C6200-Biochemické metody
12e_difusimetrie
Petr Zbořil

Princip metody
•Pohyb částic
–Translační
–Rotační
•Vliv
–Velikosti a tvaru (symetrie, hydratace apod.)
–Prostředí – viskozita (T)
•

Translační difuze
•Parametry – D a f
•f = RT/D, f0 = 6p.h0.r.NA       – 1 mol, koule
•vM = 4pr3/3 = Mr"/NA = objem 1 molekuly
•r = 3Ö(3Mr."/4p.NA),  " = parciální specifický objem
• reálná molekula – určení f měřením
• F (frikční poměr asym. konst.) = f/f0  Î 1 – 3
•umožňuje odhad a:b, vliv hydratace – nejednoznačné
•Fkor = F. 3Ö("/("+H)), H = objem hydratace
–

Translační difuze
• Měření
–Metoda porezní stěny – řádově dny
•Nádobka rozdělená diafragmou – neselektivní
•Měření koncentrace v čase – dc/dt - dm/dt
–Fickův zákon – dm/dt = -D . dc/dx . A
•Centrifugací – řádově hodiny
–Rozšiřování rozhraní mezi c1 a c2
–4p.D.t = (A/Y)2 kde A je plocha a Y výška píku
–

Translační difuze
•Centrifugací
–

Translační difuze
•Centrifugací – řád hodin
–Rozšiřování rozhraní mezi c1 a c2
–4p.D.t = (A/Y)2 kde A je plocha a Y výška píku
–

Rotační difuze
•Parametry
•koeficient rotační difuse Θ
–kulovitá nehydratovaná částice
–Θ0 = RT/8ph0NAr3 Perrin
•relaxační čas tr   Θ  = f(1/tr)
–pohyblivost kolem 3 os (obvykle stačí 2)
–pro asymetrickou částici Θa, Θb (ev. Θc) a tra, trb (ev. trc)
–1/trh = (1/tra + 1/trb + 1/trc)/3

Rotační difuze
•Měření tr
•relaxační techniky: jednotná orientace se rozvolňuje
•orientace vnější silou
–dvojlom za toku - tečná síla v rychlostním gradientu
–dielektrická disperse - dipóly orientovány v el. poli
•výběr stejně orientovaných molekul
–polarisace fluorescence
•

Dielektrická disperze
•Dielektrická disperze
–Určení permitivity e
–erel = C/C0   (vakuum, prakt. vzduch)
–Měření impedance Z = 1/i.w.e.C0
–erel = f(log w)
•t =   f(1/ w) pro půlvlnu

Dielektrická disperze
•Dielektrická disperze
–Obecný popis erel = f(log w)
–e0 – rozpouštědlo (voda) – resonance
–e1 – rozpouštědlo + sol
–e2 – rozpouštědlo
–B – voda se nestačí reorientovat
•t =   f(1/ w) pro půlvlnu

Dielektrická disperze
•Dielektrická disperze tkání


Polarizace fluorescence
•p = (F| - F^)/(F| + F^)
–Měření při různých teplotách
–Vynesení 1/p = f(T/h0) k = texc/trh

Polarizace fluorescence
•A = (F^ - F|)/(F^ + 2F|)
–nanosekundová pulsní technika
–At = A0 . e-3t/t ln At = -3t/t  + ln A0

Zpracování - vynesení
•Využití pro popis tvaru molekuly
–Kombinace s viskosimetrií
–Harding L = 3 [h] . h0 . Mr /trh R T
•