LOSCHMID LABORATORIES Inženýrství a analýza proteinů in silico David Bednar BÍ1051 Úvod do matematické biologie a biomedicíny II Loschmidtovy Laboratoře Jiří Damborský Loschmidtovy Laboratoře Experimentální tým David Bednář Jan Štourač Stanislav Mazurenko Loschmidtovy Laboratoře REPUBLIC Proteiny HIV Escherichia coli Aequorea victoria Malus domestica Homo sapiens sapiens HIV kapsid Flagelin GFP Fotosystem I ADH Virulence Pohyb Fluorescence Fotosyntéza Kocovina Potravinářství Zemědělství Chemie a farmacie Ochrana prostředí Textilní průmysl Domácnost Proteiny Proteinové inženýrství Přístupy proteinového inženýrství RATIONAL DESIGN DIRECTED EVOLUTION 1. Computer aided design 1. not applied Í 2. Site-directed mutagenesis Individual mutated gene 3. Transformation 4. Protein expression 5. Protein purification 6. not applied IMPROVED ENZYME Constructed mutant enzyme 7. Biochemical testing 2. Random mutagenesis O Library of mutated genes ( > 10,000 clones ) 3. Transformation 4. Protein expression 5. not applied 6. Screening and selection - stability - selectivity - affinity - activity Selected mutant enzymes Semi-racionální design ■ Identifikace aminokyselin významně ovlivňující určitou funkci proteinů (hot-spoty) ■ Vytváření chytrých knihoven pro redukci experimentálního screeningu ■ Hledání hot-spotů za účelem zlepšení: Residua v přímém kontaktu s ligandem Aspl89(A) Gly226(A)C3 cb 3TCys220(A) -2.91 — o" # Gly219(A) Gly21ó(A) Val213(A), Cysl91(A t ..„1 fl£, 4 \L- Ben246(A) Trp215(A) Ser 195(A)1 Hot-spoty pro katalytické vlastnosti Residua vazebné kapsy Vazebné místo Ligand Hot-spoty pro katalytické vlastnosti Residua vazebné kapsy Hot-spoty pro katalytické vlastnosti Residua vazebné kapsy Hot-spoty pro katalytické vlastnosti Residua vazebné kapsy Hot-spoty pro katalytické vlastnosti Residua vazebné kapsy Hot-spoty pro katalytické vlastnosti Residua v přístupových cestách (tunelech) Vazebné Přístupový tu Ligand Hot-spoty pro katalytické vlastnosti Residua v přístupových cestách (tunelech) -4 1 Hot-spoty pro katalytické vlastnosti Residua v přístupových cestách (tunelech) mutace Residua v přístupových cestách (tunelech) mutace www.caver.cz >111 000 stažení >750 citací >6 000 registrovaných uživatelů sign in Email: Password: Sign in Create new user account Forgot your passv/ord? Please contact us at Ca\ si3cive-r.cz. user statistics 765 citations 6071 registered users 111385>: CAVER downloaded news CAVER cited in NATURE January 8, 2019 CAVER was cited in the NATURE journal in article Cr/o-EM structure of the human o163y2 GABAA... Read more CAVER cited in NATURE Communications January ! 2019 CAVER was cited in the NATURE Communications journal in article Cryo-EM structures of KdpFABC... Read more E. Chovancova, et al. PLoS Comp. Biol. 2012, 8, el002708 23 Hot-spoty pro stabilitu ■ Residua s vysokými krystalografickými B-faktory CRYSTAL STRUCTURE OF NIDOGEN/LAMININ COMPLEX highest 2 9 averaged 3 values are shown cr.lv Chain identifier of chain no. 1 A Re 3 i due Nair.e Residue seq. no. E value Rank AÄ3 A 331 48 46 1 GLU A 330 46 87 SER A 151 46 50 E ALA A 149 45 91' Ť ILE A 150 45 Č9 5 31 "J A 9E 1 45 6E 6 ASN A 332 44 67 31Y A 373 44 E 9 E A e 5 44 32 9 LYS A 152 43 64 19 31Y A 3 E :■ 43 E E 11 y.z5 A 9" E 42 Et _2 LEU A 148 42 76 13 < H Hot-spoty pro stabilitu ■ Residua v tunelech a kavitách Vyplnění volného prostoru -> více interakcí -> lepší stabilita Racionální design ■ Použití metod molekulového modelování pro identifikaci mutací zlepšujících vlastnosti ■ Nutná znalost struktury a funkce MSLGAKPFGEKKFIEIKGRRMAYIDEGTGDPILFQHGNPTSSYLWRNIMPHCA GLGRLIACDLIGMGDSDKLDPSGPERYAYAEHRDYLDALWEALDLGDRVVLVV