Základy molekulární biologie (přednáška JS 2020, 2 hod) prof. RNDr. Jiří Doškář, CSc. Molekulární biologie - předmět studia • Vědní obor zabývající se studiem vztahu struktury a interakcí biomolekul, zvláště informačních biomakro-molekul, k funkcím a vlastnostem živých soustav. • Cílem molekulární biologie je vysvětlit funkce a vlastnosti živých soustav strukturou a interakcemi jejich molekul (makromolekul). • Tento vztah vysvětluje z komplexního hlediska integrujícího fyzikální, chemické a biologické přístupy. Studium procesů, které probíhají v živých soustavách na molekulární úrovni a jimiž se realizuje genetická informace Definice pojmu „Molecular Biology" - is the study of the structure and function of biological molecules. - study of the molecular basis of life including the biochemistry of molecules such as DNA, RNA and proteins and the molecular structure and function of the various parts of living cells - a branch of biological science that studies the biology of a cell at the molecular level. Molecular biological studies are directed at studying the structure and function of biological macromolecules and the relationship of their functioning to the structure of a cell and its internal components ... - the science of studying the genetic composition and mechanism of living organisms at the molecular level. The molecular studies of all other organic molecules like proteins, fats, and carbohydrates is called biochemistry. - the study of molecules that are found in cells. - field of biology that concerns itself with understanding the interactions among the molecules of life. - a general term referring to study of the structure and function of proteins and nucleic acids in biological systems. Biochemie se zabývá chemickými pochody v živých organismech. Předmětem studia biochemie je struktura a funkce základních stavebních kamenů živé hmoty jako jsou například cukry, tuky, bílkoviny, nukleové kyseliny a další biomolekuly. Vznik a vývoj molekulární biologie umožnily tři základní objevy 1. Poznání struktury a funkce nukleových kyselin (DNA a RNA) 2. Rozluštění genetického kódu 3. Poznání procesů, jimiž se realizuje genetická informace (transkripce, translace, regulace genové exprese) Specifické rysy historie vzniku molekulární biologie 1. Zaměření molekulární biologie na řešení genetických problémů 2. Návaznost molekulární biologie na biofyziku, fyzikální chemii, biochemii, mikrobiologii a genetiku 3. Vznik molekulární biologie v podobě molekulární genetiky syntézou funkcionalistické a štrukturalistické koncepce ve výzkumu proteinů a nukleových kyselin Vznik molekulární biologie v podobě molekulární genetiky syntézou funkcionalistické a štrukturalistické koncepce ve výzkumu proteinů a nukleových kyselin Strukturalisté (fyzici, chemici) - zaměření na objasnění struktury biomakromolekul (proteinů, NK) (nezajímali se o funkci biomakromolekul ani o genetické problémy) W. T. Astbury J.D. Bernal L. Pauling E. Chargaff M.H.F. Wilkings F. H.C. Crick Funkcionalisté (biochemici, mikrobiologové, genetici) - zaměření na vysvětlení, které biomakromolekuly jsou nositeli genetické informace a jaké funkce plní (objektem studia byly bakterie a bakteriofágy) M. Delbrück, E. Schrödinger, G.W. Beadle, E.L. Tatum O.T. Avery, CM. MacLeod, M. McCarty, J. Lederberg, A.D. Hershey, J.D. Watson Rosypal S.: K historii pojetí molekulární biologie. DVT, 18: 193-209,1985. Důležité etapy ve vývoji molekulární biologie • 1944 - transformace bakterií pomocí purifikované DNA • 1953 - model struktury DNA (J. Watson, F. Crick, M. Wilkins) • 1956 - genetická informace v DNA je zapsána pořadím bází • 1958 - při replikaci se oddělují komplementární vlákna DNA • 1958 - izolace DNA-polymerázy I a syntéza DNA in vitro • 1958 - vyhlášení ústředního dogmatu molekulární biologie • 1960 - objev mRNA a důkaz její funkce • 1961 - mRNA použita k rozluštění genetického kódu • 1961 - experimentální důkaz ústředního dogmatu MB • 1961 - postulování operonové teorie - regulace genové exprese • 1966 - kompletní vyřešení genetického kódu • 1970 - izolace prvního restrikčního enzymu • 1970 - objev reverzní transkriptázy u retrovirů • 1972 - příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro • 1973 - začátek klonování genů - základ Gl Důležité etapy ve vývoji molekulární biologie • 1975 - Asilomarská konference-moratorium na práce s rekombinantní DNA • 1977 - první rekombinované molekuly nesoucí savčí geny • 1977 - objev složených genů - exony/introny - sestřih pre-mRNA • 1977 - zavedení metod sekvenování DNA • 1981 - objev katalytické aktivity RNA - ribozymy • 1982 - komerční výroba lidského inzulínu v bakteriích • 1983 - stanovení sekvence DNA bakteriofága A - zahájení projektů sekvenování genomů modelových organismů • 1983 - zavedení metody PCR (polymerázová řetězová reakce) • Genomická a postgenomická éra • 2003 Stanovení kompletní sekvence lidského genomu • 2000 (2012) zavedení metod pro editaci genomů Současná etapa molekulární biologie • Oblast výzkumu O analýza genomu (genomika) a proteomu (proteomika) - postgenomická etapa O transkriptomika, metabolomika, infektomika, sekretomika "...omics" O studium regulace genové exprese a procesů diferenciace buněk (buněčný cyklus, signální drahý, poruchy regulace, výzkum kmenových buněk) O neurobiologie O Využití metodologie mol.biologie v řadě oborů: molekulární mikrobiologie, virológie, imunologie, fyziologie, antropologie, evoluce... • Praktické aplikace O genové inženýrství - moderní biotechnologie, příprava transgenních a geneticky modifikovaných organismů a nových látek cílenou změnou genů O editace genomů - cílené změny v genomech in vivo, systém CRISPR/Cas O molekulární diagnostika infekčních, dědičných a nádorových chorob, nové způsoby jejich lecby O farmakogenomika - léky „šité na míru" O genové terapie = léčba genetických onemocnění Sylabus přednášky ze Základů molekulární biologie 1. Úvodní přednáška. Předmět studia molekulární biologie, její vznik a hlavní etapy vývoje. Struktura a funkce nukleových kyselin. 2. Základní pojmy molekulární biologie: Genetická informace, genetický kód, definice genu, typy genů. 3. Struktura a informační obsah genomů. 4. Replikace DNA (zúčastněné enzymy a mechanismus). 5. Transkripce u prokaryot a eukaryot, posttranskripční úpravy RNA. 6. Translace, translační aparát, kotranslační posttranslační procesy, samosestavování 7. Regulace genové exprese u prokaryot a eukaryot, struktura a vlastnosti regulačních molekul a regulačních sekvencí 8. Pozitivní a negativní regulace, atenuace, specifické rysy regulace genové exprese u eukaryot. Regulace na posttranskripční a translační úrovni. 9. Molekulární základ tvorby imunitních molekul. 10. Změny genetické informace: mutace, obecná a místně specifická rekombinace. Reparace mutačně poškozené DNA. 11. Mobilní genetické elementy (prokaryotické a eukaryotické transpozony, retrotranspozony). 12. Základy genového inženýrství, příprava transgenních organismů a jejich využití, mutageneze in vitro, editace genomů, příprava biopreparátů metodami Gl, genové terapie Doporučená literatura • Rosypal S. a kol.: Úvod do molekulární biologie. l.-IVdíl. Brno 1999-2002 (třetí vydání). 