Mikroskopie tvrdých zubních tkání Osnova přednášky Světelná mikroskopie Nastavení mikroskopu pro pozorování v procházejícím světle/polarizovaném světle Digitální mikrofotografie Stavba zubu, amelogeneze, růstové markery na zubech Příprava histologického preparátu Mikrostruktura tvrdých zubních tkání Metoda odontochronologie Praktické cvičení Literatura 3 Světelná mikroskopie s procházejícím světlem • Využívá spodního zdroje světla, které je soustředěno kondenzorem, prochází skrze tenký, průhledný/průsvitný vzorek, obraz jím vykreslený je zvětšen objektivem a pozorován přes okulár • Možné zvětšení od 10x do cca 400x (kombinací okuláru a objektivu) 4 5 Hlavní části optického mikroskopu 6 Části používané k nastavení mikroskopu 7 Po zapnutí mikroskopu zvedněte kondenzor do nejvyšší polohy Otevřete zcela clonu zorného pole a aperturní clonu. 1. 2. Nastavení mikroskopu pro pozorování v procházejícím světle 8 3. Do optické dráhy umístěte objektiv 10x. Preparát uchyťte, zafixujte v držáku a zaostřete na preparát pomocí kniflíku makro/mikroposunu 4. Nastavte kondenzor (zaostřením a vycentrováním) tak, aby světlo procházející kondenzorem vytvořilo obraz na správném místě (ve středu optické dráhy) povrchu preparátu. Nastavení kondenzoru 9 1. Zacloňte maximálně zorné pole. 2. Otáčejte kolečkem zaostření kondenzoru a vytvořte na povrchu preparátu obraz clony zorného pole. Do optické dráhy umístěte objektiv 40x. Zaostřete preparát knoflíky makro/mikroposunu. 3. Otáčejte centrovacími šrouby kondenzoru tak dlouho, až se clona zorného pole objeví ve středu zorného pole okuláru. Nejsnadněji toho dosáhnete, jestliže nastavíte aperturu clony zorného pole o trochu menší, než je zorné pole okuláru. 4. Nastavení aperturní clony 10 Nastavení aperturní clony kondenzoru určuje rozlišení, jas, kontrast a hloubku ostrosti. Zmenšení clony snížení jasu a rozlišení, zároveň zvýšení kontrastu a hloubky ostrosti Zvětšení clony zvýšení jasu a rozlíšení, zároveň snížení kontrastu a hloubky ostrosti Aperturní clonu kondenzoru je potřeba nastavit pro každý preparát a aplikaci zvlášť Optimální kontrast je dosažen, když bude aperturní clona kondenzoru zacloněna asi na 70 až 80 % maximální apertury objektivu. Nastavení clony zorního pole 11 Nastavení oblasti preparátu, která má být osvětlena Clona zorního pole by měla být trochu větší než zorné pole Příliš velká clona parazitní světlo, nežádoucí světelný závoj a znížení kontrastu • Prochází-li světelný paprsek anizotropní látkou, dochází u něho ke změně, které říkáme polarizace • Polarizační mikroskopie = využívá lineárně polarizované světlo získané pomocí polarizačních filtrů • Lineárně polarizované světlo -> s využitím 2 polarizačních filtrů • Polarizátor – vložený do optické osi za polní čočku osvětlovací soustavy • Analyzátor – vložený před okuláry • Anizotropní látka • Její optické vlastnosti se liší podle směru, kterým v ní světlo prochází • Schopnost rozdělit procházející světelní paprsek na dvé části (dvojlom) 12 Optický mikroskop s polarizací • Nastavíme-li polarizátor a analyzátor na největší jas, pak po vložení anizotropního objektu mezi tyto filtry nastane zeslabení obrazu a změní se jeho chromatičnost -> využití pro zobrazení struktur, které jsou při běžném pozorování neviditelné (hlavně pro pozorování stresových linií v dentinu) 13 Optický mikroskop s polarizací 14 Optický mikroskop s polarizací Aby jsme mohli pozorované struktury analyzovat, je nutné vytvořit si jejich obrazový záznam Nutné spojení kamery s mikroskopem – ideální trinokulárová hlava mikroskopu (2x okulár + 1x nadstavec na kameru) Potřebný software na digitální