Transkripce přepis genetické informace z DNA do RNA, při které DNA slouží jako matrice pro syntézu RNA. Reakci katalyzuje RNA-polymeráza (transkriptáza) Zpětná transkripce (reverzní transkripce: RT) - přepis genetické informace z RNA do DNA. Reakci katalyzuje zpětná (reverzní) transkriptáza Transkripce sekvence DNA do sekvence RNA DNA 3' -TACCC AACGCGAATTC ÁÚGG RNA 3 pripojovaní komlementárních nukleotidů 3'-TACCCAACGCGAATTC RNA ÁŮGGGUŮG 5'-► 3' Značení řetězců DNA podle jejich funkce dsDNA 5' -► 3' kódující (pozitivní) [nepřepisující se] 5 3 ♦ 3 5 antikódující (negativní) (-DNA) [přepisující se] I transkripce i 5 3'* mRNA 5' GATC 3' 3' CTAG 5' i 5' GAUČ 3' 3 Směr syntézy mRNA při transkripci, směr translace mRNA a směr syntézy polypeptidů Syntéza polypeptidů N-konec.....C-konec 4 Transkripce u prokaryot je spřažena s translací, u eukaryot jsou tyto procesy odděleny Prokaryota Eukaryota mRNA is translated while it is still being transcribed Monoctstronic mRNA AAAAAA {31} Tail mRNA must exit from the nucleus before it can be translated AAAAAA (3') 5 Srovnäni prokaryoticke a eukaryoticke mRNA Prokaryotni mRNA ködujfcf neködujfci Polygennf mRNA operony prüteln et prqtefn ß protein 7 Eukaryotni mRNA köduji'cf neködujfei sekvence sekvence Monogennf mRNA pföteta (A) Geny mohou být transkribovány z obou řetězců; jako templát je na daném úseku DNA využíván obvykle jen jeden z řetězců 7 Typy RNA vznikající při transkripci u různých typů organismů Total RNA Coding RNA 4% of total Pre-mRNA (hnRNA) mRNA Noncoding RNA 96% of total Pre-rRNA Pre-tRNA s n RNA snoRNA scRNA tmRNA and various other types rRNA tRNA V lidském genomu je přepisováno -75% sekvencí, v buňkách různých tkání max. 57% KEY All organisms Eukaryotes only Bacteria only 8 Molekulární druhy molekul RNA vytvářené transkripcí u eukaryot Transkripce a úpravy RNA probíhají v jádře. Translace probíhá v cytoplazmě. Enzymy katalyzující transkripci A. DNA-dependentní RNA-polymeráza (RNA-polymeráza, transkriptáza) matricí je řetězec DNA (prokaryota, eukaryota, DNA-viry) B. RNA-dependentní DNA-polymeráza (zpětná/reverzní transkriptáza) matricí je řetězec RNA (retroviry, retrotranspozony, retroelementy) Primární transkripty tvořené na řetězci DNA O přepisy strukturních genů (mRNA, pre-mRNA/hnRNA) O přepisy genů pro funkční typy RNA • pre-rRNA • pre-tRNA malé RNA (snRNA, snoRNA, scRNA, mi RNA, ...) 10 Funkce podjednotek RNA-polymerázy u E. coli podmiňuje vazbu ribonukleotidů na polymerázu udržuje stabilitu molekuly podmiňuje vazbu RNA-polymerázy k promotoru podmiňuje spojení RNA-polymerázy s matricovým řetězcem 11 Struktura RNA-polymerázy 6 ° jaws in closed DNA double RNA polymerase configuration helix newly synthesized short region of RNA transcript DNA/RNA helix DNA/RNA helix active site triphosphate uptake RNA polymerase channel Strukturní gen prokaryot s vyznačením signálů pro transkripci a translaci transkripčné regulačné signály translaČné regulačné signály oblast -35 PRIBNOWOV BOX iniciácia SD -10 transkripcie iniciačný kodón rozpoznávacia sekvencia väzbové miesto pre RNA-polymerázu pre RNA-polymerázu + 1 väzbové miesto pre ríbozóm DNA TGTTGACA TATAATG A TAAGGAG ATG 12 13±2 4-9 3-9 2-11 18-129 mRNA f TGA oblasť kódujúca termini čný terminátor polypeptidový kodón reťazec transkripcie Sekvence po směru transkripce (downstream) a proti