Replikace nukleových kyselin • Replikace = tvorba replik (kopií) molekul nukleových kyselin zajišťující přenos genetické informace z DNA do DNA nebo RNA do RNA (z mateřské molekuly se vytvářejí dvě identické molekuly dceřiné) Replikou = oblast nukleové kyseliny, která se replikuje z jednoho počátku replikace (ori) Prokaryota - jeden nebo několik málo replikonů (chromozom/plazmid) Eukaryota - více replikonů (chromozomy, vzácně plazmidy) Viry - obvykle jeden replikon i Charakteristické rysy replikace dvou řetězcové DNA 1. Probíhá semikonzervativním způsobem 2. Probíhá semidiskontinuálně 2 Tři možné způsoby replikace DNA Semikonzervativní Konzervativní Rodičovská DNA DNA po první replikaci DNA po druhé generaci Disperzní Semi konzervativní způsob replikace dsDNA Nový (dceřiný) řetězec Materské řetězce Nový (dceřiný) řetězec Replisom (protein) Replikační vidlice (DNA + proteiny) materský řetězec Důkaz semi konzervativní replikace DNA (Meselson a Stahl 1958) E.coii cells are grown on 15N for several generations. Cells are tfien transferred to medium containing 14N for one generation. _1_ For two generations. For three generations. DNA is extracted and analyzed by CsCl density gradient ceotrifugation. DNA is extracted and analyzed. DNA is extracted and analyzed. rS rS rS DNA is exacted and analyzed. 14 N Control j Generation 0 => Control Direction of r=£> J sedimentation Generaton 1 > » i Generation 2 Generation 3 14N/ 15N u 1,70 g/cm3 gradient hustoty l,75g/cm3 Zkumavka s roztokem CsCl Semidiskontinuální syntéza řetězců při replikaci Opožďující se řetězec - syntetizuje se diskontinuálně S1 Ú w \ x .rif Vedoucí řetězec - syntetizuje se kontinuálně Směr pohybu replikační vidlice 3' 9'- Předpoklady a požadavky pro replikaci nukleových kyselin 1. Templát (matricový řetězec) = mateřská molekula 2. Primer = krátký oligoribonukleotid s volným 3'OH koncem (volná 3'OH skupina nukleotidu) 3. Enzymy katalýzu jící připojování nukleotidů (polymeráza, primáza, ligáza) 4. Nukleotidy (dNTP) — ATCCGTGCTGCTTGCTTGAATACC 5'UAGGCACGA-3'OH---► RNA-primer nově syntetizovaný řetězec DNA Syntéza DNA při procesu replikace Směr syntézy polynukleotidového řetězce 3'-konec řetězce 5'-konec řetězce dNTP Enzymy a proteiny kooperující pří replikací a jejích funkce 1. DNA-polymerázy a DNA-primáza: katalyzují polymerizaci NTP 2. DNA-helikázy, DNA-topoizomerázy: odstranění helikálního vinutí dsDNA a otevření DNA-helixu 3. SSB - proteiny: stabilizace jednořetězců 4. Iniciátorové proteiny: vazbou na ori katalyzují vytvoření replikační vidlice Počátek replikace = ori specifická sekvence na DNA (dnaA box) 9 Proteiny zajišťující replikaci u E. coli a jejich funkce podjednotky ^ Protein Gene Function DnaA dnaA Initiation of chromosome division; binds to the origin replication Helicase dnaB Unwinds the double helix DnaC dnaC Loading of DNA helicase SSB ssb Single strand binding protein Primase dnaG Synthesis of RNA primers RNase H rnhA Partial removal of RNA primers Pol 1 poiA Polymerase 1; fills gaps between Okazaki fragments »Polymerase III DNA polymerase III holoenzyme a dnaE strand elongation e dnaQ kinetic proof-reading e holE unknown; part of core enzyme ß dnaN sliding clamp T dnaX dimerization of core enzyme y dnaX loading of sliding clamp s holA loading of sliding clamp 8' holB loading of sliding clamp holC loading of sliding clamp holD loading of sliding clamp DNA Ligase Hg Seals nicks in lagging strand DNA Gyrase Introduces