Karel Souček ÚLOHA BUNĚČNÝCH MEMBRÁN A LIPIDOVÝCH SLOŽEK ŽIVOČIŠNÝCH BUNĚK Membrány zajišťují základní buněčné funkce Separace Semipermeabilní bariéra, izolace Výměna Transport a translokace metabolitů a makromolekul dovnitř a ven, zajištění distribuce uvnitř buňky Integrace Zajištění mezibuněčné komunikace, adheze, signalizace prostřednictvím receptorů, regulace funkční a prostorové integrity Metabolismus Součást metabolických drah, obsahují enzymy pro syntézu, přestavbu a degradaci Membrány Všechny biologické membrány mají shodnou obecnou strukturu Tenká vrstva tvořena molekulami lipidů (lipidová dvouvrstva) a proteinů spojených nekovalentními vazbami (model fluidní mozaiky) Lipidová dvouvrstva Základní složka všech buněčných membrán Všechny typy membránových lipidů obsahují polární a nepolární část hydrofilní (polární) + hydrofóbní (nepolární) = amfifilní zformování lipidové dvouvrstvy je energeticky příznivé Fosfolipidy – nejčastější membránové lipidy Polární fosfátová skupina dva hydrofobní konce - mastné kyseliny Fosfoglyceridy a sfingolipidy Glycerol nebo sfingozin dva řetězce mastných kyselin fosfátová skupina spojena s různými molekulami různé kombinace = mnoho rozdílných fosfoglyceridů Glykolipidy obsahují sacharidy vázané na glycerol nebo sfingozin hrají roli jako receptory na povrchu membrán. Cholesterol sterol abundantní složka membrán Fluidita membrán je podmíněna jejich složením dvojitá lipidová membrána je flexibilní a fluidní - vlastnosti dvoudimenzionální tekutiny Fluidita je důležitá vlastnost membrán závislá na jejich složení Cholesterol délka uhlovodíkových řetězců mastných kyselin počet dvojných vazeb Těsné a pravidelné uspořádání dvouvrstvy ~ < fluidita kratší řetězce > fluidita vyšší počet dvojných vazeb > fluidita cholesterol „ztužuje“ membránu ~ < flexibilita a permeabilita Rozdílné složení lipidových membrán Membránové nanodomény Lipidové nanodomény, 10-200 nm, dynamické struktury Obohacené cholesterolem a sfingolipidy Role v řadě buněčných funkcí signálová transdukce virová infekce ER-to-Golgi transport post Goldi transport endocytóza Membránové nanodomény Aktivace TCR (T cell receptor) doi:10.1038/nrm2977 Sestavení a uvolnění viru HIV doi:10.1038/nrm2977 Syntéza a sestavení lipidové membrány na ER Asymetrie lipidové membrány Funkčně důležitá v přenosu signálu řada cytosolických proteinů specificky rozpoznává určité struktury v lipidové membráně Glykolipidy na vnější straně membrány Orientace zůstává zachována během transferu mezi buněčnými kompartementami Membránové proteiny – různé funkce Membránové proteiny – různé způsoby asociace s lipidovou dvouvrstvou jeden nebo více -helixů  struktura (skládaný list) amfifilní -helix kovalentně vázaný lipidový zbytek oligosacharidový linker nekovalentní interakce s dalšími membránovými proteiny Membránové proteiny s lipidovou kotvou Kovalentně navázaná lipidová složka umožňuje lokalizaci hydrofilního proteinu do membrány Glykosylace membránových proteinů většina transmembránových proteinů je glykosylovaná cukerný zbytek je přidáván v lumenu ER a Golgiho aparátu, oligosacharidový zbytek je vždy na necytosolové straně membrány glykosylace vnější strany membrány vede k intenzivnímu potažení povrchu buněk sacharidy Laterální pohyb membránových proteinů Omezení laterální mobility membránových proteinů samosestavení do větších agregátů, domén Interakce s dalšími strukturami uvnitř či vně buňky Interakce s dalšími proteiny na povrchu jiné buňky Buněčný kortex – mechanická podpora plazmatické membrány Buněčná membrána je extrémně tenká, 5nm ~ 10 000x = 1 list papíru membrána živočišné buňky je stabilizována sítí vláknitých proteinů - buněčný kortex Hlavní složky tetramery spektrinu aktin akrynin Principy transportu přes buněčné membrány Transport vody voda 70% hmotnosti buňky pomalá difúze Specializované kanály – akvaporiny Nefrony ledvin Sekreční žlázky osmóza Každá buněčná membrána má charakteristický set membránových transportérů Aktivní transport Energie uložená v koncentračním gradientu Hydrolýza ATP Transport glukózy Trans buněčný transport Transport řízený ATP P-typ autofosforylace, řada iontových kanálů zodpovědných za udržování gradientu mezi buněčnými membránami (Na+, K+, H+, Ca2+) ABC transportéry (ATP-Binding Cassette) transport malých molekul V-typ tvořeny z více podjednotek, přenášení H+ do organel jako jsou lysozomy, synaptické vezikuly Ca2+ pumpy cytosol buněk obsahuje velice nízké koncentrace Ca2+ (~10-7 M), zatímco v extracelulárním prostoru je koncentrace ~ 10-3 M malý influx Ca2+ významně zvyšuje koncentraci cCa2+ a ovlivňuje buněčnou odpověď aktivní pumpování Ca2+ ven z buňky aktivní pumpování Ca2+ do sarkoplasmatického retikula Na+-K+ pumpy plazmatické membrány Koncentrace K+ je 10-30x vyšší uvnitř buňky, koncentrace Na+ naopak nižší Tento stav udržován pomocí Na+-K+ pump Hydrolýza 1 molekuly ATP vede k transportu 3 molekul Na+ ven a 2 molekul K+ dovnitř ABC transportéry největší rodina transportních proteinů (člověk 48 genů, 7 rodin) každý transportér je transportuje specifické substráty Ionty, sacharidy, lipidy, aminokyseliny, toxiny, antibiotika klinický význam transport léčiv (multidrug reistance (MDR) protein ~ P-glykoprotein) Plasmodium falciparium, zimnička tropická – vnitrobuněčný prvok – původce malárie Amplifikace ABC → rezistence vůči antimalariku chloroquinonu TAP, transporter associated with antigen proecessing je přítomen v membráně ER aktivně transportuje proteasomem produkované peptidy z cytosolu do lumenu ER Peptidy jsou z ER jsou transportovány na membrány a vystaveny T- lymfocytům Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein (CFRT), není transportér, ale kanál, mutace způsobuje cystickou fibrózu (1/2900), defekt v Cl- gradientu ABC transportéry bez ATP je odkryta doména pro substrát na jedné straně membrány vazba ATP způsobí konformační změnu a exponuje substrátovou doménu na opačnou stranu membrány hydrolýza ATP vede k původní konformaci většina ABC transportérů je jednosměrná u eukaryot většina exportuje substráty z cytosolu ven, z cytosolu do ER nebo z mitochondriální matrix do cytosolu (u bakterii export i import) Lipidové membrány – předpoklad pro vnitrobuněčnou kompartmentaci selektivní permeabilita membrán umožnuje řízený transport molekul oddělení různých metabolických procesů Vnitrobuněčný membránový transport plazmatická i vnitřní buněčné membrány jsou v procesu neustálé změny kompozice v souvislosti s nutností buňky komunikovat s vnějším prostředím a dostatečně rychle reagovat na různé podněty komplexní systém membrán slouží přidávání a odebírání membránových proteinů (receptorů, iontových kanálů, transportérů exocytóza zajišťuje transport nově syntetizovaných látek ven z buňky nebo na plazmatickou membránu endocytóza umožňuje odejmutí membránových komponent a jejich internalizaci do endosomu recyklace nebo degradace v lysozomu Vnitrobuněčný membránový transport Transportní vezikuly malé, sférické větší, nepravidelné tubulární kargo přechází mezi buněčnými kompartmentami prostřednictvím vezikulů přenos z membrány a lumenu donora do membrány a lumenu cílové kompartmenty Sekrece a endocytóza Sekrece: ER → GA → plasmatická membrána Endocytóza: plasmatická membrána → … Specializace transportních vezikulů Transportní vezikuly jsou vytvářeny ze zvláštních ‚coated‘ částí buněčných membrán →‚coated vesicles‘ Clathrin-coated: z GA a plazmatické membrány Coat proteins, COPI & COPII-coated: z ER a z cisteren GA Adaptorové proteiny v „clathrin-coated“ vezikulech zachycují různé transmembránové proteiny (receptory) rozpoznávající solubilní molekuly karga uvnitř vezikulu ~ kargo receptory různé typy adaptorových proteinů (AP) pro různé kargo receptory 4 různé podjednotky jednořetězcové proteiny sestavení adaptorových proteinů (např. AP2) je přesně řízeno Lipidy indukují konformační změnu AP AP2 mění konformaci po vazbě na fosforylovaný fosfatidylinositol – PI(4,5)P2 - fosfoinositid Vazba s kargo receptory Indukce zakřivení membrány a posílení vazby dalších AP2 Fosfoinositidy označují organely a membránové domény inositolové fosfolipidy (10% všech fosfolipidů) mají důležité regulační funkce rychlá fosforylace/defosforylace na pozicích 3‘, 4‘, 5‘ inositolové skupiny → vznik