směru transkripce (upstream) Funkční elementy bakteriálního promotoru -35 -10 + 1 (A,G) I ,r mRNA TTGACAT 16-18b promotor < silný slabý TATAAT l5-7bp+1 P ri b n o wů v sta rt ovací box nukleotid box = krátká sekvence o stejné funkci sekvence-10 templátové vlákno sekvence -35 transkripce AACTGT ^_ 16_1gb TTGACA 5' Ľ netemplátové vlákno sekvence proti směru transkripce T A T AAT A nebo G 1 3' -H- sekvence po směru transkripce lokální rozvíjení Sekvence přirozených a hybridních promotorů -35 Region 17 bp ■10 Region 123456789 1011121314151617 CONSENSUS lac trp AP, tacll • • • ttgaca......... ggctttacactttatgct ctgttgacaattaatcat gtgttgacataaatacca ........tataat• • tccggctcgtatattgt cgaactagttaactag ctggcggtgatactga recA cacttgatactgtatgaa gcatacagtataattg tací ctgttgacaattaatcat cggctcgtataatgt ctgttgacaattaatcat cgaactagtttaatgt 15-18 bp 5-9 bp Hybridní promotory tac = lac x trp +1 15 Transkripce bakteriálního genu RNA-polymerázou iniciace elongace terminace 5'i 3'i / RNA-polymeráza 5'i 31 5'l 3'i 5'l 3'i počátek T gen I_l promotor začátek syntézy RNA templátový řetězec konec ■rsrrninátor sigma-faktor rostoucí řetězec RNA terminace a uvolnění polymerázy a hotového řetězce RNA * .....- —-----------: J znovunavazani sigma-faktoru 16 Vytváření molekul mRNA na prokaryotické transkripční jednotce a spřažení transkripce a translace u prokaryot 17 Výměna podjednotek vázajících se na RNA-polymerázu v průběhu transkripce sigma-faktor B. subtilis má více sigma faktorů ^SyyRNA-polymeráza fa- faktor rozeznává sekvenci -35 na promotoru. | Po skončení této funkce se z RNA-polymerázy uvolňuje. RNA-polymeráza kata lyžuje transkripci \bez sigma-faktoru, který je v průběhu elongace nahrazen NúsA-proteinem i Terminace RNA-polymeráza se z terminátoru uvolní a NusA-protein je opět nahrazen sigma-faktorem. Obr. 148 Vzájemné výměny sigma-faktoru a NusA-proteinu na RNA-polymeráze Terminace transkripce nezávislá na Ró-faktoru Zastavení pohybu RNA-polymerázy Uvolnění hotové RNA Uvolnění RNA-polymerázy z DNA 18 Vazba prokaryotické RNA-polymerázy na promotor RNA-polymeráza (holoenzym) RNA-polymeráza zrněni tvarí velikost po rozpoznáni promotoru sigma-faktorem. uzavřený binárni kom p lex Obr. 144a iniciace transkripce otevřený binární komplex Obr, f 44b Iniciace transkripce +20 bp a - stabilita holoenzymu P - vazba rNTP na polymerázu (3'- spojení s matricovým řetězcem a - vazba k promotoru Velikost replikační bubliny je cca 18 bp Denaturace v oblasti +1 oblast bohatá na páry A:T 19 Iniciace transkripce -40 -30 -20 vazba sigma-faktoru na-35 Sigma-faktor se uvolňuje z RNA-polymerázy. ^0 +10 +20 +30 bp IAAAA/ nascentní RNA P/7 zakončení fáze iniciace a vstupu do fáze elongace mění sigma-faktor i RNA-polymeráza svou konformaci, což se projevuje změnou v její velikosti i tvaru. Iniciační fáze transkripce u prokaryot rozpoznání sekvence -1 a -35 sigma faktorem 0 Core enzyme Prodlužování mRNA 5'- * 3' Rychlost syntézy mRNA u E. colije 40 nt/sec 21 Typy terminátorů transkripce u prokaryot sekvence terminátorů přepsané do mRNA a) Sekvence bohatá na GC Hl) ! I f U A A C A n u u u u u u T b) u á xx a y r6 u li i i f C A A U C A A Terminátory: a) nezávislý na rho faktoru b) závislý na rho Strukturní rozdíly mezi dvěma typy prokaryotických terminátorů (jejich transkriptů) 22 Struktura transkripčního terminátoru nezávislého