Genové inženýrství Genové inženýrství se zabývá vytvářením pozměněných či nových genů a jejich zaváděním do organizmů s cílem rekonstruovat jejich genetickou výbavu. Metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro (zejména klonování genů a jejich cílené úpravy). Cílené změny v genetické informaci lze provádět také in vivo (editace genomů). Objevy, které umožnily cíleně manipulovat s DNA  restrikční endonukleázy a další enzymy  rozštěpení DNA v přesně definovaném místě  spojení dvou cizorodých DNA (DNA z různých organismů)  syntéza DNA ve zkoumavce  sekvenování DNA  stanovení molekulární struktury genu  klonování genů  zavedení genu do nepříbuzných organismů  (překonání mezidruhových barier)  pomnožení genu do neomezeného množství  cílené zavádění mutací do genu  studium projevu pozměnených genů (mutace funkce) Etapy vzniku a vývoje genového inženýrství 1965 – objev plazmidů 1970 – izolace prvního restrikčního enzymu 1972 – příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro 1973 – začátek klonování genů 1975 – Asilomarská konference 1977 – první rekombinované molekuly DNA nesoucí savčí geny 1977 – sekvenování DNA 1978 – příprava lidského inzulinu v bakteriích (od r. 1982 vyráběn komerčně) **** mutageneze in vitro – proteinové inženýrství **** příprava transgenních organismů (rostliny, živočichové) 1980 – genové terapie 1983 – objev a zavedení PCR 1997 – klonování živočichů Po roce 2000: editace genomů - rekombinantní meganukleázy Využití genového inženýrství - Základní výzkum: studium struktury a funkce genů a genomů - Praktické aplikace:  Příprava látek významných v lékařství, zemědělství a průmyslu  vnášení cizorodých genů do nepříbuzných organizmů a získávání produktů ve velkém množství - překonání reprodukčních barier  Příprava látek s novými vlastnostmi pozměňováním stávajících nebo vytvářením nových genů - enzymy, protilátky, vakcíny aj.  Pozměňování a zlepšování vlastností organizmů  příprava mikroorganizmů pro biotechnologie,  zvyšování výnosů kulturních rostlin a užitkovosti hosp. zvířat (odolnost vůči chorobám, škůdcům nebo zevním vlivům, produkce cizích látek v tělech rostlin a zvířat)  Genová terapie - léčba genetických chorob transformace elektroporace infekce mikroinjekce nastřelení Cizorodá DNA Klonování genů pomocí vektorů Klonování genů pomocí PCR Cizorodá DNA Klonovaná cizorodá DNA Rekombinantní molekula DNA Selekční marker Příprava rekombinantních molekul DNA Štěpení vektoru restrikční endonukleázou, spojení vektoru a cizorodé DNA enzymem DNA-ligázou Vektor (plazmidový) Konstrukce (lidské) genomové knihovny © Espero Publishing, s.r.o. Soubor klonovaných fragmentů genomové DNA, které dohromady reprezentují celý genom příslušného organismu. Mutageneze in vitro site-directed mutagenesis místně cílená (řízená) mutageneze lokalizovaná mutageneze Mutace se vnášejí do izolované DNA (= in vitro) typy mutací: substituce, delece, inzerce Cíle: analýza vztahu mezi strukturou a funkcí NK  Objasnění funkce genů a regulačních oblastí  Cílení změny aminokyselin v proteinech  Příprava proteinů s novými vlastnostmi (proteinové inženýrství)  Příprava transgenních organismů DNA (genotyp) fenotyp klasická genetika reverzní genetika reverzní genetika, genetika „naruby“ Mutageneze in vitro Mutageneze in vitro náhodná cílená manipulace s restrikčními místy inzerce linkerů chemická mutageneza inkorporace chybných