různých fosfoinositidů Rozpoznání různými proteinovými doménami v závislosti na formě PIP konverze PI a PIP je kompartmentovaná ~ různé organely v dráze endocytózy a sekrece mají různé sety PI a PIP kináz a fosfatáz různá distribuce a variabilita PIP v organelách a membránových doménách Tvarování membrány a odštípnutí vezikulu Sestavení „clathrin-coat“ komplexu není dostačené k ohnutí membrány a odštípnutí vezikulu Nutná účast proteinů s tzv. BAR doménou určují tvar membrány a její zakřivení napomáhají vzniku výběžků a tvarují krček pučícího vezikulu interagují s lipidovou membránou pomocí elektrostatické vazby lokální uspořádání aktinových filament a účast cytosolových proteinů (dynamin) je zodpovědné za konečné odštípnutí vezikulu dynamin obsahuje PI(4,5)P2 vazebnou doménu, která ho váže k membráně a GTPásové doméně – určení stupně oddělování vezikulů ztráta „clathrin-coatu“ po oddělení vezikulu Navedení transportních vezikulů k cílovým membránám Jak najít cílovou membránu? 1) Rab proteiny a Rab efektory navedou vezikul na specifické místo cílové membrány 60 proteinů, monomeric GTPases Každý asociuje s jednou či více organelami, selektivní distribuce 2) SNARE proteiny a SNARE regulátory zprostředkují fúzi s cílovou lipidovou dvouvrstvou Fúzní proteiny SNARE ("SNAP" (Soluble NSF Attachment Protein) REceptor„) Katalyzují fúzi membrán vSNAREs – na membráně vezikulu jednořetězcový peptid tSNAREs – na cílové membráně komplex tří proteinů trans-SNARE komplex zamkne obě membrány k sobě párování v- a t-SNARE proteinů je vysoce specifické katalyzuje membránovou fúzi NSF protein indukuje disociaci SNARE párů po fúzi membrán Transport z plasmatické membrány - endocytóza vstřebávané složky/kargo jsou obklopena malou částí plasmatické membrány a invadovány za vzniku endocytického vezikulu kargo zahrnuje receptor-ligand komplexy, nutriční látky, bakterie, složky ECM, rozpadlé buňky většina buněk formuje trvale tyto vesikuly – pinocytóza specializované buňky pohlcují větší částice - fagocytóza většina endocytických vezikulů fúzuje s časnými endozómy návrat na membránu přes recyklující endozóm nebo degradace prostřednictvím pozdního endozómu, Endocytóza zprostředkovaná receptory vazba ligandu/makromolekuly na specifický membránový receptor akumulace v clathrin-coated prohlubni a internalizace ve vzniklém vezikulu Import cholesterolu Recyklace/transcytóza/degradace Endocytované receptory a jejich komplexy s ligandy mohou mít různý osud – v závislosti na typu receptoru recyklace do stejné oblasti membrány recyklace do jiného místa membrány - trancytóza degradace Souhrn buněčné membrány vytvářejí bariéry umožňující lokalizaci určitých molekul do konkrétních kompartment, skládají se z lipidové dvouvrstvy a vnořených proteinů membránové lipidy jsou amfipatické, mají hydrofóbní a hydrofilní oblast, tato vlastnost ve vodném prostředí způsobuje spontánní uspořádání do dvouvrstvy hlavní třídy membránových lipidů: fosfolipidy, steroly, glykolipidy lipidová dvouvrsva se chová jako tekutina, jednotlivé lipidové molekuly jsou schopny difundovat v rámci jedné dvouvrstvy, ale ne se spontánně přetáčet mezi vrstvami jednotlivé monovrstvy lipidů v buněčné membráně mají různé složení a různé funkce membránové proteiny jsou zodpovědné za většinu funkcí buněčných membrán – transport transportéry, které fungují jako pumpy využívají koncentrační gradient a hydrolýzu ATP membránové proteiny prochází membránou a nebo jsou s ní asociovány (kovalentně i nekovalentně) z jedné nebo druhé strany většina buněčných membrán je podepřena sítí tvořenou komplexem vláknitých proteinů řada proteinů a lipidů vystavena na vnější straně membrány je modifikována připojením polysacharidového řetězce – ochrana, mezibuněčné interakce eukaryotická buňka obsahuje organely uzavřené membránami transport mezi jednotlivými kompartmenty vyžaduje precizně řízenou tvorbu membránových vezikulů – coat proteiny, kargo receptory navedení vezikulů a jejích fúze s cílovou membránou je řízena proteiny Rab a SNARE endocytóza je důležitý mechanismu pro recyklaci a degradaci látek z buněčných membrán a vnějšího prostředí