na rho faktoru DNA 5'- CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTTCTTTAATGA -3' 3'- GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAAGAAATTACT -5* templátovévlákno DNA transkripce RNA-transkript 5'- CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU OH-3' rychlé skládání RNA složená RNA U G A C C G C C G u c c 5'- C C C A C G C U G G C G G C Složený řetězec RNA napomáhá terminaci řetězce. i i i i U U U U OH-3' 23 Terminace transkripce mRNA niRNA DNA vlásenka párování A:U napomáhá uvolnění RNA I. Recognition Terminator Sigma DNA TWotcT Gene to be transcribed II. Elongation SIGMA IS RELEASED Jj RNA-polymeráza iJV Výměna sigma faktoru a NusA proteinu na RNA-polymerá/e i::.: ::í>'WÍÍ'' Sigma DNA NusA III. NusA is picked up NusA DNA - Sigma faktor: iniciace - NusA protein - terminace IV. Termination DNA NusA NusA RNA polymerase is released NusA Írom DNA Sigma Sigma displaces NusA Free for recognition 25 Terminace transkripce RNApolymeraae 1 za účasti Rho faktoru Elongační fáze transkripce Připojení Rho-faktoru a jeho pohyb po mRNA Připojení Rho-faktoru k sekvenci terminátoru Rho faktor rozmotává hybridní DNA-RNA Uvolnění Rho-faktoru, RNA-polymerázy a mRNA Transkripce transkripční jednotky pro rRNA (rrn operony) DNA promotory pre-rRNA 6S-rRNA geny transkripce 1 tRNA tRNA |n| |t2| \/ terminátory posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) to 16S-rRNA tRNA 23S-rRNA 5S-rRNA tRNA 27 Transkripce transkripční jednotky pro tRNA promotor DNA pre-tRNA I geny transkripce posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) i tRNA tRNA I tRNA mRNA 3' tRNA 28 Úprava pre-tRNA u E. coli * probíhá působením enzymů exonukleáza RNase E/F endonukleáza -o-3' > 150 nucleotides endonukleáza t RN A- n u k leo t i dy It ra n sfe ráza dodatečné připojení ACC 29 Transkripce u eukaryot cytoplasma gen primární RNA-transkript čepička RNA mRNA I PŘIDÁNÍ 5' -ČEPIČKY ♦ A PQLY(A)-KONCE IAAAA | SESTŘIH RNA AAAA EXPORT mRNA protein 1 AAAA TRANSLACE Eukaryotické DNA-dependentní RNA-polymerázy Matricí pro syntézu RNA je u všech těchto polymeráz negativní DNA-řetězec. Existují tři druhy těchto RNA-polymeráz: • RNA-polymeráza I, která katalyzuje syntézu pre-rRNA. Nachází se v ja-dérku a není citlivá k a-amanitinu Geny I. třídy • RNA-polymeráza II, která katalyzuje syntézu hnRNA a některých malých rRNA. Je citlivá k a-amanitinu. Vyskytuje se v karyoplazmě. Sestává přibližně z 10 protomerů, z nichž tři největší jsou homoloqické s protomery q, B a 8'prokaryotické RNA-polymerázy. Protomer 6 váže volné ribonukleotidy, 6' se váže k DNA a a spojuje protomery navzájem. Ostatní protomery se neliší od protomerů polymeráz I a III. Geny II. třídy • RNA-polymeráza III, která katalyzuje syntézu pre-tRNA, 5S-rRNA a některých malých RNA. Citlivost k a-amanitinu je druhově specifická. Vyskytuje se v karyoplazmě. Geny III. třídy Každá z uvedených tří RNA-polymeráz vyžaduje svůj specifický promotor, na který se váže. To je rozdíl proti prokaryotům, která mají jen jeden typ RNA-polymerázy (a jeden typ promotoru) Elementy eukaryotického promotoru (Pol II) +1 (startovací nukleotid + Inr-element) - iniciátor TATA-box (Hognessův b.) -34 až -26 - TATA-box CAAT-box -75 až -80 GC-box -90 Oktamer ATTTGCAT Elementy proti směru y transkripce (upstream elements) oktamerový box ATTTGCAT konzervativní