bazí vyhledání genu nebo funkčních oblastí na DNA oligonukleotidová mutageneza (umístění do konkrétního místa) syntéza genů (kazetová mutageneza) záměny bazí nebo kodonů cílené změny struktury proteinů GEN mutace Způsoby používané při mutagenezi in vitro 1. Manipulace s restrikčními místy a enzymatické úpravy DNA 2. Oligonukleotidová mutageneze (extenze primeru) 3. Chemická mutageneze 4. Kazetová mutageneze 5. Metody založené na PCR 6. Mutageneze pomocí supresorových tRNA Stanovení sekvence pozměněného genu Testování funkce pozměněného genu Obecná strategie při mutagenezi in vitro Vytvoření mutace Vytváření inzercí nebo delecí v sekvenci genu Vytváření mutací v restrikčním místě  exonukleáza  výběr dNTP Substituce delece inzerce GGT A CTCT CCA C GAGT CCACGAGT T GGTACTCT GGTGCTCT CCACGAGT GGT A CTCT CCA T GAGT Mutageneze pomocí mutantních oligonukleotidů Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů Rodičovská (nemutantní) DNA Nově syntetizovaná (mutantní) DNA Nově syntetizovaná mutantní DNA Mutagenní oligonukleotid Dvojřetězcová heteroduplexní DNA mutantní homoduplex Přenos do E. coli rodičovský homoduplex „umělý“ gen Kazetová mutace 16 Editace genomů Genome editing, or genome editing with engineered nucleases (GEEN) Postupy genového inženýrství, při nichž se do vybraného místa v cílové DNA pomocí uměle připravených nukleáz (tzv. molekulárních nůžek) vnáší inzerce, delece a nebo se stávající sekvence nahrazuje za jiné (náhrada alel). Tyto nukleázy vytvářejí na určených místech genomu dvouřetězcové zlomy (DSBs: double-stranded breaks), čímž vyvolávají přirozené endogenní buněčné procesy vedoucí k reparaci zlomů: a) Homologní rekombinací (HR) HDR = homology directed recombination b) Nehomologní spojování volných konců (NHEJ: nonhomologous end-joining) Editace genomů (chromosome enginnering) Cílový gen Delece/inzerce Nehomologní spojování konců Dvojřetězcový zlom Homologní rekombinace Náhrada sekvence donorovou DNA endonukleáza Nukleázy používané pro editaci genomů -Meganukleázy -ZNF -TALEN -CRISPR/Cas 18 Začlenění úseku cizí DNA Úprava CRISPR RNA Transkripce lokusu CRISPR Zasažení cizí DNA nasměrované crRNA CRISPR - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cas – CRISPR-associated system (Cas9 – endonukleáza) Bakteriofág, plazmid, aj. Proteinové inženýrství Cíl: změna struktury a funkce proteinů prostřednictvím technologie rekombinantní DNA  změny vazebných oblastí proteinů  termostabilita  rychlost a substrátová specifita reakcí  citlivost k oxidaci a toxickým látkám Předpoklady pro vytváření funkčních proteinů klonovaných genů v nepříbujzných organismech 1. Transkripce genu  přítomnost funkčních regulačních oblastí pro transkripci  promotor, terminátor 2. Translace přepisu genu  přítomnost signálů pro translaci  SD, iniciační a terminační kodon  výběr kodonů pro tRNA daného organizmu 3. Posttranslační modifikace 4. Transport proteinu  signální sekvence funkční v daném hostiteli Zajištění exprese cizorodých genů bakteriální gen eukaryotický gen P RBS/transport kódující oblast T P/E RBS/transport kódující oblast cDNA Syntéza DNA de novo Hybridní (chimerický) gen Fúzní protein zralý proteinštěpení, purifikace prokaryotická část eukaryotická část Gen pro inzulin pre-mRNA mRNA pro pre-proinzulin pre-proinzulin (preprohormon) proinzulin (prohormon) aktivní inzulin (zralý hormon) DNA řetězec C řetězec C řetězec C