Příprava vzorků – odběr vzorků, uchování vzorků a izolace Petra Vídeňská, Ph.D. [USEMAP] Workflow •Design studie •Odběr vzorků •Izolace DNA •Příprava knihovny •Sekvenace •Analýza • • Amplikony – 16S rRNA Shot gun – celometagenomové sekvenování [USEMAP] Faktory ovlivňující výsledek sekvenace genu pro 16S rRNA •Sběr vzorků –Čas vystavení vzduchu –Teplota –Postup •Izolace DNA –Použitý kit a metoda disrupce bakteriálních buněk –Čas po který je vzorek rozmrazován před izolací •Příprava knihovny –Výběr primerů –Polymeráza –Počet cyklů PCR (vznik chimér) •Sekvenace –Výběr sekvenační platformy –Kvalita knihovny •Analýza –Použitý quality trimming –Použité algoritmy pro výběr OTU –Algoritmus výběru reprezentativních sekvencí –Výběr databáze 16S rDNA – – – [USEMAP] Nejčastější typy vzorků •Voda •Půda •Biologické vzorky –Stolice –Sliny –Stěry – –!Nejdůležitější je vždy zachovat stejný postup odběru! – [USEMAP] Odběr vzorků - půda •Vhodně zvolit lokalitu, možno i z několika hloubek a vícero opakování vzorkování •Odběr do sterilní nádoby, sáčku •Transport na ledu, následné zmražení na -20 °C až -80°C •Na izolaci většinou postačí malé množství půdy, často se ale měří vícero hodnot a odebírá se tedy velké množství – půdu je před zpracováním nutno homogenizovat • • [USEMAP] Odběr vzorků - voda •Možno odebírat z více hloubek ve zvolené lokalitě •Odebírá se větší objem (dle očekáváné bakteriální kontaminace 100 – 1000 ml) a transportuje se na ledu do laboratoře •Následně se voda filtruje přes bakteriologický filtr •Filtr je vložen do vhodné tekutiny (voda, TE, PBS) a promyje se • [USEMAP] Odběr vzorků – biologické vzorky •složitější, např. u stolice velké množství anaerobů – fakultativně anaerobní bakterie rychle přerůstají •Nutno okamžitě zamrazit •Pokud není možno – komerční kity s pufry sloužící ke stabilizaci DNA a zamezení přerůstání bakterií po dobu XY dnů [USEMAP] Odběr vzorků stolice - problémy •Nestandardizované odběry vzorků – různá délka vystavení vzorku kyslíku a teplotám před zamrazením •Různé formy stolice (průjem, pevná stolice, dětská stolice, mekonium) – různé typy odběrových nádob •Problém homogenizace – odběr jen z jednoho místa stolice •Přítomnost inhibitorů PCR • • [USEMAP] Komerční souprava na odběr vzorků stolice DNA Genotek | Collection Instructions | DNA | RNA | Infectious Disease | Livestock - Mozilla Firefox DNA Genotek | OMNIgene | Infectious Disease Research | Microbial DNA - Mozilla Firefox [USEMAP] Komerční souprava na odběr vzorků stolice DNA/RNA Shield™ - Fecal Collection Tube - Mozilla Firefox Importance of Sample Collection and Preservation - Resources - Mozilla Firefox [USEMAP] Komerční kity •Jednoduché workflow, ale málokdy se hodí na všechny typy stolice •Pozor na bezpečnost – obsahují chemikálie, vždy v návodu uvádějte i informace o bezpečnosti (co dělat když se člověk potřísní nebo pokud semu dostane pufr do oka apod.) • [USEMAP] Ukázka různých přístupů – American Gut Project x uBiome •https://mrheisenbug.wordpress.com/2014/04/24/dear-american-gut-ubiome-you-have-some-explaining-to- do/ Dear American Gut & uBiome: You Have Some Explaining To Do. | Mr. Heisenbug - Mozilla Firefox http://blogs.discovermagazine.com/crux/files/2015/09/Open-kit.jpg [USEMAP] American Gut Project – podmínky skladování •http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20412303 nihms-211815.pdf - Mozilla Firefox [USEMAP] American Gut Project – podmínky skladování Non-metric Multidimensional Scaling (NMDS) plots of UniFrac weighted and unweighted pairwise distances. Overall community composition was not affected by temperature or duration of storage for weighted UniFrac distances (P> 0.1 in all cases). Length of storage significantly affected the