negative supercoils a gyrA Makes and seals double strand breaks in DNA ß gyrB ATP-using subunit Topoisomerase IV Decatenation A parC Makes and seals double strand breaks in DNA B parE ATP-using subunit Charakteristika aktivit DNA-polymeráz • DNA-dependentní-DNA-polymerázy (replikázy) 1. Polymerizace nukleotidů ve směru 5' -3' 2. Odštěpování nukleotidů a) 5' -3' exonukleázová aktivita b) 3' -5' exonukleázová aktivita Odbourávání DNA (exonukleázová aktivita) Polymerizace DNA -► b) a) 5' 3' AGTC TCAG 3' 5' 11 e e x f y e katalytické jádro dimer a DNA-polymerázy III e > 6 a Y-kqmplex e e. svírací svírací protein protein (P-protein)fliprotein) holoenzym DNA-polymerázy III '^1 x Obr. 128 Sestavování holoenzymu DNA-polymerázy III a-monomer, který katalyzuje poly-merači. Monomer a se vyznačuje již slabou polymerační aktivitou o rychlosti polymerace 8 nukleotidu/s. Nemá však exonukleázovou aktivitu; 8- monomer vyznačující se ncii-exo- nukleázovou aktivitou; 9- monomer, který stimuluje účinek e-exonukleáz; y-monomer váže ATP; ô-monomer se váže na P; Ô'-monomer stimuluje účinek monomeru p; %-monomer, na který se vážou proteiny SSB; \|/-monomer tvoří most mezi % a y. p* primer "U^T C* t r ?\ J -OH-X I t/W^ .-i O© O: 0„ |A A A A A A | A A A rare tautomeric form of C |C»i template I happens to base-pair with A strand | and is thereby incorporated by DNA polymerase into the primer strand T T T T C* A A A A A. A AAA rapid tautomeric shift of C to normal cytosine (C) destroys its base-pairing with A unpaired 3'-OH end of primer blocks further elongation of primer strand by DNA polymerase T T T TV oh AAA A A A A A A (pgpOH-j 3'-to-5' exonuclease activity attached to DNA polymerase chews back to create a base-paired 3'-OH end on the'primer strand T T T T OH AAA A A A A A A DNA polymerase continues the process of adding nucleotides to the base-paired 3'-0H end of the primer strand T T T T T OH -OH- AAA AAAAAA Korektorská aktivita DNA-polymerázy (proofreading) 3'—► 5' exonukleázová aktivita počet chybně zařazených nukleotidů = 1/107 výsledný počet chybných bází = 1 /109 13 Proč je DNA syntetizována jen ve směru 5 3' ? Makroergní vazba 5' 3' QQp) (p) (p) (B) (e) (p) (p) f U ■ - 3' ř hypotetický růsťve smeru 3* >5' - TT ^ ^yPXPXP) (1 f skutečný růst . vo s móru ' 5' « 3! 51 3' (gXgXP) (p)(p)(p)(p)(p)(p)(p)(p)^ u y | u y u u | u 5" -konec vytvořený 5 po odstranění ^ (5 pgš Ž5\ žfš /*\ /äv * po odstraněni jednoho nukleotidu , , — , , , , 1 _^ jednoho nukleotidu opravným pochodem. I U LJ LJH 31 3' -konec vytvořený po odstranění ' jednoho nukleotidu opravným pochodem ■(pXEXg^ ®® spr, správný deoxyribonukleosidtrifdsfát Makroergní vazba vstupující do reakce \ 5' 3' Mí (p) (p)_(p) (p) (p) (p) iingy PXP) správný deoxyr íbon u kíe osidtrifosfát vstupující do reakce U I u u u u Reakce neprobíhá, protože není k dispozici makroergní vazba, která by se štěpila Makroergní vazba je rozštěpena, čímž se získá energie pro polymeraci 14 DNA-ligázy 3'5'. 