sekvence GGGCGG GGCCAATCT konzervativní konzervativní sekvence sekvence \ / GGGCGG TATAAAA konzervativní konzervativní sekvence sekvence počátek transkripce 32 Vazebná místa eukaryotického promotoru pro RNA-polymerázu II Iniciace transkripce eukaryotních genů RNA-polymerázou II za účasti obecných transkripčních faktorů začátek transkripce \TA-box (A} pro zahájení transkripce je nutné navázáni TF na TATA-foox a na KNA-poljráerázu OH TFIIH TFHF r---dellí faktory RlhlA-polymeráza II RNÁ-poiymeráza je fosforylována TFIIH (+ATP), mění k on f orní a c i a zahajuje transkripci UTP, ATP CTP, GTP TRANSKRIPCE ZAČÍNÁ 34 Posttranskripční úpravy hnRNA Úpravy konců • 5'-konec: připojení čepičky {angl. cap) • 3'-konec: polyadenylace Úpravy vnitřní sekvence • Metylace • Sestřih • Editace (redakční úprava) 35 Posttranskripční úprava transkriptu strukturních genu eukaryot intron transkripce pre-mRNA OH CH, + / i i) n2" N 0 0 0 J__J 5' II II II S /l\CH, -O-P-O-P-O-P-0 -CH, f OH H0\| 2 I I I \ ~A o- o- o- 0 '2 /O 7-metylguanozin báze 0 20-CH. I 3 0 = P—0— ribóza I 0" Q K5'-konci se připojuje 7-MG čepička. 1. Připojení čepičky 5'-čepička 5'-čepička 5'-čepička mRNA 5'-čepička i Připojuje se úsek poly(A). Intron se vyštěpi. -AAAAA(A)~190 AAAAOH úsek 3'-poly{A) ô úsek3'-poly(A) úsek 3'-poly(A) 2. Připojení (poly)A konce 3. Sestřih 36 Struktura čepičky 5'-konec Hro-f-»-f-o-j>-o-fHa BtóE OH OH OH OH OH m7G5 ppp5 -mRNA mRNA°-CH3 Rané stadium transkripce genu RNA-polymerázou RNA-polymeráza II pre-mRNA 5' 7-MG (a) 5'-čepička " CH3-GpppNpNp CH0 t 2'-0-metyltransferáza 5'- konec primárního CH3-GpppNpNp □ T guanin-7-metyltransferáza GpppNpNp □ + PPj + Pj guanylyltransferáza GTP pppNpNp transkriptu (b) Biosyntetická dráha 7-MG čepičky. 37 Připojení sekvence poly(A) k 3'konci mRNA 5'- čepička Štěpení endonukleázou. 5'- čepička y~;Ť Přidání úseku poly(A) poly(A)-polymerázou. RNA-polymeráza II sekvence aauaaa \ bohatá na GU endonukleolytické štěpení aauaaa Přepis polyadenylačního signálu 5'- čepička1 aauaaa ■ aaaaa(a)195 3' '-v-' úsek poly(A) 38 Transport „otové eukaryotické mRNA z Jádra . , z Jaara do cytoplazmy Faktory pro transport RNA 'niciační translační Jaderné fakt0ry Póry translace mRNA připravená k transportu JADRO cytopla2ma translace J b"'tu a inicíaci 39 Sestřih (splicing) - proces, při němž jsou odstraňovány introny Intron: nekódující sekvence uvnitř genu Objev: 1977: v genu adenovirů 1978: p-globin, imunoglobulin, ovalbumin, tRNA and rRNA. Známé typy intronů Intron type Where found GU-AG introns Eukaryotic nuclear pre-mRNA AU-AC introns Eukaryotic nuclear pre-mRNA Group 1 Eukaryotic nuclear pre-rRNA, organelle RNAs, few bacterial RNAs Group II Organelle RNAs, some prokaryotic RNAs Group III Organelle RNAs Twintrons Organelle RNAs Pre-tRNA introns Eukaryotic nuclear pre-tRNA Archael introns Various RNAs 40 Důkaz přítomnosti intronů v genu pro ovalbumin Splicing diversity (a) Electron micrograph of ovalbumin DNA-mRNA heteroduplex. RNA Spliceosome Schéma intronu s vyznačením konzervativních sekvencí sekvence potřebné pro vyštěpení intronu část primárního transkriptu exon 1 exon 2 43 Schéma struktury intronu v hnRNA 4- §;_ 3' 5' exon 1 £AG AAGJ3UAAGU í S'-místo sestřihu R = purinový nukleotid Y = pyrimidinový nukleotid N = jakýkoliv nukleotid A q - A nebo C intron- .YNCUF@C CUAAC A 3' -(Y)nNYÄŠi 5' 3' (Y)nNCAGG místo větvení Nukleotid poskytující skupinu 2'-OH. pyrimidinový úsek Oblast bohatá na pyrimidinové nukleotidy. t 3'-místo sestřihu Sekvence a nukleotidy zakreslené do šedého rámečku jsou vysoce konzervativní (četnost 100 %). Ostatní sekvence se vyskytují v četnosti 70 - 95 %. Sekvence uvedené pod schématem intronu a exonu jsou sekvence, které byly zjištěny u savců. 