoatomové •symetrické nepolární (H2, N2, O2 ...) •mající symetrické valenční vibrace (CO2) • • Podmínky viditelnosti IR • •Oblasti spektra – –fingerprint – 900 – 1300 cm-1 –charakteristické pásy vazeb – 1300 – 3700 • • • • • • •Vlivy –skupenství – νg › νl › νs (s – vhodné na určení struktury, ne změny) –vodíkové vazby – rostou dipolární interakce –konjugace – menší ν –isotopová záměna ν = f(1/μ) – D za H apod. IR spektroskopie E = hn Vlnočet = cm-1 Blízká 0.78 - 2.5 mm 12800 – 4000 cm-1 Střední 2.5 – 50 mm 4000 – 200 cm-1 Vzdálená 50 -1000 mm 200 – 10 cm-1 X – H 3600 – 2700 X=Y 2700 – 1900 X=Y 1900 – 1500 X-Y 1500 - 500 nbar = 1/2p (kAB/mAB)1/2 kde mAB = MAMB/(MA + MB) Kde k je silová konstanta, MA, MB hmotnosti atomů, n vlnočet A B IR spektroskopie IR spektroskopie Typické IR spektrum typspektra Příklady vibrací cm-1 n OH (alkohol) 3300-3700 n NH2(amin) 3200-3500 n SH (thioly) 2500-2600 d HOH (voda) 1550-1650 biopolymery n SH (cystein) 2600-2700 n NH2 (amidy) 3200-3400 n C=O (Asp, Glu) 1710-1720 n COO- 1410-1570 n C-N 1625 n NH3+ 1670 d jádro (Tyr) 1515 n NH (Trp) 3400 n O-PO (fosfát) 900 d jádro (nukl. báze) 1520-1570 n CO, dNH (pep. vazba) 1620-1670 dCN, dNH 1500-1550 Polohy abs. pásu podle typu vazeb X -H 3600 – 2700 X=Y 2700 – 1900 X=Y 1900 – 1500 X-Y 1500 - 500 IR spektroskopie IR spektra proteinů Amid I - 1655 cm-1 n N-CO Amid II – 1550 cm-1 d NH CN Závislost spektra peptidové vazby na typu struktury Amid I (D2O) a-helix 1651 -1657 b- struktura 1620 -1640 1670 -1680 RC 1640 -1648 IR spektroskopie Schema přístroje IR spektroskopie •Zdroj – žhavené materiály (slitiny kovů, keramika) –vlákna, tyčinky (nichromový zdroj, Nernstova tyčinka, globar) •Monochromátor –mřížka – jiná hustota vrypů –Michelsonův interferometr – za vzorkem •Detektor –fotoelektrický –tepelný • IR spektroskopie fourrier FT-IR spektroskopie michelson •Michelsonův interferometr IR spektroskopie FT-IR spektra proteinů, změna konformace CaF2, D2O, 60 mg/ml, 10 ml IRprot H bS Ramanova spektroskopie •NC 1930 •Neelastický rozptyl •– srážky fotonů s částicí •Není absorpční •Měříme vyzářené světlo • • • Sir C. V. Raman Ramanova spektroskopie •Rozptyl, měření vyzářeného světla oVirtuální stav – excitace Energiezustände der Hyper-Raman-Spektroskopie Ramanova spektroskopie principRam Ramanova spektroskopie nR = no – nvibr Dn = no – nR = no – (no – nvib) Dn = nvib lo = 555 nm no = 18 000 cm-1 Pokud nvib = 1600 cm-1 nR = 18 000 – 1 600 = 16 400 cm-1 lR = 610 nm no – nvib no + nvib Rayleigh Stockes Anti-Stockes Ramanova spektroskopie ramancom Zdroje: lasery He-Ne – 633 nm Ar 488 nm Ramanova spektroskopie RamanEqu Ramanova spektroskopie polarizovatel Polarizovatelnost molekuly a vibrační mody Viditelnost vibrace v Ramanově spektru vyžaduje změnu polarizovatelnosti vazby Doplňkové k IR Symetrické vibrace CO2 Ramanova spektroskopie Indukce dipólu P v elektrickém poli Ei P = a. Ei a – polarizovatelnost Ei = Eo cos(2pni t) ni vlnočet záření a= ao + avcos(2pnv t) nv vibr. frekvence molekuly p = Eoaocos(2pnit) + Eoavcos(2pnit).cos(2pnvt) + Eoav[cos2pt(ni +nv) + cos2pt(ni - nv)] Poměr intenzit Stockesových a anti-Stockesových linií IA/IS = (ni – nv)4.e (-hnv/kT) (ni + nv) Anti-Stockesovy linie jsou mnohem slabší Ramanova spektroskopie Infrared Raman Fyzikální efekt Absorpce Změna diplového momentu (silné, iontové vazby jako O-H, N-H) Rozptyl Změna polarizovatelnosti (silné: kovalentní vazby jako C=C, C-S, S-S) Příprava vzorku Optimální tloušťka (transmission mode) kontakt vzorku nutný Bez kontaktu, destrukce jednoducháý příprava voda nebo sklo neruší měření Komplikace Silná absorpce skla, vody, CO2 Fluorescece Materiály Zejména organické látky Neomezeno Frekvenční rozsah 4000 - 700 cm-1 4000 - 50 cm-1 (Stokes and Antistokes) Ramanova spektroskopie Běžná Ramanova spektroskopie Excitace světlem E < DE = Eex - Ez Např. lchromoforu 220 nm, l světla 488 nm l Rezonanční Ramanova spektroskopie Elektronové a vibrační přechody – excitace světlem E > DE = Eex - Ez l světla je kratší než l odpovídajícího el. přechodu (l chromoforu 550 nm, l světla 500 - 400 nm, laditelný laser) Rezonanční Ramanův efekt – zesílení určitých liníí raman_frekv Dn Dn Ramanova spektroskopie cyt_c-Raman Resonanční Ramanova spektra cyt c: 1340 – 1550 cm-1: oxidační a vazebný stav hemového Fe. 1375 a 1504 cm-1 – oxidovaný stav, bis-His hemu (6cLS konfigurace). Redukovaný stav: 1353 – 1468 cm-1 (5cHS konfigurace) Ramanova spektroskopie cytb-CO-Raman Vazba izotopů CO na cytochrom b5. Ramanova spektroskopie mutant-schema CD-mutant raM Analýza mutantů Leu88Asp Prakticky totožná CD spektra RR: 1482, 1565 – 6 koordinační Fe, s vysokým spinem 1505, 1582 – 6 koordinační, nízký spin divoký kmen a mutant prakticky totožné Ramanova spektroskopie PL1 Spektrum deuterovaného DPPC nas CD2 nsCD3 nsCD3 nsCD2