1 Ligázy vytvářejí fosfodiesterovou vazbu mezi dvěma sousedními nukleotidy v řetězcích DNA Při spojování řetězců DNA in vitro se používá T4 DNA ligáza • DNA-ligáza (ATP) O ATP + dNMPn + dNMPm = AMP + PPan +dNMPn + m • DNA-ligáza (NAD+)NAD+ + dNMPn + dNMPm = AMP + nAMN + dNMPn + m 15 Dvousměrná replikace kružnicové chromozómové dsDNA prokaryot Asymetrie replikační vidlice Syntéza vedoucího a opožďujícího se řetězce při replikací bakteriálního chromozomu Struktura počátku replikace (oriC) u E. coli -245 bp- L, M, R jsou 13 bp-sekvence IGATCfTNTTNTTTT 1,2, 3, 4 jsou 9 pb-sekvence TTATNCANA = neo ta sa GATCTNTTN1 TTATNCANA l I I I I X opakované sekvence 4 opakované sekvence s\ o 13 nukleotidech o 9 nukleotidech, *\ místa vazby N iniciačního proteinu Minireplikon ~i-1 Předprimerová fáze replikace DNA v oriC u E. coli oriC opakované sekvence 13 bp opakované sekvence 9 bp Protein DnaAse váže na čtyři opakované sekvence 9 bp v místě oriC. protein DnaA ■f- Kooperativní vazbou dalších molekul proteinu DnaA vzniká komplex s místem or/C na svém povrchu. proteinu DnaA oddělení vláken začíná v opakovaných sekvencích 13 bp i- Protein DnaB (DNA-helikáza) a DnaC se připojují k iniciačnímu komplexu a vytvářejí replikační bublinu. protein DnaB (DNA-helikáza) replikační bublina protein DnaC 19 Fungování proteinů DnaA, DnaB a DnaC při iniciaci replikace v oriC 5B j DnaA se váže na čtyři 9 bp repetice jSg*? >^ -íclicase DnaB Helicasc DnaB f DnaC DNA se ohýbá a začíná se rozmotávat v místě tří 13 bp repeticí - zde se pak vážou DnaB a DnaC, což vede k vytěsnění DnaA a rozmotá se celá oblast bohatá na AT páry. DnaB (helikáza) vytváří dvě replikační vidlice -každou v jednom směru 20 Iniciace replikace DNA prostřednictvím RNA-primerů DNA-primáza: DNA-dependentní RNA-polymeráza Syntéza Okazakiho fragmentů a proces jejich spojování postupným působením enzymů: 1. Primáza 2. DNA-polymeráza 3. Nukleáza (Poli) 4. Ligáza Délka Okazakiho fragmentů: 1000-2000 nt u prokaryot 100-200 nt u eukaryot primáza katalyzuje syntézu nových 3' 15' 3'« 15* pra váznoucí nukleotidyk iNÁ^prímeŕu a zahajuje tvorbu dalšího ■ ÓNAr fragmentu 34 5* 5' 3' Dl^pétvrnefiza dokončuje 3" 5" 15' 3' starý RNA-přiffier Je vymazán a nahrazen DNÁ I DNÄ-tlgáza ruší mezeru a připojuje nový DNA-fragmení k rostoucímu řetězci 3' 5' 22 DNA-poIymeii2Ea na váznoucím řetězci Relativní poloha podjednotek DNÁ polymerázy III v replikační vidlici ---3, f u u iíiiirďinr-A'j íftnnnľ u inrinj ;j , Směr pohybu Polili dvě pod jednotky Polili fungují společné 3' ífií y íPíiiruitltiíT-Fítl pokud by DNA nevytvořila ohyb, podjed notky by se oddělily Směr syntézy DNA 5—^3 inKRhruorin] Směr pohybu Polili ohyb DNA umožní podjednotkám zůstat pohromadě 24 Syntéza vedoucího řetězce a Okazakiho fragmentů Souběžná syntéza ve směru 5' -3' vedoucího řetězce a Okazakiho fragmentu. vedoucí řetězec dimer DNA-polymerázy hotový Okazakiho fragment RNA-primer syntetizovaný právě primázou. DNA-primáza helikáza (DnaB-protein) Pro zjednodušení není zakreslena ß-svorka a y-komplex 25 Úloha pod jednotek gama a beta při replikaci y -komplex Nakládá p -svorku na dvouřetězcový úsek složený z RNA-primeru a matricového DNA-řetězce a rozeznává RNA-prímfírytéto sestavě. y2SS'XV|/ prodlužovaný vedoucí řetězec 5' 5' oc-podjednotka DNA-polymerázy III p -svorka 31 Stabilizuje dvou řetězcovou strukturu a hlavně zvyšuje procesivitu DNA-polymerázy III. matricový DNA-řetězec 26 Globální pohled na průběh replikace dsDNA prodlužování vedoucího řetězce (polymerace ) hotový hotovy \ RNA-primer Okazakiho fragment Odbourávání primem prodlužující se z jeho 5'-konce. Okazakiho fragment Přidávání nukleotidů k 3'-konci Okazakiho Spojení fragmentu. Okazakiho fragmentů. 