2006 - I. díl (čtvrté vydání) • Rosypal S. a kol.: Terminologie molekulární biologie, Brno 2001. • Šmarda J. a kol.. Metody molekulární biologie, Brno, 2005. • Lewin B. Genes VIII, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 2004. • Alberts et al.: Molecular biology of the cell. Garland Sei. 2008,2015 • Alberts a kol: Základy buněčné biologie, Espero, 2000, 2005. • Clark D.: Molecular biology, Elsevier, 2005. • Watson J.D. et al., Recombinant DNA, 2nd ed., W.H.Freeman, New York 1992. • Zlatanova J., van Holde K.E.: Molecular Biology - Structure and Dynamics of Genomes and Proteomes.Garland Science, 2016. • Snustad P.P., Simmons M.J.: Genetika (překlad originálu Principles of Genetics), ML) Brno, 2009 (nové vydáni 20171 • Předlohy k přednáškám: IS MU TEilíVJJí lÜLOGIE 1VJ ÜLEK ÜLAIü íí jjJ OL O GJL Stanislav Rosypal &kol. České odborné termíny, jejich definice a anglické ekvivalenty BRNO 2001 PRVNÍ VYDÁNÍ MOLECULAR BIOLOGY Structure and Dynamics of Genomes and Proteomes Jordanka Zlatanova Kensal E. van Holde GENETIKA Nové vydání 2017 D. Peter Snustad Michael J. Simmons Druhé, aktuafizované vydaní METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Jan Šmarda, Jiří Doškář, Roman Pantůček, Vladislava Růžičková, Jana Koptíková Klasické experimenty v genetike Na ceste k odhaleniu tajomstiev dedičnosti Autoři: PrF UK Bratislava ed. Prof. Ľ. Tomáška Vydáno v r. 2015 20 Důkaz, že genetická informace je uložena v DNA Nepřímé důkazy: - DNA se nachází jen V chromozomech; RNA a proteiny jsou i v cytoplazmě - Množství DNA v somatických buňkách koreluje s počtem sad chromozomů; v pohlavních buňkách je množství DNA poloviční - DNA je stabilnější než RNA nebo proteiny Přímé důkazy: - Transformace u Streptococcus pneumoniae - změna virulence - Analýza bakteriofága T2 - do bakteriální buňky vstupuje jen DNA, nikoliv proteiny (značení radiozotopy P a S) - U viroidů a některých virů je nositelkou genetické informace RNA -experiment s virem TMV Experiment demonstrující transformaci bakteriálních buněk Streptococcus pneumoniae (Griffith 1928) S buňky = virulentní, tvoří hladké kolonie, R buňky = avirulentní, tvoří drsné kolonie Transformace R buněk myš umírá na pneumonii myš je zdravá myš je zdravá myš umírá na pneumonii hladké kolonie drsné kolonie žádné kolonie drsné a hladké kolonie Princip transformace bakteriálních buněk Usmrcená Recipientní buňka R donoJS!? buftka S přij ímá volnou DNA ^lAk DNA ŠĚKĚŠĚSĚm ^ l MMM% -► i (( ^^^^llllf Lýze buňky, uvolnění ^^^^^^P DNA, RNA a proteinů Začlenění přijaté DNA do genomu recipientní buňky, změna znaku (= transformace) Důkaz, že chemickou substancí zodpovědnou za transformaci buněk R na S je DNA (O. Avery, C. Mac Leod, M. McCarty 1944) Přidání RNázy Extrakt z buněk S (obsahuje DNA, RNA a proteiny) • R kolonie • S kolonie Přidání proteázy Přidání DNázy Kultivace s buňkami R Potomstvo R buněk vytváří R kolonie a S kolonie (důsledek transformace) Potomstvo R buněk vytváří pouze R kolonie Závěr: transformující aktivitu vykazuje pouze DNA, ne RNA nebo proteiny Struktura DNA navržená Watsonem a Crickem (1953) Vlastnosti navržené struktury DNA umožňují: 1. Replikaci spočívající v párování komplementárních bází 2. Spontánní mutabilitu v důsledku tautomerie bází 3. Kódování genetické informace ve formě pořadí (sekvence) bází Analýza rentgenogramů krystalických preparátů DNA (M.Wilkins, R. Franklinová, R. Gosling) Dceřiný duplex Mateřský duplex Zrep li kované řetězce Nukleové kyseliny • DNA - tvoří génom prokaryot, eukaryot a DNA-virů • nDNA - jaderná, gDNA - genomová, mtDNA - mitochondriová, ctDNA -chloroplastová, pDNA - plazmidová, recDNA - rekombinantní, rDNA -ribozomální, rDNA, aDNA • cDNA (copy DNA, complementary DNA) - komplementárni; • dsDNA - dvou řetězcová, ssDNA - jednořetězcová, cccDNA - kovalentně uzavřená kružnicová, ocDNA- otevřená kružnicová, linDNA - lineárni • A-DNA, B-DNA, Z-DNA - konformace ovlivněná sekvencí a prostředím • RNA - tvoří genom RNA-virů, u buněčných organismů je složkou ribozomů a plní různé funkce při přenosu, a regulaci realizaci genetické informace • mRNA - mediátorová, hnRNA - heteronukleární, tRNA - transferová, rRNA - ribozomová, tmRNA - transferová-mediátorová RNA, snRNA -malá jaderná, snoRNA - malá jadérková, scRNA - malá cytoplazmatická, gRNA - řídící, crRNA - crisper-ová, • Ribozymy: RNA s katalytickou funkcí (např. introny, siRNA, miRNAaj) Složení nukleových kyselin Nukleotid O kyselina fosforečná O pentóza • ribóza • deoxy ribóza O organická báze • purinové báze • adenin • guanin • pyrimidinové báze • cytozin • ty mi n • u raci l N-glykozidická vazba Nukleozid = pentóza-"Org. báze Kys. deoxyribonukleová O kys. fosforečná O deoxy ribóza O adenin, guanin, cytozin, tymin* Kys. ribonukleová O kys. fosforečná O ribóza O adenin, guanin, cytozin, uracil* *modifikace bází (např. metylace) Organické báze • Adenin = 6-aminopurin • Guanin = 2-amino-6-oxopurin • Cytozin = 4-amino-2-oxopyrimidin • Tymin = 2,4-dioxo-5-metylpyrimidin • Uracil = 2,4-dioxopyrimidin P u ri nové báze Pyrimidinové báze pyrimidin H Pentózy nukleových kyselin RNA DNA 5HO-CH2 B-D-ribóza B-D-ribofuranóza 5HO-CH2 B-D-2-deoxyribóza 2-deoxy-B-D-ribofuranóza Nukleotidy (nomenklatura) NH NH N N N 5' | HO — P —O OH N N CH H H H/H 3'OH H2' OH HO—PO — CH^ N H H H OH H 2' -deoxyadenozin-5' -monofosfát 2' -deoxycytidin-5' -monofosfát -difosfát, -trifosfát ATP, GTP Polynukleotidový řetězec • Významné strukturní rysy: 05' - a 3' - konec polynukleotidového řetězce O Páteř polynukleotidu (pentózafosfátová kostra, cukr-fosfátová kostra) O Prodlužování (syntéza) polynukleotidového řetězce -probíhá vždy ve směru 5-3' Část polynukleotidového řetězce DNA 5 -konec N N <- N-glykozidická vazba -fosfodiesterová vazba 3 -konec páteř polynukleotidu cukrfosfátová kostra Strukturní úrovně DNA Polydeoxyribonukleoti- -► primární struktura dový řetězec i dvoušroubovice DMA sekundární struktura i nadšroubovicové vinutí nadšroubovice DNA terciární struktura superhelix nadšroubovice relaxovaná DNA kružnicová nebo lineární 'zrušení nadšroubovicového vinutí Párování bází párování bází = spojování protilehlých bází vodíkovými vazbami a) mezi dvěma řetězci = duplex b) mezi třemi řetězci = triplex c) mezi čtyřmi řetězci = kvadruplex Watsonovo-Crickovo párování bází adenin (aminoforma) ty min DNA (ketoforma) Watsonovo-Crickovo párování bází N 0 NH H-N N N H N N —H - -0 H guanin (ketoforma) N H cytozin (aminoforma) Watsonovo-Crickovo párování bází adenin uracil (aminoforma) (ketoforma) Charakteristika dsDNA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. společná osa komplementarita řetězců vnitřní část tvoří báze AT a GC páteř - osa = 1 nm antiparalelizmus = směr fosfodiesterových vazeb 5'-3' a 3'-5' Chargaffova pravidla A+G T+C = 1 G+C A+T je ruzny o ✓ planami charakter bazi menší a větší žlábek = místa vazby proteinů k DNA 3+9 12 AGGGGGGGAAGG TCCCCCCCTTCC punny pyrimidiny 3+9 12 9+9 = 18 3+3 6 = 1 je různý (%GC) Obsah bází v DNA různých organismů dsDNA < bacteriophage cX174 24.0 233 21.5 312 44.8 0.77 1X8 189 Escherichia co/i 23.8 26.8 26.3 23.1 532 1.03 \C2 1.02 Mycobacterium tuberculosis 15.1 34.9 35.4 14.6 703 1.03 0.S9 1.00 yeast 31.7 18.3 17.4 32.6 35.7 0.97 '.C5 1.00 30.7 19.6 20.2 29.5 39.8 1.03 0.S7 1.01 corriíVnaize 26.8 22.8 23.2 27.2 46.1 0.99 0.58 3.98 ca f 27.3 22.5 22.5 27.7 45.0 0.99 1.(0 3.99 pig 29.8 20.7 20.7 29.1 41.4 1.02 1.