Sekvence HDWGSALGFDWARRHRERVQGIAYMEAIAMPIEWADFPEQDRDLFQAFRS Použití metod molekulového modelování pro identifikaci mutací zlepšujících vlastnosti Nutná znalost struktury a funkce Aplikace a metody ■ Predikce interakcí protein-ligand (molekulární docking) ■ Predikce pohybů proteinu (molekulová dynamika) ■ Predikce reakčních barier a mechanismů (kvantová mechanika) ■ Predikce stability (molekulová mechanika) Molekulární docking ■ Predikce komplexu proteinu s navázaným ligandem Enzym Malá molekula Komplex enzymu s (receptor) (ligand) navázaným ligandem Molekulární docking ■ Dvoukrokový proces Prohledávání - nalezení konformace v aktivním místě enzymu Hodnocení-výpočet vazebné energie na základě interakcí ohodnocených skórovací funkcí C—affinity " Energy - -76.69 kccjt/jnol RMSD - 0.86 Angstrom^ Molekulární docking Virtuální screening ■ Docking mnoha ligandů do jednoho proteinu Dock ■ Docking jednoho ligandu Do mnoha proteinů Virtuální screening ■ DNA endonukleasa MUS81 ■ Účastní se reparace DNA ■ Cíl pro vývoj protirakovinných léčiv Virtuální screening ■ High-throughput screening ■ Robotická platforma v Centru chemické genetiky, AV ČR ■ Experimentálně testováno přes 23 000 molekul ■ Identifikován inhibitor: IC50 = 50 |iM Virtuální screening Virtuální screening ■ Dockováno více než 140 000 molekul Experimentálně testováno 19 potenciálních inhibitorů 6 inhibitorů slC50< 50 |iM Nejlepší inhibitor: IC50 = 5|iM Virtuální screening ■ porovnání Experimentální Virtuální vybavení (Kč) Desítky mil. 1 mil. Testování Výpočetní - 140 000 Experimentální 23 000 19 Cena (Kč) 2 000 000 40 000 Čas Týdny Dny Results Počet inhibitorů 1 6 Nejlepší IC50 (M.M) 50 5 Molekulová mechanika Aproximace atomů jako kuliček a vazeb jako pružin Sílu interakce popisují jednoduché rovnice - silové pole Výpočet energie jako součet všech interakcí r Bonded i -"\ f- E.....= 2 K (r-rJ + 2 Ktf-dJ + 2 [1 + cos(i* - 7)] + 2 [ Non-bonded _i_ A total , , r bonds angles dihedrals _ R.12 R6 ' eR K J U 'J Inženýrství stability Stabilizace dehalogenasy DhaA ■ Odbourávání toxických látek a produkce čistých chemikálií ■ Tm= 49°C ■ Poločas rozpadu v 60 °C t1/2 ~ 5 min Stabilizace dehalogenasy Dha, Experimentální přístup ■ Projekt společností Diversa a DOW Chemical ■ Gene Site Saturation Mutagenesis ■ 19 mutací na všech 300 pozicích zkonstruováno experimentálně -> 120,000 testovaných kolonií Stabilizace dehalogenasy Dha, Racionální design ■ In silico metoda FireProt Energy-based approach Evolution-based approach Strukturní a sekvenční analýzy 5500 možných mutantů O -t-í -t—i CL E o ra -i—' c E i— (D CL X Target protein Conservation and correlation analysis r Back-to-consensus _analysis_ FoldX prediction FoldX prediction Rosetta prediction Interaction analysis Interaction analysis Antagonistic effect prediction 1 Multiple-point mutant design Multiple-point mutant design Structure and activity check Structure and activity check Stability determination I Stability determination Combined mutant Stabilizace dehalogenasy Dha- Racionální design ■ In silico metoda FireProt O CL E o ra -i—' c CD E i— CD CL X Energy-based approach Evolution-based approach Target protein Conservation and correlation analysis r Back-to-consensus FoldX prediction Rosetta prediction Interaction analysis Antagonistic effect prediction 1 Multiple-point mutant design Structure and activity check l r FoldX prediction Interaction analysis r Multiple-point mutant design r Structure and activity check Stability determination Stability determination Combined mutant Stabilizace dehalogenasy Dha, Racionální design ■ In silico metoda FireProt O -t—i