Translace - překlad genetické informace Složky translačního aparátu: • mRNA • 20 standardních aminokyselin (+ SeCys. Pyrrolyzin)) • molekuly tRNA • aminoacyl-tRNA-syntetázy • ribozomy • translační faktory: IF, EF, RF • ATP, GTP 1 Struktura molekuly tRNA attached amino acid {Pne} 3'end G A C A C ii ti m íl if CUGUG anticodon loop anticodon a clover leaf (A) ÍB) (C) 5' GCGGAUUUAGCUq ID) 5AGCGCCAGAĚ :UGGAGGUCCUGUGTWCGAUCCACAGAAUUCGCA anticodon Sekundární struktura tRNA dihydrouridinové rameno DHU-smyčka 3'~ aa (9 akceptorové rameno PARAKODON pseudouridinové rameno T¥C smyčka Vazby, kterými vzniká terciární struktura tRNA. černé kroužky = standardní nukleotidy šedé kroužky = neobvyklé nukleotidy Srovnání struktury prokaryotického a eukaryotického ribozomu 70S Prokaryotický ribozom MW 2,500,000 308 MW 1,600,000 MW 900,000 / 5S HRNA 120 nucleotides \ / 23Š rRNA 2900 nucleotides 16S rRNA 1540 nucleotides 34 Qřoteins L 21 plrteins Eukaryotický ríbozom BS rRNA 120 nucleotides 28S rRNA 5J8S rRNA 4700 nucleotides nucleotides 18S rRNA "1900 nucleotides -49 (proteins ~3S pisatel n Sekundární struktura 16S rRNA E. coli 3' minor domain Červeně jsou znázorněna místa interakce s proteinem S5 5 Struktura molekul rRNA (5S a 23S) ve velké ribozomové podjednotce bakterií stanovená rentgenovou krystalografií Trojrozměrná struktura rRNA a L1 proteinu v poměrné velikosti Schema sekundární struktury 23S rRNA Peptidyltransferázová aktivita 23S rRNA - ribozymu None I E M IV V VI Domain left out of the reaction mixture Purifikovaná 23S rRNA z f. coli katalyzuje vytvoření peptidové vazby mezi aminokysleinami vázanými na tRNA za tvorby dipeptidu Schopnost šesti domén 23S rRNA tvořit peptidovou vazbu. Odstranění domény V vedlo k neschopnosti vytvořit peptidovou vazbu, tj. tato doména má při vytváření peptidové vazby klíčovou funkci F = fenylalanin 7 NF = N-acetylfenylalanin Struktura velké podjednotky bakteriálního ribozomu Šedě = 5S a 23S rRNA; žlutě: L proteiny rRNA zodpovídá za: 1. Strukturu ribozomu 2. Interakci tRNA s mRNA při translaci 3. Katalýzu peptidové vazby 8 Struktura ribozomu E. coli s vyznačením funkčních míst schéma ribozomu 70S E neboli místo P neboli peptidylové A neboli aminoacylové exitu tRNA vazebné místo vazebné místo Standardní genetický kód Kodony První nukleotid Druhý nukleotid Třetí nukleotid U C A G U Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser N N nebo Secys A Leu Ser N (pyrrolyzin) Trp G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gin Arg A Leu Pro Gin Arg G A lle Thr Asn Ser U lle Thr Asn Ser C lle Thr Lys Arg A Met nebo 1 Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Kodonové rodiny jsou vyznačeny modře; N = nesmyslný kodon; I = iniciační kodon; Secys = kodon pro selenocystein, UAG = pyrrolyzin Čtení genetického kódu molekulami tRNA 20 standardních aminokyselin i 20 aa-tRNA-syntetáz l 22-45 molekulárních druhů tRNA (tj.antikodonů) 1 61 kodonů se smyslem a1 1 tRNA 1 1 kodon a2 / \ tRNAt tRNA2 /\ /\ 4 kodony (2 antikodony) Kolísavé párování bází Kolísavé párování bazí na 5'antikodonu tRNA \ Antikodon | tRNA (antikodonové rameno) 3 ' Vi> f--N & I G 5' Á u G C Kolísavá pozice (první báze antikodon u) 5' ■ ♦ U/C 3' Kodon ^ Třetí pozice kodonu Jedna tRNA: AGG (antikodon) Dva kodony: UCU UCC 12 Možnosti čtení třetího nukleotidu kodonu podle pravidel kolísavého párování bází První nukleotid antikodonu Třetí nukleotid kodonu Možnost čtení Organizmy u UCAG Kodonové rodiny Mitochondrie, Mycoplasma, chloroplasty o5U U AG Kodonové rodiny (Ser UCN, Val, Thr, Ala) Eubakterie mem5U AG Dvoukodonové sady Mitochondrie, bakterie, eukaryota m5s2U A(G) Dvoukodonové sady Eubakterie, eukaryota G UC Dvoukodonové sady Všechny G uc Kodonové rodiny Bakterie Q UC Dvoukodonové