(0 1.01 hijTiar 293 20.7 20.0 30.0 40.7 0.98 1.(4 1.00 Plasmodium falciparum (GC% = -20%) Streptomyces coelicolor GC% =72%) Sekundární struktura DNA (schéma dvoušroubovicové DNA - konformace B) 10,34 vzdálenost páteře od osy vzdálenost mezi dvěma pary bazi nm 3,4 nm v jeden závit C 10,5 bp Velký a malý žlábek na dsDNA Rekogniční kód DNA INTERAKCE DNA S PROTEINY c G aO-#CK> T A G C TrOO*i> A T G A velky zlabek malý žlábek velký žlábek ch3 q h-n í KEY; = H-bond acceptor = H-bond donor O-**>■—« O = methyl group maly zlabek Antiparalelismus komplementárních řetězců dsDNA = opačný směr fosfodiesterových vazeb 5'-konec 3'-konec Toh oh a 3'-konec deoxyribóza fosfodiesterová vazba p 5'-konec Vinutí dvoušroubovice DNA • Vinutí = mnohonásobné otáčení jednoho řetězce kolem druhého • Vinutí může být pravotočivé nebo levotočivé Vinutí dvoušroubovice DNA Konformace dvouřetězcové DNA (RNA) • Konformace = prostorové uspořádání biomakromolekuly do struktury, která je za daných podmínek energeticky nejvýhodnější • Konformace DNA závisí na: O nukleotidové sekvenci O obsahu vody v prostředí O iontové síle prostředí Konformace dsDNA Á-DNÁ B-DNÁ menši žlábek menši žlábek vetsi žlábek vetsi žlábek menši vetsi žlábek A, B = pravotočivá A-DNA • dsDNA při vysoké konc. solí nebo dehydrataci • dsRNA, DNA/RNA hybrid, žiábek Z-DNA vysoké konc. solí úseky obsahující (GC)n nebo (GT)n z-DNA z = levotočivá Terciární struktura DNA • Terciární struktura dsDNA = nadšroubovice • Vzniká zavedením dalšího vinutí (záporného nebo kladného) do dvoušroubovice. • Nadšroubovice se může vytvářet jak z relaxované uzavřené kružnicové DNA, tak i z lineární DNA • Záporné vinutí vzniká odvinováním dvoušroubovice (ubíráním závitů, podvinutí), kladné vinutí jejím svinováním (přidáváním závitů, převinutí). Konformace dvou řetězcových kružnicových molekul DNA Kovalentně uzavřené kružnicové nadšroubovice otevřená kružnicová molekula (OC-kružnice) ^ zlom v jednom řetězci Konformace dvou řetězcových molekul DNA Lineární (LIN) (b) Otevřená kružnicová DNA (OC forma) superhelikální kovalentně uzavřená kružnicová molekuly (CCC forma) (OC forma) (CCC forma) DNA s různým stupněm superhelicity -► Zvyšující se počet nadšroubovicových závitů Přechod relaxované DNA do nadšroubovicové levotočivá pravotočivé solenoidové nadšroubovice smyčky Nadšroubovicové a relaxované oblasti v lineární dvouřetězcové DNA závity solenoidové relaxovaná nadšroubovice smyčky oblast Eukaryotická DNA, která je lineární a dvou řetězcová, se váže k proteinovému lešení. Tvoří se v ní závity nadšroubovice, solenoidové smyčky a také relaxované oblasti. Parametry nadšroubovice L = T + W I i i celkové číslo vinutí dvoušroubovicovéčíslo nadšroubovicové číslo I I l Cef Kový po čet zá vi- Počet závitů či přehří- Počet nacfš roub ovico-tů či překřížení jed- zení jednoho řetězce vých závitů čipřekří-noho řetězce druhým druhým v dvoušroubo- žení dvoušroubovice v nadšroubovici. vici. v nadšroubovici. T a L jsou kladná čísla W je záporné, když vyjadřuje počet záporných nadšroubovicových závitů, nebo kladné, jestliže vyjadřuje počet kladných nadšroubovicových závitů Příklad vztahů mezi veličinami L,TaW Přechodné stavy - vzniká pnutí volné lineární dsDNA volné konce L-16; T = 16; W = 0 konce xoocooooooooooocx 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 1213141516 počet závitů Spojení relaxovaná kružnicová dsDNA-*- volných---" 15 16 -j konců. Upevnění volných konců. upevněný ■konec upevněný konec. a vy ^y* částečně odvinutá kružnicová dsDNA Odvinutí 4-šesti závitů. Spojení obou konců. Uvolnění 4 pnutí. nadšroubovice L = 10 Vnesení záporného nadšroubovicového vinutí