zpracování obrazu (NIS-Elements , Adobe Photoshop, ImageJ..) Digitální obraz = reprezentace skutečného objektu v počítači 15 Digitální mikrofotografie 16 3 tvrdé zubní tkáně: • Sklovina – kryje korunku • Dentin – tvoří hlavní hmotu zubu • Cement – kryje krček a kořen zubu Stavba zubu 17 Amelogeneze 18 Amelogeneze 19 Amelogeneze Mikroskopické markery rastu na zubech – povrch zubu 1. Perikymata - Na povrchu skloviny - Hlavně dětská dentice 20 2. Periadikulární proužky - Kořen - Nejsou viditelné na všech zubech (rozdílná tloušťka cementové vrstvy) 21 Mikroskopické markery rastu na zubech – povrch zubu 1. EDJ - Hranice dentin-sklovina 22 Mikroskopické markery rastu na zubech – histologický řez 2. Linie oddělující prismy - Prism boundaries - Od EDJ směrem ven - Důsledek amelogenezy 23 Mikroskopické markery rastu na zubech – histologický řez 2. Linie oddělující prismy - Pravidelné vlnění - Dekusace (hrbolek výrazně) - Hunter-Schregerovy proužky – skupinky různe se vlnících prizmat; koncetrovanější v namáhaných částech zubu 24 Mikroskopické markery rastu na zubech – histologický řez 3. Příčné linie - Prism cross striations - Napříč sklovinnými prizmaty - „Textilní vzor“ - V různých částech skloviny různě vyvinuty – obtížná identifikace napříč jedním prizmatem - Důsledek periodické denní sekrece matrix 25 Mikroskopické markery rastu na zubech – histologický řez 4. Retziusovy linie - Striae of Retzius - Diskontinuity ve sklovině - Nejlépe viditelné hned pod povrchem korunky a u dospělé dentice - Perkymata na povrchu 26 Mikroskopické markery rastu na zubech – histologický řez - Přesnejší odhad dožitého věku (nedospělí) - Studium rastu korunky – CFT - Stresové události a jejich chronologie - Studium periodicity mezi CS a dvěma RL - Periodicita variabilní mezi taxonomy i mezi jednotlivci ale individuálně je konzistentní - Vztah mezi velikostí těla a periodicitou (menší zvířata = kratší periodicita) 27 Histologický výbrus zubu • nepodléhají remodelaci -> záznam o překonaném stresu viditelný po zbytek života -> velmi dobrý zdroj informací o překonané stresové zátěži • odolnější vůči tafonomickým vplyvům • cirkadiánní záznam ve struktuře tvrdých zubních tkání je pozorovatelný i v dospělosti a umožňuje rekonstrukci chronologie vývoje • možnost rekonstruovat život minulých populací v archeologickém kontextu a poznávat evoluci lidského druhu v kontextu paleoatropologických nálezů • nutnost brát ohled na opotřebování korunky věkem • tvorba histologického preparátu je destruktivní metoda, nutná důkladná dokumentace vzorku (fotografická, 3D model, odlitek z pryskyřice) • časově a finančně nároční postupy 28 Histologický výbrus zubu 29 1. Výběr zubu a jeho dokumentace (fotografická, metrická, repliky, 3D model) 2. Zaznačení roviny řezu 3. Řezání, broušení, leštění na požadovanou tloušťku cca 100 μm Příprava histologického preparátu • Vývoj tvrdých zubních tkání probíhá v periodicky se opakujících intervalech -> v mikrostruktuře zubní skloviny a dentinu vnik charakteristických inkrementálních linií -> struktury ve sklovině a dentinu si vzájemně odpovídají • Inkrementální linie: • Krátkodobé – vznikají v časovém intervalu 24 hodin • Dlouhodobé – vznikají delší periodě (dny) 30 • Inkrementální struktury jsou lépe viditelné v zubech trvalé dentice, v dentinu jsou viditelné hůř než ve sklovině Mikrostruktura tvrdých zubních tkání • Individuálně konzistentní, ale vnitro- a mezidruhově variabilní periodicita • U člověka 6–12 dní, nejčastěji 8 nebo 9 dnů • Ve sklovině označované jako Retziusovy linie -> na povrchu korunky v oblasti laterální skloviny se projevují jako perykymata • V dentinu jako Andresenovy linie 31 Retziusovy linie Andresenovy linie Dlouhodobé inkrementální struktury Vznik v časovém intervalu 24 hodin = denní přírůstky • ve sklovině se označují jako příčné linie • v dentinu jako von Ebnerovy linie Jejich kvantifikace -> určení kolik dnů trvalo formování dané části zubu 32Příčné linie von Ebnerovy linie Krátkodobé inkrementální struktury Zubní sklovina je vysoce specializovaná tkáň a velmi citlivá na fyziologické a environmentální změny. V důsledku toho může být amelogeneze narušena systémovými vnějšími stresory, což vede k trvalým vadám skloviny Tato narušení se zaznamenávají na mikroskopické úrovni jako akcentované/stresové linie (AL) Jedná se o indikátory nespecifického stresu – u neznámých kosterních pozůstatkuů nelze spojit AL s konkrétní událostí 33 Indikátory vývojového stresu 34 Výjimku představuje jedna specifická, velmi výrazná akcentovaná linie vznikající při porodu – neonatální linie • umožňuje rekonstrukci chronologie vývoje • odhad dožitého věku a časování stresových událostí • pozorovatelná u všech prenatálně se vyvíjejících zubů = všechny zuby dočasného chrupu a většinou 1. trvalá stolička Červená linie – neonatální Zelená a modrá linie – stresové linie (AL) Neonatální linie Pomocí počtu, rozměrů a vzájemných vzdáleností inkrementálních struktur lze charakterizovat vývojové parametre jako: • Míra denní sekrece • Periodicita dlouhodobých inkrementů • Rychlost přirůstání kořene • Délka formování korunky/kořene zubu 35 Metoda odontochronologie Kvantifikací těchto proměnných lze určit rychlost a dobu utváření zubní korunky/kořene a charakter vývoje z hlediska životní historie. U nedospělých jedinců s neukončených vývojem chrupu v čase smrti zároveň a odhad dožitého věku Neonatální linie – určuje počátek kalkulace absolutního času uplynulého od porodu – získaná data lze zasadit do chronologického rámce a zjistit chronologii zubního výboje (věk v čase iniciace růstu korunky/kořene, délka formování korunky/kořene/ věk v čase ukončení formování korunky/kořene/zubu) nezávisle na referenčních sbírkách. Komplexnější hodnocení působení vývojového stresu a rekonstrukce chronologie stresových událostí 36 Metoda odontochronologie Míra denní sekrece (ang. Daily Secretion Rate – DSR) • Průměrná velikost přírustku skloviny za 1 den (v μm) v určité oblasti zubu Periodicita (v literatuře někdy Retzius periodicity – RP) • Počet denních přírůstků mezi dvěma Retziusovými liniemi Časování stresových událostí • počet dní uplynulých od jedné stresové události k události následující Délka formování korunky (angl. Crowt Formation Time – CFT) • Počet dní/roků, během kterých byla vytvořena celá korunka 37 Základní pojmy Praktické cvičení Zjistěte: 1. Periodicitu dlouhodobých inkrementálních struktur 2. Míru denní sekrece = denní přírůstek = DSR (Daily Secretion Rate) 3. Časování stresových událostí (chronologie) 4. Délku formování korunky • Zub -> Dolní trvalý řezák, archeologický nález, nedospělý jedinec (.tiff) 39 Kalibrace snímku • Otevřít soubor.tiff v ImageJ • pomocí funkce Straight line nakreslete úsečku spojující konce měřítka 40 Kalibrace snímku Analyze -> Set scale -> do kolonky Known distance vepište známou vzdálenost (200 μm) 41 1. Periodicita Spočítejte počet příčných linií (červená šipka) mezi vybranými dvěma Retiusovými liniemi (bílá šipka) 42 Počet měření: 5 v různych částech laterální skloviny 2. Míra denní sekrece Pro každou oblast naměřte délku několika skupin příčných linií v okolí prizmatu táhnoucího se od jedné stresové linie ku druhé: Otevřít ROI Manager -> zaškrtnout Show all a Labels 43 44 • Zmeřit délku vždy dvou denních přírustků v okolí prizmy (kliknutím na „t“ se měření uloží do ROI Manageru) • kliknout na Measure -> v tabulce Results ve sloupci Length jsou výsledné délky dvou denních přírustků • Vložit data do excelu a vypočítat průměrnou hodnotu jedného denního přírustku pro danou oblast • Segmented line -> vyznačit sklovinné prizma a zmeřit jeho délku (přes Measure), vydelit velikostí DSR pro danou oblast – zapsat do excelu do příslušné kolonky 2. Míra denní sekrece 45 Zelená a žlutá linie – akcentovaná/stresová linie Červená linie – sklovinné prizma Žluté úsečky s číslama – 2 po sebe jdoucí denní přírustky 3. Časování stresových událostí Čas mezi dvěma stresovými události v dnech -> vzdálenost po prizmě mezi dvěma vybranými stresovými liniemi podělená mírou denní sekrece 46 51 47 51 23 170 51 53 3. Časování stresových událostí 4. Délka formování korunky 48 Laterální část skloviny: •Spočítejte počet Retziusových liniív laterální částiskloviny po první výraznou stresovou linii Pomocí funkce Multi-point Tool vložte body na všechny Retziusovy linie dané části •Jejich počet vynásobte zjištěnou periodicitou 49 Hrbolková částskloviny: •Sečtěte zjištěné počty dní uplynulé mezi všemi stresovými událostmi Celková délka: •Součet počtu dní formování laterálnía hrbolkové části skloviny 4. Délka formování korunky Výsledky Zapsat do sešitu (.xls) 50 LiteraturaDEAN, M. C., 2000. Incremental markings in enamel and dentine; what they can tell us about the way teeth grow. In: M. TEAFORD, M. MEREDITH SMITH a M. FERGUSON, ed. Development, Function and Evolution of Teeth. B.m.: Cambridge University Press, s. 119–130 DIRKS, Wendy, Donald J. REID, Clifford J. JOLLY, Jane E. PHILLIPS-CONROY a Frederick L. BRETT, 2002. Out of the mouths of baboons: stress, life history, and dental development in the Awash National Park hybrid zone, Ethiopi HILLSON, Simon. Tooth development in human evolution and bioarchaeology. 1 st pub. Cambridge: Cambridge University Press, 2014. vii, 307. ISBN 9781107011335 HUPKOVÁ, Adela, KRÁLÍK, Miroslav, 2015. Mikrostruktura tvrdých zubních tkání. Výukový atlas a metodická příručka pro antropology FITZGERALD, Charles M. a Jerome C. ROSE, 2007. Reading Between the Lines: Dental Development and Subadult Age Assessment Using the Microstructural Growth Markers of Teeth. In: Biological Anthropology of the Human Skeleton. B.m.: Wiley-Blackwell, s. 237–263. ISBN 978-0-470-24584-2. FITZGERALD, Charles M. a Shelley R. SAUNDERS, 2005. Test of histological methods of determining chronology of accentuated striae in deciduous teeth. American Journal of Physical Anthropology. 127(3), 277–290. ISSN 0002-9483. Kolektív autorov (Držík, M – Plecenik, A – Zahoran, M – Chlpik, J – Mach, Ľ – Bohunický, B – Varga, P – Gregor, M – Anetta, M) 2008. Moderná mikroskopia a digitálne spracovanie obrazu. Skripta, Bratislava: FMFI UK. ISBN: 978-80-89186-37-2. [online] http://www.mikroskopia.sk/materials/skripta_mikroskopia.pdf MAHONEY, Patrick, 2012. Incremental enamel development in modern human deciduous anterior teeth. American Journal of Physical Anthropology. 147(4), 637–651. ISSN 1096-8644. Optoteam, s.r.o. 2004. Základní metody světelné mikroskopie [online] www.are.cz/data/file/zakladni_metody_svetelne_mikroskopie.pdf ŻĄDZIŃSKA, Elżbieta, Wiesław LORKIEWICZ, Marta KUREK a Beata BOROWSKA-STRUGIŃSKA, 2015. Accentuated lines in the enamel of primary incisors from skeletal remains: A contribution to the explanation of early childhood mortality in a medieval population from Poland. American Journal of Physical Anthropology. 157(3), 402–410. ISSN 1096-8644. 51