C6200-Biochemické metody 10C1_Chiroptické metody Petr Zbořil Chiroptické metody •Anizotropní prostředí •Chirální (prochirální) centra •Odlišné chování k různě orientovaným fotonům •Metody využívají oddělených paprsků majících chirální charakter Chiroptické metody - disperzní pole Popis fotonu – šipkou směr šíření E - vektor elektrického pole H – vektor magnetického pole Skládání vektorů L a R ER EL E polaranim Výsledný vektor jako součet L a R složek Skládání vektorů L a R α = φR – φL = (nL – nR) π/λ zde L pomalejší Nedochází k absorbci event. je stejná pro L a R Stejná nebo rozdílná rychlost pro L a R - prostředí izo- nebo anizotropní 3-polariz-k2 Chiroptické metody - disperzní Opticky aktivní látka: Rozdílný refraktivní index (n) pro ER, EL Každá ze složek se pohybuje různou rychlostí a= jR - L a a = (nL – nR)p/l ER EL E a Polarimetry Jednoduchá měření, koncentrace sacharidů ap. Bílé světlo u jednoduchých, monochromátory ev. monochromatický zdroj (Na-výbojka). Elektrická kompensace – polarisační filtry, křemenné klíny. Polarizace světla = výběr stejně orientovaných fotonů Hranoly, filtry Schema polarimetru: Z-zdroj, L – spojka, kolimátor, P a A – polarizační hranoly (filtry), K – kyveta se vzorkem 1-Polarimetr-o3k 2-Nicol-ok Polarimetrie • •Měrná otáčivost [α]λt = 100 α/cl •c v %, l v dm, tabeluje se pro různá rozpouštědla •Molární otáčivost [Φ]λt = [α]λt . Mr / 100 • •Měření koncentrace, změn otáčivosti (mutarotace) 4-ORD-sppolarimetr-k Otáčivost = f(l) Optická rotační disperze - ORD ORD Spektra ORD (optická rotační disperze) nm Molární rotace F lo Pozitvní Cottonův efekt ORD • 6-ORD-ok Cirkulární dichroismus cd eR ¹ eL Cirkulární dichroismus • Cirkulární polarizace http://www.photophysics.com/tutorials/circular-dichroism-cd-spectroscopy/4-cd-spectrometer-operatin g-principles Cirkulární polarizace • • • • • • • • •Cirkulární polarizace –Čtvrtvlnná destička Cirkulární polarizace File:Circularly pol.png File:Electric Vectors 1.png C:\Users\Zboril\Pictures\%=VýukaAktu2\=CD\7_ CD Units & Conversions_soubory\elipticity%20graphic%20enlarged%20V12%20513x330%20flattened%2072%20dpi.png Přístrojové vybavení - CD schema Blokové schema CD spektrometru Přístrojové vybavení - CD JASCO J-810 Spectropolarimeter Přístrojové vybavení - CD spektrometr CD spektra – Cottonův efekt Elipticita Q= 3298 (eL – eR) = 3298.De Spektrum CD: Q = f De nm Q lo CD spektra – Cottonův efekt 7-CD-k • CD spektra CD spektra proteinů – UV oblast -peptidová vazba (190 – 230 nm) n®p* nevazebné elektrony karbonylu, 220 nm p ®p*, p elektrony karbonylu,190 nm Intenzita a energie přechodů závisí na úhlech Zbytky R málo ovlivní - Phe, Tyr, Trp, disulfidy > 230 nm Podmínky: koncentrace 0.2 – 0.5 mg/ml CD nukleových kyselin Vliv specifické absobce nukleotidů Báze jsou zahrnuty v interakcích peptvazba CD spektra •CD spektra proteinů –vliv struktury •Terciární –Pravidelné –Náhodné klubko –Priony –Interakce – sledování –DNA/RNA/protein –rozpoznání – Modulace specificity/affinity –vazby – Zhutnění molekuly – Aktivace štěpením – CD spektra Měření CD spekter proteinů náhodné klubko poly-L-lysin při pH 7.0, (Pro-Lys-Leu-Lys-Leu)n, slabá iontová síla a-helix poly-L-lysin při pH 10.2, nebo myoglobin b-skl. list poly-L-lysin při pH 11.2 , zahřátí na 50°C, ochlazení, nebo (Lys-Leu)n v 0.1 M NaF při pH 7 Spektrum neznámého proteinu Q(l) = fa Q a(l) + fb Q b(l) + fRC Q RC(l) kde Q a(l), Q b(l) a Q RC(l) jsou hodnoty získané z referentních bílkovina f frakce. Chiroptické metody spektra prototypyCD CD spektra a-helixu. b-skl.listu, smyčky, náhodného klubka Chiroptické metody struktury Spektra reálných proteinů A triosofosfátisomerasa: H:0.52, S:0.14, T:0.11, O:0.23 B: lysozym H:0.36, S:0.09, T:0.32, O: 0.23 C: myoglobin H:0.78, S:0, T:0.12, O:0.10 D: chymotrypsin H:0.10, S:0.34, T:0.20, O:0,36 CDspektra Chiroptické metody sepktrum rekombinantu Použití metody: CD spektrum mutantního proteinu Chiroptické metody gdhcd Použití metody: CD spektrum mutantního proteinu gdhtab Asp165 náhrada za Ser Spektra velmi podobná – při mutaci nedochází k podstatné změně struktury proteinu