CL E o ra -i—' c CD E i— CD CL X Energy-based approach Evolution-based approach Target protein Conservation and correlation analysis r Back-to-consensus FoldX prediction Rosetta prediction Interaction analysis Antagonistic effect prediction 1 Multiple-point mutant design Structure and activity check l r FoldX prediction Interaction analysis r Multiple-point mutant design r Structure and activity check Stability determination Stability determination Combined mutant Stabilizace dehalogenasy Dha Racionální design ■ In silico metoda FireProt Energy-based approach Evolution-based approach TO o TO -t—i Cl E o ra -i—' c CD E i— CD CL X Target protein Conservation and correlation analysis r Back-to-consensus _analysis_ FoldX prediction FoldX prediction Rosetta prediction Interaction analysis Interaction analysis Antagonistic effect prediction 1 Multiple-point mutant design Multiple-point mutant design Structure and activity check Structure and activity check Stability determination I Stability determination Combined mutant Stabilizace dehalogenasy Dha Racionální design ■ In silico metoda FireProt Energy-based approach Evolution-based approach D198W V219W D266F TO O -t-í TO -t—i Cl E o C262L C128F C176F/-X -i—' c CD E i— CD CL X Target protein Conservation and correlation analysis r Back-to-consensus _analysis_ FoldX prediction FoldX prediction Rosetta prediction Interaction analysis Interaction analysis Antagonistic effect prediction 1 Multiple-point mutant design Multiple-point mutant design Structure and activity check Structure and activity check Stability determination I Stability determination Combined mutant Stabilizace dehalogenasy Dha- Racionální design ■ In silico metoda FireProt A155P A172I D198W co t= o ro -t—i CL E o C262L C128F C176F/-\ -i—' c CD E i— CD CL X Energy-based approach Evolution-based approach Target protein Conservation and correlation analysis r FoldX prediction Rosetta prediction Interaction analysis Antagonistic effect prediction 1 Multiple-point mutant design Structure and activity check Stability determination Back-to-consensus i r FoldX prediction Interaction analysis r Multiple-point mutant design r Structure and activity check Stability determination Combined mutant Stabilizace dehalogenasy Dha Racionální design In silico metoda FireProt Strukturní a sekvenční analýzy 5500 možných mutantů 5 experimentálně ověřených 3 mutanti stabilnější Finální mutant: Tm = 740C(25°Ct) Tl/2 = 72h(ca.72h/H O -t-í -t—i CL E o ra -i—' c E i— (D CL X Energy-based approach Evolution-based approach Target protein Conservation and correlation analysis r Back-to-consensus _analysis_ FoldX prediction FoldX prediction Rosetta prediction Interaction analysis Interaction analysis Antagonistic effect prediction 1 Multiple-point mutant design Multiple-point mutant design Structure and activity check Structure and activity check Stability determination I Stability determination Combined mutant Stabilizace dehalogenasy Dha, ■ porovnání GSSM FireProt Vybavení (Kč) Desítky mil. 1 mil. testování Výpočetní - 5 500 Experimentální 120 000 5 náklady (Kč) 1 000 000 80 000 čas měsíce týdny výsledky Finální mutant A7m (°C) 18 25 *l/2 (h) 36 72 Molekulová dynamika ■ Popis systému v čase ■ Informace o energii, amplitudách a časech pohybů Molekulová dynamika Protein-proteinové interakce Interakce peptidu s membránou Kvantová chemie Modelování reakcí ■ Výpočet rychlosti enzymatické reakce OJ i_ C LU Reaction Coordinate Kvantová chemie David Bednář Loschmidtovy laboratoře Ústav experimentální biologie a RECETOX Budova A13, místnost 219 http://loschmidt.chemi.muni.cz davidbednarl208@gmail.com