27 Terminace replikace bakteriálního chromozomu 11x GATC metylace Ter - místa (23 bp) spolu s Tus-proteinem brání pohybu helikázy a zastavují pohyb vidlice 28 Zjednodušené schéma buněčného cyklu zdůrazňující počet molekul dsDNA v chromozomech v jeho různých fázích VM^Mzí V G2-fázi se buňka připravuje k dM^ní. Každá molekula dsDNA m nachází v mvzéjemJeMě neoddélenfct chromaiidäch. Teprve v anafázi se sesterské chro-matidy oddelí v ne* závidě chromozo- me mitóza. « buňka II a 16/0hod. t> hod s 2 molekuly dsDNA. Každá je vjlném ohromo' o m u stejného páru. ^Bočet molekul dsDNA $e v každém chromozomu luMiný eyklu® savčí buňky i jAHiMiraí dobou 16 hod 29 Struktura chromozomu během dělení buňky centromera Počet počátků replikace u různých organismů Organismus Počet replikonů Velikost replikonů Rychlost pohybu vidlice (E. coli) 1 4200 kb r 50 000 bp/min (S. cerevisiae) 500 40 kb 3 600 bp/min (D. melanogaster) 3 500 40 kb 2 600 bp/min (X. laevis) 15 000 200 kb I 500 bp/min (M. musculus) 25 000 150 kb / ^ 2 200 bp/min (V. faba) 35 000 300 kb / Rozdíly v rychlosti syntézy 31 Složky bakteriálního a eukaryotického replizomu Složka replizomu U bakterií U eukaryot Replikativní polymeráza Holoenzym polili* polot/primáza v komplexu s pol 8 Faktor zvyšující procesivitu replikativní polymeráty p-svorka PCNA Faktor nakládající P-svorku (PCNA) y-komplex RFC Primáza jen DNA-primáza (DnaG-protein) komplex polot/primáza Helikáza DnaB-protein, n-protein ? Odstranění primeru DN A-polymeráza I exonukleázaMFl Oprava opožďujícího se řetězce DNA-polymeráza I a DNA-ligáza Komplex pol 8/pol 8 ? a DNA-ligáza DNA-topoizomeráza II (gyráza) II Proteiny vázající se na jodih>řetězcové úseky DNA SSB-proteiny replikační protein A (RP-A) nebo lidský SSB (HSSB) Eukaryotické DNA-polymerázy • a Syntéza Okazakiho fragmentů, 3' -5' exonukleáza Je v komplexu s DNA-primázou • ó Syntéza vedoucího řetězce a dokončení syntézy opožďujícího se řetězce 3'-5' exonukleáza • £ Neznámá funkce (možná syntéza vedoucího řetězce) • 6 Syntéza krátkých řetězců při reparaci DNA • y Syntéza mitochondriové DNA Odstranění RNA-primerů z Okazakiho fragmentů: Ribonukleáza Hl, Ribonukleáza FEN-1 33 Přehled vlastností a funkcí eukaryotických DNA-polymeráz Proliferační buněčný antigen (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) ~p-svorka Označení u savců Označení u kvasinek Umístění Počet podjedno- Polymerá-zóvá aktivita 5'r3! Exonukleá-zová aktivi-' 5' Sdružené faktory Procesivita Funkce poli vjádře míma začátek syntézy Okazakiho fragmentu primery pol4 vjádře nízká oprava poškozené DNA mm MEMS polM v mito-chondriích + pol3 v jádře vysoká katalýza replikace v mito-chondriích vysoká ve sdružení s PCNA syntéza prodlužujícího se řetězce a dokončení syntézy Okazakiho fragmentu pol2 v jádře >1 + vysoká neznáma 34 Struktura počátku replikace u kvasinek Soubor proteinů = ORIZOM transkripční faktory i proteiny rozeznávající transkripční počátek replikace (ori) faktory i DNA sekvence potřebná k odvíjení DNA vazebné místo pro transkripční faktory sekvence, na níž se zahajuje odvíjení DNA vazebné místo pro transkripční faktory rozeznávací sekvence počátku replikace 1. Vazba inciačních proteinů na sekvenci ore (helikáza, polymeráza atp) 2. Vazba transkripčních faktorů a jejich interakce s proteiny v místě ORE 3. Iniciace replikace, rozmotání DNA v místě DUE Různé transkripční faktory aktivují různé počátky replikace Před zahájením replikace se poblíž počátku replikace naváže RLF (replication licensing factor), který je po zahájení replikace odstraněn: koordinace iniciace mnoha ori Iniciace replikace u eukaryot - rozdíly oproti bakteriím A) Primáza syntetizuje RNA-primer, DOté se važe DNA polymeráza a,