řetězec B řetězec A řetězec A řetězec A řetězec B Enzymové štěpení řetězec B pre-sekvence mRNA ribozom Translace Sestřih Transkripce Příprava lidského inzulinu v bakteriálních buňkách CNBr štěpí peptidovou vazbu následující za metioninem Transformace E. coli Působení kyanbromidem (CNBr) Purifikace řetězců A a B b-galaktozidáza Purifikace fúzního proteinu B-gal-inzulín Kultura buněk Aminotermální část zralého řetězce B Vytvoření aktivní formy inzulínu disulfidová vazba Aktivní inzulín řetězec Břetězec A řetězec Břetězec ABakteriální promotor Infekční částice HBV Plášťový protein Klonovaná DNA viru HBV Izolace sekvence kódující HBsAg Kvasinkový promotor transkripce Vnitřní protein Ligace Počátek replikace pro kvasinky Počátek replikace pro bakterie Kvasinkový expresní vektor Kvasinkový terminátor transkripce Transformace kvasinkových buněk Selekce buněk, které obsahují plazmid Kultura buněk ve fermentoru Shromáždění buněk centrigací Rozbití kvasinkových buněk Purifikace částic HBsAg Výhody: 1. Přesně definovaný antigen 2. Stabilní, skladovatelný 3. Nevyvolává vedlejší účinky Nevýhody 1. Drahá purifikace 2. Odlišná konformace proteinu Příprava podjednotkové vakcíny viru hepatitidy B (HBV) ve kvasinkách Příprava humanizovaných protilátek Myší protilátka Chimerická protilátka Humanizovaná protilátka Variabilní, konstantní a hypervariabilní oblasti jsou z protilátek myši Konstantní oblast je z lidské protilátky, variabilní a hypervariabilní oblasti jsou z myši Hypervariabilní oblasti jsou z myších protilátek, ostatní jsou lidské CDRs -complementarity determining regions Protilátka vázající se na antigeny na povrchu tumorových buněk Protilátka vázající se na antigen na povrchu T buněk manipulace na úrovni cDNA rekombinace protilátka s dvojí specifitou Tumorová buňka T buňka T buňka usmrcuje tumorovou buňku Protilátka s dvojí specifitou Jednořetězcové protilátky a imunotoxiny Záměna peptidového linkeru za disulfidický můstek několikanásobně zvyšuje stabilitu scFv a tím zlepšuje jeho terapeutické využití - exotoxin A Pseudomonas - difterický toxin - ricin Protinádorové působení (vazba na receptory a povrchové proteiny nádorových buněk) Např. fúzní protein HER2-Ig + exotoxin Pseudomonas Pbs21 (plasmodium) + Shiva-1 A B human epidermal growth factor receptor 2 -Approximately 30% of breast cancers have an amplification of the HER2/neu gene or overexpression of its protein product. Přenos cizích genů do rostlin pomocí Ti-plazmidu Živné medium s růstovými faktory Transgenní rostlina přenášející geny do potomstva Protoplast disky Ti-vektor nesoucí cizí gen T-DNA Geny pro katabolismus opinů Struktura Ti-plazmidu A. tumefaciens Část plazmidu přenášená do rostliny Geny pro přenos T-DNA do rostlinných buněk Geny zodpovědné za transformaci rostlinných pletiv Geny zodpovědné za tvorbu opinů v rostlinných buňkách 25 bp LB 25 bp RB = sekvence nezbytná pro začlenění T-DNA do genomu rostliny Transformace rostlin navozená Ti-plazmidem Agr. tumefaciens Poraněná rostlina Infekce rostliny bakterií s Ti-plazmidem Přenos T-DNA do rostlinné buňky Začlenění T-DNA do jádra rostlinné buňky opinyVytvoření krčkového nádoru fytohormony 1. 5. 4. 3. 2. T-DNA Alternativa: přenos genů do genomu chloroplastů Využití genového inženýrství u rostlin A. Potraviny a krmiva  Ovlivňování agronomických vlastností  Rezistence k herbicidům  Rezistence k patogenům (hmyzu, virům, plísním apod.)  