44 Schéma transesterifikace při sestřihu hnRNA lasovitá intronexonová RNA 5" exon 1 —O lasovitá intronová RNA exon 2 3' První transesterifikace (první přenos OH-skupiny). Druhá transesterifikace (druhý přenos OH-skupiny). Transesterifikace = přeměna jednoho fosfátového esteru v jiný probíhající přenosem OH-skupiny bez hydrolýzy a za nepřítomnosti ATP n. GTP 5' exon 1 exon 2 3' 45 2,5- f osf odiesterová vazba 3' -konec intronové sekvence Průběh sestřihu strukturního genu - účast U snRNP exon 1 _A_ intron _A_ exon 2 _A_ ' -sestřihu U1snRNP intron U2 snRNP místo 3' -sestřihu exon 2 U4/U6 snRNP, U4/U6 snRNP U5 snRNP U5 snRNP tvorba „lasa" a štěpení místa 5' -sestřihu štěpení místa 3' -sestřihu a spojení obou exonů / 5- sestřihové místo větvení 3'- sestřihové ,_ část primárního J " 3' transkriptu 5' ĽZ místo místo snRNP U1 se váže na 5'- sestřihové místo a snRNP U2 se váže na místo větvení. Částice snRNP Small nuclear ribonucleoproteins Proteiny snRNP + U snRNA + specifické proteiny □ 3' Sestavuje se úplný spliceozom a štěpí transkript v 5'- sestřihovém místě. stepene 5'- sestřihové místo 5'- konec intronu se připojuje kAv místě větvení za vzniku lasovité struktury, uvolňují se U1 a U4. vyštěpená intronová sekvence ve formě lasa bude degradována v jádře exon 1 exon 2 část mRNA □ 3' Štěpí se 3'- sestřihové místo a 5'- konec exonu 2 se připojuje k 3 - konci exonu 1. Intron se uvolňuje U2 ve tvaru lasa spolu s snRNP U2, U5 a U6. exon 2 sestřižená mRNA Rozeznávání 5' -místa sestřihu a místa větvení malými jadernými U1-snRNAa U2-snRNA U1-snRNA 3'-l U2-snRNA O exon 1 5* guáac 5' ■UACUAC U1-Í U2-snRNAjsou komponenty částic U1- a U2-snRNP. Jsou tedy v komplexu s proteiny, které se uplatňují katalyticky při sestřihu a plní též strukturální funkci. 7G místo větvení" -intron- V pyrími-^A dmovy úsek (u savců) CAG 3' exon 2 Všechny uvedené sekvence nukleotidů jsou vysoce konzervativní u S. cerevisiae a vyskytují se též u jiných organizmů s výjimkou trypanozom, které nemají sekvenci GUGUA v U2-snRNA. S. cerevisiae nemá pyrimidinový úsek. 48 Průběh sestřihu ve spliceosomu během úpravy pre-mRNA expn i A. Před první transesterifikací je U1 snRNP zaměněna za U6 snRNP >CAUUCA i! i u exon 1 GUAUGU 3' rearrangement GUAUGU-KT -~TVH gagaca B. A je rozpoznán BBP a pak U2 BBP (branchpoint bridging protein) exon 2 rearrangement *► 5'H-UACUAC C. Změna tvaru U5 přiblíží konce exonů Účast PRP-proteinů (upravujících prekurzorovou RNA) exon I — g 'augauca. \ľc' UACUACA Tlili t U Ay^A-y^Gy" rearrangement U -A G -c U A G U A G S3 'augauc s. vG f Il I) uc ACUAG* U UACUACA,/, A i i T i i. ■ Účast SR proteinů při rozpoznání míst sestřihu („exon definition hypothesis") intron exon \rmm 1 ií-tO^ nucleoti des n učteotí dés 10-10& n ucíéof ideš r—~~—'"~—~ti-—-ír"—— i Proteiny SR (bohaté na serin a arginin) se během transkripce průběžně vážou na hranice exonů a pomáhají tak navádět částice snRNP do míst sestřihu Způsoby alternativního sestřihu hnRNA i