skin communities for the unweighted UniFrac metric (P = 0.02). The remaining unweighted UniFrac distances were not significantly different by day or temperature. Blue=sample 1, red = sample 2. Open symbols = Day 3, closed symbols = Day 14. ▲= 20°C, ■ = 4°C, ● = −20°C, ◆ = −80°C. [USEMAP] art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox Vliv laboratorní teploty na degradaci DNA [USEMAP] art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox Vliv laboratorní teploty na degradaci DNA [USEMAP] art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox Vliv laboratorní teploty na degradaci DNA [USEMAP] art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox Vliv laboratorní teploty na degradaci DNA art%3A10.1186%2F1471-2180-12-158.pdf - Mozilla Firefox [USEMAP] Vliv skladovacích podmínek na bakteriální složení vzorku srep16350.pdf - Adobe Acrobat Pro DC • [USEMAP] Figure 1: Species diversity following incubation under six different storage conditions : Scientific Reports - Mozilla Firefox The extent of microbiota structural and composition diversities were measured using (A) Taxa S (species richness), (B) Shannon-Weiner diversity index, (C) Simpson’s evenness index. Each point represents the diversity score for a replicate from collection 1 (●), collection 2 (▲) or collection 3 (■). Error bars represent SEM. Within-group and between-group variations were measured using Kruskal-Wallis one-way ANOVA and Mann-Whitney U-test, respectively. Significant variance is indicated by asterisks; single asterisk (*) indicates p ≤ 0.05, double asterisk (**) represents p ≤ 0.01. Vliv skladovacích podmínek na bakteriální složení vzorku [USEMAP] Figure 2: Relative abundance at phylum level for each sample incubated under six different storage conditions. : Scientific Reports - Mozilla Firefox Vliv skladovacích podmínek na bakteriální složení vzorku [USEMAP] Table 1: Mean difference in the relative abundance of the phyla Firmicutes Bacteroidetes, Actinobacteria and Proteobacteria in different storage conditions compared to −80°C. : Scientific Reports - Mozilla Firefox Vliv skladovacích podmínek na bakteriální složení vzorku [USEMAP] Figure 3: Clustering of samples due to storage conditions by PCoA, based on Bray-Curtis similarity distance. : Scientific Reports - Mozilla Firefox Vliv skladovacích podmínek na bakteriální složení vzorku [USEMAP] Izolace DNA •Nejčastěji komerčními kity – přímo dle typu vzorku •2 přístupy –Lyze buněk enzymaticky –Lyze buněk enzymaticky i mechanicky pomocí beat beateru, homogenizátoru àke vzorku se přidají kuličky z různých materiálů dle výrobce, tento krok lze přidat i u pouze enzymatických kitů •Doporučuji přidat krok s RNázou A, pokud není součástí postupu [USEMAP] Izolace Microsoft Word - 12888.docx - PowerSoil_DNA_Isolation_Kit_Instruction_Manual.pdf - Mozilla Firefox QIAamp-DNA-Stool-Handbook---June-2012-EN.pdf - Adobe Acrobat Pro DC [USEMAP] Cíle izolace •Získat co nejméně degradovanou DNA –Degradovaná DNA pro sekvenaci genu 16S rRNA není problém, ale pro celometagenomové sekvenování už může být – lze řešit vyřezáním z gelu •Získat DNA bez inhibitorů (každý kit obsahuje jinou techniku pro odstraňování inhibitorů) •Získat co největší množství DNA (opět více důležité pro celometagenomové sekvenování) –Pokud není DNA dost – MDA (WGA) – [USEMAP] Kontaminace izolačních kitů art%3A10.1186%2Fs12915-014-0087-z.pdf - Mozilla Firefox Problém zejména u diagnostiky, tam kde je málo vstupní DNA a kontaminace se projeví [USEMAP] art%3A10.1186%2Fs12915-014-0087-z.pdf - Mozilla Firefox Kontaminace izolačních kitů [USEMAP] art%3A10.1186%2Fs12915-014-0087-z.pdf - Mozilla Firefox Kontaminace izolačních kitů [USEMAP] Srovnání kitů [USEMAP]