Tolerance ke stresům (vodní stres – sucho, mráz; osmotický stres – zasolení půd)  Modifikace posklizňových vlastností  Prodloužení skladovatelnosti  Zpomalení zrání a navození rezistence k skládkovým chorobám  Vylepšování nutriční hodnoty a chuti Využití genového inženýrství u rostlin B. Produkce sekundárních metabolitů  Studium a přenos genů pro klíčové enzymy biosyntetichých drah  Farmakologické přípravky C. Technické plodiny  Produkce škrobu a olejů pro průmyslové využití  Biodegradovatelné plasty D. Fytoremediace Odstraňování polutantů z prostředí Transgenní rostliny A. Rezistence k virům  Zavedení genu pro plášťový protein VTM do Ti-plazmidu, přenos do tabáku, rajčat  Vakcína je multivalentní, působí na jiné virózy B. Rezistence k hmyzím škůdcům  Vnesení genu pro endotoxin z Bacillus thuringiensis působícího na hmyzí škůdce (BT-rostliny: kukuřice, tabák, brambor, aj.)  Nepřímý způsob – naklonování genu pro tvorbu toxinu do bakterií kolonizujících rostliny (listy, kořeny) – např. Pseudomonas fluorescens C. Rezistence k herbicidům  Např. glyfozátu (nejpoužívanější neselektivní herbicid) inhibuje enzymy tvorby esenciálních aminokyselin 1. Vnesení genu pro tvorbu cílového enzymu (větší množství zajistí odolnost rostlin) 2. Vnesení genu pro tvorbu pozměněného (méně citlivého) enzymu 3. Vnesení genu pro tvorbu enzymu, který inaktivuje herbicid Transgenní rostliny D. Vylepšení nutričních hodnot plodů a semen nebo rostlinných produktů využívaných průmyslově  Rajče FlavrSavr fy Calgene – transgen: antisense mRNA genu pro polygalakturonidasu – prodloužená konzumní zralost  Rýže – vhodná pro alergiky  Řepka – olej ze semen obsahující zvýšený podíl kys. Laurové (mýdla a detergenty)  Řepka – olej ze semen bohatý na myristát (kosmetika) nebo kys. eruková (mazadla a výroba nylonu)  Arabidopsis a řepka – tvorba biodegradovatelných polymerů v chloroplastech využitelných jako plasty (polyhydroxybutyrát, polymery podobné polyesteru ve vláknech bavlníku) E. Produkce vakcín rostlinami („jedlé vakcíny“)  Syrová zelenina obsahující antigen (vakcínu), který indukuje tvorbu imunoglobulinů mukózního imunitního systému v zažívacím traktu  Povrchový antigen viru hepatitidy B  Podjednotka B toxinu cholery Bt-rostliny Rostliny rezistentní k hmyzím škůdcům Promotor Ligace Binární vektor Terminátor Bacillus thuringiensis Klonovaný gen pro toxin Štěpení restrikčními enzymy Fragment genu kódující aminokyseliny 454-615 Přenos do Agrobacterium Infekce rostlin Regenerované transgenní rostliny exprimující vysoké hladiny Bt toxinuNapadení larvami hmyzu List z rostliny, usmrcující larvy, zůstává nepoškozen List z kontrolní rostliny je napaden Syntetický gen pro toxin kódující aminokyseliny 1-454 Transgenní BT-kukuřice Obsahuje navíc dva až tři geny: 1.Gen(y) podmiňující odolnost rostlin proti hmyzím škůdcům (bakteriální gen z Bacillus thuringiensis zodpovědný za tvorbu deltatoxinu, který je jedovatý pro některé skupiny hmyzu, ale zcela neškodný pro savce a člověka) 2.Gen pro odolnost vůči herbicidu Basta (jeden z nových herbicidů, který má krátkou životnost a je šetrný k prostředí). Gen pochází z bakterie Streptomyces. 