Jeden potenciální exon sousedící se dvěma konstitutivními Jeďen potenciální exon s více 5'~místy sestřihu a s jedním 3'-mí$tem s'/\y s/\y 4 í^Siž - 1 instni Jeden potenciální exon s více 3'-místy sestřihu a s jedním 5'-místem Přeskakování jednoho potenciálního exonu ■ konstitutivní exon = potenciální exon = íntron Přeskakování více potenciálních exonů Navzájem se vylučující potenciální exony 51 Příklady alternativního sestřihu molekul hnRNA vzniklých transkripcí překrývajících se transkripčních jednotek Alternativní terminace transkripce anskripční jednotky nesoucí gen pro CX- amylázu u myší 1 hnRNA v buňkách slinných žláz hnRNA v bu ňkách jater Transkripční jednotky nesoucí gen pro kalcitonin +1 Ír) hnRNA štítné žlázy hnRNA v neuronech Y mRNA vzniklá naznačeným sestřihem se překládá do primární struktury alfa - amylázy. mRNA vzniklá naznačeným sestřihem se překládá do primární struktury kalcitonin u v buňkách štítné žlázy. mRNA vzniklá naznačeným sestřihem se v neuronech překládá do primární struktury CGRP (produkt podobný kalcitoninu). Alternativní začátek transkripce +1 T ■ = potenciální exon, I = konstitutivní exon, = startovací nukleotid, = Poly(A). 52 Alternativní sestřih genu pro alfa-tropomyozin u krysy (regulace kontrakce svalových buněk) 5'1 3'! gen a-tropomyosinu T7— exony introny 13' 15'J DNA •i 11 Alternativní zakončení transkripce TRANSKRIPCE A SESTŘIH MAM 13' 13' mRNA z příčně pruhovaného svalu 3' mRNA z hladkého svalu 3' mRNAzfibroblastů 3' mRNAzfibroblastů mRNA z mozku Faktory sestřihu - specifické proteiny aktivní jen v daném typu buňky 53 Sestřih kombinačních exonů hnRNA obsahující přepis genu kódujícího troponin T 12 3 4 117 hnRNA 9 101112131418181718 konstitutivní kemMnaénl konstitutivní taseny exony exony Vystepují se do mRNA vfflshió kúmbinacíeft: Molekuly mRNA s kombinacemi kombinačních exonů: vzájemně se vylučující exony 9 1011121314 15 1617 18 hH-H-H-HH} I— Celkem se vytvoří 32 molekul mRNA, které se liší v části kódované kombinačními exony. Tyto kombinace jsou však ve vazbě vždy s jedním z dvojice vzájemně se vylučujících exonů. Proto celkově je možných 64 molekul mRNA lišících se v primární struktuře. Každá z nich se překládá do jedné izoformy troponinu T. Troponiny jsou strukturní bílkoviny buněk příčně pruhovaného svalstva, jejich odlišné izoformy jsou u fetálních buněk a v buňkách dospělců 54 Negativní a pozitivní regulace alternativního sestřihu (A) NEGATIVE CONTROL TISSUE 1 primary transcript splicing mRNA TISSUE 2 repressor CO no splicing mRr Represor se váže na RNA a brání v sestřihu activator (B) POSITIVE CONTROL primary transcript mRNA Sestřih probíhá jen po vazbě aktivátoru na RNA 55 Samosestříh 1982: T. R. Cech (26S rRNA Tetrahymena, S. Altmann (tRNA E. coli)- 1989 Nobelova cena Autokatalytický proces sestřihu nevyžadující proteiny (in vitro) RNA schopná samosestřihu = ribozym • introny první skupiny v genech přepisovaných do mRNA, tRNA a rRNA (mitochodnrie, chloroplasty, nDNA eukaryot, bakteriofágy) vyžadují externí G, in vivo nutná účast proteinů (maturáza) • introny druhé skupiny v genech mitochondrií hub a v chloroplastech nevyžadují externí G (ale interní A), in vivo nutná účast proteinů, podobnost se sestřihem hnRNA Mechanismus samosestřihu prekurzoru rRNA externí G \ G-OH exon 1 prekurzor rRNA 5' P — u-o-p Fosfoesterová vazba se přenese ze spojení exon 1 - intron na G-OH, vazba mezí exonem 1 a intronem se rozštěpí. exon 2 -OH 3' exon 1 1 exon 2 5'P - Fosfoesterová vazba se přenese ze spojení intron-exon 2 na 3-konec exonu 1, exony 1 a 2 se spojí -~p- -OH 3' sestřižená rRNA 5'P - exon 1 / exon 2 U-O-P -OH 3' G-P- t vyštěpený intron Intron se cirkularizuje přenosem vnitřní fosfoesterová vazby. 