L se sníží o počet nadšroubovicových závitů Přechod relaxované uzavřené dsDNA do nadšroubovice nebo toroidní (solenoidní) dsDNA Uzavřená relaxovaná Zavedení záporného nadšroubovicové-ho vinutí. Ubírání závitů (odvinování). Záporná nadšroubovice Má záporné vinutí. Je pravotočivá. Proti relaxované dsDNA má nižší hodnotu L. LL0 pravotočivá toroidní (solenoidní) dsDNA L = celkové číslo vinutí po svinování nebo odvinování L0 = celkové číslo vinutí před svinováním nebo odvinováním Účinek topoizomerázy I dsDNA Vytvoření zlomu Přesunutí druhého v jednom řetězci řetězce přes zlom topoizomeráza I zlom = přerušení fosfodiesterové vazby mezi sousedními bázemi Mechanismus účinku topoizomeráz I a II typu Nadšroubovicové uspořádání dsDNA Kružnicová uzavřená Nadšroubovicová Nadšroubovicové uspořádání DNA DNA (relaxovaná) DNA (negativní) - bakteriální chromozom Typy sekvencí v genomech • Jedinečná DNA sekvence: ....AATGCTGATGTCTGACTCGGA... • Repetitivní (opakující se) sekvence neboli repetice (jednotka repetice, délka jednotky repetice, četnost repetice). ATG...ATG....ATG....ATG... (jednotka = ATG, délka = 3 nukleotidy, četnost = 4x) • Tandemová repetice ..ATGCATGCATGC. • Přímá repetice (5' ....ATGC.....ATGC.....3') opakuje se na temže řetězci ve stejném směru (5'_» 3') • Rozptýlené repetice - stejné nebo velmi podobné sekvence lokalizované na různých místech genomu (chromozomech) -často transpozony Obrácená repetice (opakuje se na druhém řetězci v obráceném směru - potenciál pro vytvoření vlásenky nebo vlásenky se smyčkou) 5'..jATXjCGCAk.J'__► palindrom (—►vlásenka) 3...TACGCGTA...5' 5'...ATGCXXXXXGCAT...3'__► vlásenka se smyčkou 3'.. TACG Y Y YYYCGTA... 5' (na dsDNA vzniká křížová struktura) • Dlouhá koncová repetice (sekvence LIR) 5'-ATGC...GCAT.........................ATGC...GCAT-3' 3' -TACG...CGTA.........................TACG...CGTA-5' LTR = long terminal repeat (madam; Karla zamazal rak; TAHAT) (a dál vidí lítat netopýry potentát i lid i vláda) palindromy Schéma vlásenkových struktur DNA (RNA) Vlásenkové struktury se vytvoří na jednom řetězci DNA v místech, kde se vyskytují obrácené repetice. atcta fagat obrácené repetice atcta [tccag ťagat vlásenka vlásenka se smyčkou a t c t a t a g a t (Tc-a T. a T C T a T a g a T Vznik křížových struktur křížová struktura bez smyčky TCTATAGA ...... li AGATATCT palindrom 'A T C T A G A T křížová struktura se smyčkou ATCTA fCCAG ŤAGAT i i i i i i i i i i i i i i r TAGAT KGGTC ATCTA A T C T A T A Denaturace a renaturace dsDNA • denaturace dsDNA = přechod dsDNA na ssDNA, opačný pochod = renaturace • k denaturaci dsDNA dochází zvyšováním teploty roztoku, k renaturaci snižováním teploty (nebo změnou dH prostředí z neutrální hodnoty na alkalickou nebo 25°C. Ař25 260 = aDSOrDance roztoku DNA pri t = 25°C. Absorbance se stanoví při 260 nm. 50 % molekul DNA zdenaturováno 50 60 70 80 Tm90 m 100 teplota roztoku DNA (°C) V definovaném roztoku např. platí, ze Tm= 69,3 + 0,41 (GC). Odtud GC = Tm ' 69,3 .I 0,41 GC = molární podíl guaninu a cytozinu v DNA, 69,3 a 0,41 jsou empiricky stanovené koeficienty; pro poly (AT) Tm= 69,3. Další metody stanovení %GC Ultracentrifugace v CsCl HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) Denaturace, renaturace a hybridizace molekul dsDNA molekuly dsDNA denaturace molekuly ssDNÁ | | renaturace 1 hybridizace molekulární reasociace lili + | | hybridizace homologické DNA Čím více se hybridizující molekuly shodují v sekvencích neboli čím vyšší je jejich sekvenční homologie, tím je větší pravděpodobnost jejich hybridizace. Výsledek hybridizace DNA různých organismů drosofíla člověk šimpanz nízká vysoká sekvenční homologie