3. Gen pro odolnost k antibiotiku ampicilinu (selekční marker použitý pro selekci transgenních rostlin (buněk) při jejich přípravě). Gen pochází z bakterie. Místo rezistence k antibiotikům jiné selekční systémy Cíle studia přenosu genů do živočišných buněk 1. Studium funkce genů a způsobu jejich regulace 2. Příprava transgenních organismů  studium fungování genů v rámci celého organismu  příprava živočichů s cíleně upravenými geny  modely pro studium genetických chorob  příprava zvířat s lepšími užitkovými vlastnostmi,  vytváření cizorodých proteinů  hledání možností pro genovou terapii Způsoby přenosu cizích genů do savčích buněk DNA klonovaná ve vektoru nebo infekce virovým vektorem Sledování exprese mRNA v žabích oocytech Projádro transfekce DNA (Ca-korecipitace, elektroporace) Buňky ve tkáňových kulturách embryonální kmenové buňky infekce rekombinantním retrovirem náhrada jader Transgenní zvíře (+/- mozaikové) Začlenění DNA homologní rekombinací Selekce a přenos do blastocyst mikroinjekce DNA vývoj embrya v náhradní matce blastocysta infekce rekombinantním retrovirem mikroinjekce DNA Příprava transgenních savců Vytváření transgenních myší mikroinjekcí cizího genu do oplozeného vajíčka DNA SV40, tkHSV, lidský inzulin, B-globin, interferon Důkaz transgenu, např. PCR, in situ hybridizací Úspěšnost uchycení 10-30% exprese umlčení Až 40% potomstva obsahuje transgen začleněný náhodně, obvykle tandemově ve více kopiích v jednom chromozomu Manipulace s embryonálními kmenovými buňkami Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů Vnesení genů Vrstva fibroblastů, LIF Transfekce, elektroporace, retrovirová infekce Příklady transgenních živočichů  Zvířata (myši, drůbež, hospodářská zvířata, ryby) obsahující gen pro růstový hormon – rychlejší růst, změna vlastností produktů  Přežvýkavci obsahující ve střevě GMO-mikroorganismy, které redukují toxicitu některých rostlin (rozšíření potenciálu krmiv)  Drůbež s pozměněnými trávicími schopnostmi (celulóza, lignin, tuky)  Drůbež se zvýšeným obsahem lysozymu ve vejcích (využití v průmyslu a farmakologii)  Ovce s vylepšenou srstí  Myši s pozměněnými nebo inaktivovanými geny  studium lidských genetických poruch:  neurodegerativní, imunitní, hormonální choroby,  vliv faktorů na organismus faktorů (např. léků, mutagenů)  studium poruch paměti  Zvířata jako dárci orgánů pro transplantace (xenotransplantáty)  orgány s pozměněnými antigeními vlastnostmi vhodné pro člověka  Zvířata produkující cizorodé látky v mléce, moči, krvi nebo tkáních (animal farming: zvířata jako bioreaktory) Myš nesoucí gen pro lidský růstový hormon Zvířata jako bioreaktory: „animal farming“ Příklady látek vytvářených v transgenních zvířatech Zvíře Látka Využití ovce Alfa-1-antitrypsin Léčba rozedmy plic koza Tkáňový aktivátor plazminogenu Rozpouštění krevních sraženin ovce Faktor pro srážení krve VIII, IX Navození srážení krve prase hemoglobin Náhražka krve při transfúzi koza Lidský růstový hormon Léčba nanismu ovce, myš Regulátor CFTR Léčba cystické fibrózy prase Lidský protein C Antikoagulans krve koza – protein pavoučího vlákna v mléce, atp. kráva – lysozym nebo lysostafin v mléce Klonování savců doplněné o genetickou modifikaci Možné způsoby léčby genetických onemocnění 1. Úprava diety - karenční terapie (galaktosemie, fenylketonurie) 2. Substituční terapie (hemofilie, diabetes, nanismus) 3. Genová terapie (kauzální léčba)  vnesení funkčního genu (funkční alely) do genomu  cílená záměna poškozeného genu homologní rekombinací  cílené usmrcování geneticky pozměněných buněk  cílená inhibice exprese genů zodpovědných za genetickou poruchu