57 Průběh samosestřihu u intronů první skupiny Exon 1 Intron Exon 2 GTP cofccror binds "o 3' 395 nt " Cut#l GAl traiaterfed to 5' and of Intron 15 nucleotides (nt) cut off LI? RNA is cgtalytically active šekv. specif, endoribonukleáza nukleotidyltransferáza RNA-ligáza exter.matricí fosfatáza linear minus 19 intervening sequence Reakce probíhající při samosestřihu intronu I a II Introny skupiny I Introny skupiny II Srovnání samosestňhu intronů skupiny I a II Skupina I Skupina II Bimolekulární sestřih (trans-splicing) mRNA u trypanozom Primární transkript genu 1 Exon X Intron Exon Y Intron ExonZ způsob sestřihu Primární transkript genu 2 Exon X Intron Exon Y Intron Exon Z Transducing U prvoků - změny antigenních determinant mRNA Exon X Exon Y Exon Z Další příklady: nematoda, chloroplasty 61 Twintron = intron uvnitř jiného intronu • objeveny v chloroplastové DNA eugleny, později u kryptomonád, drosofily aj. • vystřihování probíhá sekvenčně (nejdřív vnitřní, pak vnější intron) • v jednom intronu může být více twintronů 62 Původ intronů. „Exon theory of genes" Multidomain, single subunit protein Biologický význam intronů 1. Regulace genové exprese (přítomnost dlouhých intronů zpomaluje transkripci a snižuje množství výsledného tran skřip tu). 2. Pozůstatek evoluce (různé exony v genu kódují různé funkční domény produktu - geny vznikaly fúzí exonů). 3. Zvýšení rychlosti rekombinace kódujících úseků různých genů -zrychlení procesu evoluce (proteiny / domény). 4. Alternativní sestřih: z jednoho genu více produktů. Některé eukaryotickégeny neobsahují introny, tj. introny nejsou nezbytné pro normální genovou expresi (klonování cDNA) 64 Editace RNA Editace RNA je jedna z posttranskripčních úprav, která byla zjištěna • V mitochondriích trypanozom, • V mitochondriích Physarum polycephalum • V mitochondriích strunatců, • V mitochondriích vyšších rostlin • U genu pro apolipoprotein u savců 65 Editace RNA u různých organizmů Organizmy Organely Způsob editace Typ RNA Trypanosoma Leischmania Crithidia mitochondrie inzerce U, delece U mRNA Rostliny mitochondrie chloroplasty substituce C za U, U za C substituce C za U mRNA,rRNA Savci jádro substituce C za U, Á za G mRNA 66 Substituční způsob editace hnRNA genu pro apolipoprotein The sequence of the apo-B gene is the same in intestine and liver, but the sequence of the mRNA is modified by a base change that creates a termination codon in intestine. Apolipoprotein B gene has 29 exons HI I 01 Codon 2153 codes for glutamine C je deaminován na U změna funkce produktu ztrátou C-domény u kratšího proteinu li CAA CAA Gin cytidindeamináza i Editing Spliced mRNA in liver codes for protein of 4563 residues Uvolňování cholesterolu UAA STOP Intestine mRNA has UAA codon that terminates synthesis at 2153 67 Editace mRNA genu pro apolipoprotein B ve střevě savců dna i:j^7^^jjw^ CAA- needitovaná mRNA 5'1 C A A transkripce a vyštěpení intronových sekvencí 3' 5' editování mRNA 5' 5' střevo C A A deamináza