Genové terapie  Léčba genetických chorob  dědičných  nádorových  Podle typu buněk, do nichž jsou geny vneseny: A. genová terapie zárodečných buněk B. genová terapie somatických buněk  Podle způsobu přenosu genů: A. genová terapie in vitro (ex vivo) B. genová terapie in vivo Příklady lidských chorob podmíněných monogenně a připadajících v úvahu pro genovou terapii v současnosti Nemoc Hlavní symptomy Produkt defektního genu Četnost Deficience adenozindeaminázy (ADA) Defektní T-lymfocyty, porucha v tvorbě protilátek, narušení imunitního systému. adenozinde- amináza 1/106 Fenylketonurie Fyzická a psychická retardace. fenylalaninhy- droxyláza 1/12 000 Hemofilie A + B Porucha v srážlivosti krve, krvácivost. faktor VIII, faktor IX 1/106 mužů Familiární hypercholesterolemie Předčasné arteriosklerotické změny cév. LDL-receptor 1/500 Deficience na α1-antitrypsin Plicní emfyzém, (rozedma plic). α1-antitrypsin 1/3 500 Cystická fibróza, CF Porucha v transportu Na-, zahlenění dýchacích cest, embolie. transmembrá-nový regulátor CF 1/2 500 Gaucherova choroba Nádory sleziny, zvětšení jater, žluté zbarvení (pigmentace) kůže. glukocerebro- zidáza ? Duchennova svalová dystrofie Svalová ochablost. dystrofin 1/3 000 mužů Leschův-Nyhanův syndrom Usazování kyseliny močové v kloubech a ledvinách, poruchy CNS. hypoxantingua- ninfosforibozyl- transferáza 1/106 Genová terapie in vitro Vlastnosti buněk vhodných jako vektory pro zavádění genů do organismu 1. Snadné získání buněk z těla 2. Snadná kultivace v kulturách in vitro 3. Odolnost k manipulacím spojeným se zaváděním genů 4. Schopnost navrácení buněk do organismu, kde se musí pomnožovat přetrvávat po dostatečně dlouhou dobu  Kmenové buňky kostní dřeně  Kožní fibroblasty  Hepatocyty  Myelocyty Schéma postupu při genové terapii deficience na adenozindeaminázu Schéma genové terapie melanomu TIL = tumor infiltrující lymfocyty; TNFa = tumor nekrotizující faktor Viry jako vektory nejpoužívanější v GT, velmi dobře infikují lidské buňky. Asi 70% pokusů s GT  Onkoretroviry: transgen začleňují do chromozomu do dělících se buněk výhoda při léčbě nádorů (např. nádory mozku). Riziko inzerční inaktivace endogenů  Adenoviry: infikují nedělící se buňky, DNA zůstává jako epizom v jádře. Jsou bezpečné, ale exprese je krátkodobá. Problém je imunogenicita. Uplatnění tam, kde je nutná vysoká exprese během krátké doby, např při léčbě rakoviny pro zabití buněk.  Adenoasociované viry AAVs: Nepatogenní, schopné infekce jen s využitím adenovirů jako pomocných virů k replikaci. Integrují DNA do chromozomu na specifické místo, umožňující dlouhodobou expresi bez rizika inzerční mutageneze.  Lentiviry: HIV (retrovirus) – infikují nedělící se buňky. Do chromozomu se integrují náhodně - dlouhodobá exprese. Nutnost odstranění virových genů a zachování schopnosti infikovat nedělící se buňky.  Herpes simplex viry: Mají tropii pro CNS, v latentní infekci jsou epizomální, tj. dlouhodobě exprimují transgen a šíří jej do okolní synaptické sítě. Hlavní úloha: přenos genů do neuronů pro léčbu nervových chorob (Parkinsonova ch.) a tumory CNS. Zábrana exprese genů navozená protismyslovou RNA Příklady léčby nádorů pomocí genové terapie Použitá strategie genové terapie Genová terapie nádorů 1. Dodání genu: obnova funkce nádorových supresorových genů 2. Inaktivace genu: zábrana exprese aktivovaného onkogenu 3. Genetická manipulace: vyvolání apoptózy nádorových buněk 4. Modifikace nádorové buňky tak, aby byla více antigenní a byla zničena imunitním systémem 5. Modifikace dendritických buněk ke zvýšení nádorověspecifické imunitní odpovědi 6. Použití geneticky upravených onkolytických virů selektivně usmrcujících nádorové buňky 7. Genetická modifikace nádorových buněk zajišťující konverzi netoxického prekurzoru na toxický produkt Genová terapie in vivo Do nádoru jsou injikovány buňky, do nichž byl in vitro vnesen retrovirový vektor, který obsahuje gen pro tymidinkinázu (TK). Vektor se uvolňuje a infikuje okolní nádorové buňky, v nichž se pak vytváří TK (retrovirus je schopen infikovat jen dělící se buňky!). Do těla pacienta je intravenózně podána netoxická látka gancyklovir (gcv), která je TK konvertována na toxický gancyklovir-trifosfát usmrcující nádorové buňky. Inject brain tumour with engineered retrovirus containing TK gene A few cells are modified Treat with ganciclovir Modified cells and „bystanders“ killed. Healthy cells away from the tumour are not affected Genová terapie mozkových nádorů: do nádoru je injikován retrovirový vektor obsahující enzym tymidinkinázu (TK). Několik nádorových buněk přijme vektor (tmavomodrá) a v těchto buňkách pak tymidinkináza konvertuje ganciklovir (prekurzor léčiva) do aktivní formy a v důsledku toho buňky umírají. Jsou usmrceny i nádorové buňky v okolí, ale zdravé buňky postiženy nejsou. X-SCID – těžká kombinovaná imunodeficience vázaná na X chromozom: mutace genu kódujícího  c-řetězec receptoru pro interleukin 2, která zabraňuje normálnímu vývoji T-lymfocytů a „killer“ buňkám (náchylnost k infekcím, bez transplantace kostní dřeně smrt do 1 roku života) Odběr kostní dřeně Kultivace buněk in vitro, infekce retrovirovým vektorem s genem  c, pomnožení buněk Vrácení buněk do těla pacienta 10 pacientů vyléčeno 2 pacienti onemocněli leukémií v důsledku aktivace onkogenu retrovirem Příklad úspěšné léčby chorob genovou terapií 62 Aplikace: abzym je injikován do pacienta, kde se svou protilátkovou oblastí váže na nádorové buňky. Následně je do krevního řečiště vpraven prekurzor léčiva, který je enzymovou aktivitou abzymu konvertován na aktivní léčivo. To působí jen na nádorovou buňku, na níž je abzym navázán. Tím jsou selektivně destruovány jen nádorové buňky a nikoliv normální buňky, na něž se abzym neváže. Struktura abzymu pro destrukci nádorových buněk Oblast protilátky Oblast s enzymovou aktivitou Vazba na nádorovou buňku Přeměna prekurzoru na aktivní léčivo 63 Antibody-Directed Abzyme Prodrug Therapy (ADEPT) – enzymová aktivita abzymu aktivuje prekurzor léčivé látky a tu pak dopravují do blízkosti nádorové buňky prekurzor léčiva markery (antigeny) specifické pro nádorové buňky cytotoxické léčivo 64 Protilátka (abzym) dopraví enzym k receptorům na nádorových buňkách, kde enzym konvertuje netoxický prekurzor (prodrug) na látku, která účinně nádorové buňky usmrcuje. Tím je omezen toxický účinek na normální buňky. Princip Antibody-Directed Abzyme Prodrug Therapy AntibodyDirected Abzyme Prodrug Therapy (ADEPT) The use of abzymes at industrial scale for specific synthesis of molecules is still at the laboratory step, even if some firms like Novartis (Switzerland) or Bristol-Myer Squibb (USA) have shown their interest for using the aldolase abzyme, produced in the Lerner's group, for synthesis of Epothilone A, a new anti-cancer compound.