vázající se na RNA 3' editování RNA: oxidatívni deaminace cytozinu translace Vzniká STOP kodon HoN COOH HoN apolipoprotein dlouhý 4563 aminokyselin COOH apolipoprotein dlouhý 2153 aminokyselin 68 Příklady editace (redakčních úprav) mRNA - adice U a delece T (přítomen v DNA) ual&ugu uuugu ugu uimu UA u6 ugá u uaus g u u u UC2 u u u u u ua u u C: g LI au u u u uuagauuua uuuaauuugu ugau Aáauaca uuu UAUUU6U UU6UUAA uuuuuuuguuu u3 UGUU UUUGGUU 1 w HP UAQQUUUUUUUGULGUUGUl^uuuuguauuaugauuga0juu3uuguuugguuuuuuguuuu u ugusaaaccagu uau GAG AtíÚUUGC au uguuauuuau uacau uaagu ug60g uuuuugguuc Part of the mRNA sequence of T. brucei coxlll shows many uridines that are not coded in the DNA (shown in green) or that are removed from the RNA (shown as T). 69 Editace pre-mRNA genu cytochromu b u Leishmania DNA template strand 3' TTTCGCCTCTCTTTTCTTT T C C G AAATTGAAGTCCAACAAATAATGCTCATATACC o Transcription Pre-mRNA 5' AAAGCGGAGAGAAAAGAAA A G G C UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG Pre-mRNA 5 o Pairing with partially complementary guide RNA 3' mug** GAaAAG{\(\i\ AG G C UUUAACUUCAGG^üG III I I I I Mill! MM ^ViUUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGU(/C4G AClJA Guide RNA 'AAUAA U Insertion of uridine monophosphates Pre-mRNA 5 G/lG^^GAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCAGGV3ViGVi 10* Guide RNA M I M I I I I I I I II I I I M I I I I I UUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGU (/c^G(/ 'MUAA Release of guide RNA from mRNA U Edited mRNA 5 AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCAGGUUGUUUUAUUACGAGUAUAUGG Vysvětlení editace na základě transesterifikačních reakcí Nukleofilní atak fosfodiesterové vazby 3 OH skupinou 51 editační místo -A p G 3' mRNA J a kotva^ u "*gRNA první transesterifikace řídící RNA (guide) Editace inzerce nukleotidů do hnRNA u trypanozom řízená gRNA - první transesterifikace O hnRNA podléhající editaci (Tato hnRNA se vytvořila transkripcí genu pro ND7). Tato čísla znamenají počet nukleotidů (U), který může být vložen do míst vyznačených šipkami. Jsou to f,7 editační místa. 3' - kotva UUl%H poty(U)-konec U L-J ACACUUGUAUAGAU-********* **** ÚGUGAACAUUUUUA* A gRNA še váie ke kotvě, a tím také k určité hnRNA, v tomto případě k N Dl hnRNA. Prostřednictvím OH-skupíny napadá fosfodiesterovou vazbu mezi GaA a vkládá tam 7 koncových ÍL Nukleotidy uvedené v rámečcích se postupně navetou komplementárně směrem k 3'-konci hnRNA. Čísla znamenají jejich počty, které odpovídají číslům uvedeným nahoře. Hvězdičkami jsou vyjádřeny vodíkové vazby. Proč probíhá editace? - Editace RNA byla běžná u prapůvodních buněk, u nichž byla řada reakcí katalyzována molekulami RNA a ne proteiny - Primitivní mechanismus regulace genové exprese 73 Proces vytváření poly A konce na m RNA RNA polymerase Signály na DNA pro uvolnění m RNA a připojení polyA konce Připojení dalších faktorů, uvolnění mRNA Připojení dalších proteinů vázajících se na polyA CstF - cleavage stimulation factor F CPSF - cleavage and polyadenylation specificity factor Hotový 3' - konec mRNA 74 Signály ovlivňující transkripci a translaci strukturního genu (bakterie E. co li) Regulační signály pro transkripci -35 -10 Regulační signály pro iniciaci translace +1 tgttgaca tataatg □ taaggag Vedoucí sekvence m RNA Signální peptid transport atg Strukturní gen .A. I protein stop