sady Eubakterie, eukaryota Hyp UCA Arg CG N Eubakterie Hyp UCA Kodonové rodiny kromě Gly GGN Eukaryota A U Thr ACU, Arg Mycoplasma, mitochondrie kvasinek c G Všude Všechny Hyp = hypoxantin; Q = queozin 05U = uracil-5-oxyoctová kyselina; m5S2U = 5-metyl-2-tiouracil; mem5U = 5-metylkarbonylmetyl-2-tiouracil; Kolísavé párování bází mezi antikodonem CGI v tRNA a třemi odlišnými (synonymními) kodony kodony mRNA 5'^n^™3' 5'™tt^™3' 5'^m™3 GCU GCC GCA = inosin alanyl-tRNA 14 Čtení kodonů pro serin molekulami tRNA Kodon tRNA Antikodon UCU tRNASeri AGG + kolísání UCC UCA tRNASer2 AGU + kolísání UCG AGU tRNASer3 UCG + kolísání AGC Izoakceptorové tRNA jsou tRNA o různých antikodonech vázající tutéž aminokyselinu 15 Srovnání využívání kodonů silně a slabě exprimovaných genů u E. coli u A U silně/slabě Phe^ Leu 39 113 151 102 12 16 71 64 Leu 26 33 y 3 73 69 22 345 294 67 262 156 118 Met -* 2 140 27 130 Val 192 41 119 83 108 66 .48 123 Ser 93 87 6 12 36 49 37 62 Pro 21 2 23 46 26 45 162 101 Thr, 103 137 15 28 46 119 32 76 Ala 173 48 87 178 119 129 107 149 silně/slabě silně/slabě Tyr < 34 98 96 65 ochre amber His \ i Gin 19 75 38 169 95 59 90 166 Asn Lys 13 159 101 98 259 106 163 44 Asp Glu 116 204 333 1 06 183 , 106 210 98 Cys opal Trp 13 23 25 34 39 66 Arg | 223 99 ioi 133 3 1 27 42 Ser Arg 10 49 3 1 56 61 28 17 Gly 226 174 124 140 14 42 66 U c A G U C A G U C A G U C A G Silně exprimováné geny představuje 24 druhů mRNA s celkovým počtem 5253 kodonů. Mezi tyto geny patří gen pro RNA-polymerázu, geny pro dvanáct ribozomých proteinů, několik proteinů vnější membrány a geny pro elongační translační faktory. Slabě exprimované geny představuje 18 druhů mRNA s 5231 kodony. Patří sem několik represorových genů, gen pro transponázu a B-laktamázu. Kodony, které jsou čteny jen jedinou tRNA a jejichž výběr je závislý na povaze a síle interakcí mezi kodonem a antikodonem, jsou v rámečku. Šipkami jsou označeny kodony, které jsou používány jen zřídka a mohou se podílet na regulaci genové exprese. 16 Klasifikace aminoacyl-tRNA-syntetáz První třída (acylace na C2') Druhá třída (acylace na C3') Specificita pro aminokyselinu Počet podjednotek Specificita pro aminokyselinu Počet podjednotek Arg monomerní Ala tetra merní Cys monomerní Asn dimerní Gin monomerní Asp dimerní Glu monomerní Gly tetramerní(a2|32) lle monomerní His dimerní Leu monomerní Lys dimerní Met dimerní Phe tetramerní(a2|32) Trp dimerní Pro dimerní Tyr dimerní Ser dimerní Val monomerní Thr dimerní Např: tryptofanyl-tRNA-syntetáza Bez ohledu na společnou funkci jsou syntetázy strukturně odlišné Translace probíhá ve dvou etapách: 1. mimoribozomové (připojení aminokyseliny k její tRNA pomocí aminoacyl-tRNA-syntetázy) 2. ribozomové (na ribozomech jsou přiřazovány aminokyseliny podle sledu kodonů) Ribozomová etapa má tři fáze: 1. Iniciace translace 2. Elongace polypeptidového řetězce 3. Terminace translace 18 1. Mimoribozómová etapa: Nabíjení tRNA aminokyselinou 1. Vytvoření aminoacyladenylátu 2. Přenos aminokyseliny na tRNA aa + ATP-► aminoacyl-AMP + PPi aminoacyl-AMP + tRNA-►aminoacyl-tRNA + AMP 19 Aktivace aminokyseliny aminoacyl-tRNA-syntetázou ATP adenosintrifosfát, nejvýznamnější makroergická sloučenina 2 makroergická vazby mezi fosfáty, každá po 33 kJ/mol, znázorňují se vlnovkou R ! H.N-C-Cľ :C I hi amino acid R I H2N- C-C O ^ P - ribose - adenine adenylated amino acid P - ribose - adenine AMP tRNA R I H,N-C- l; aminoacyl-tRNA Vznik aminoacyl-tRNA působením aminoacyl-tRNA-syntetázy •—.■—*—-—■—■—■—- -^.^!S!|pS3g Enzýme \ H-C-NH2 3 vazebná místa na aa-tRNA-syntetáze 1. aa + ATP — aa-AMP + PP Vznik aminoacyladenylátu 2. aa-AMP + tRNA vznik aa~tRNA tRNA s nabitou aminokyselinou 1. pro aa 2. pro tRNA 3. pro ATP Vazba správné tRNA je stabilizována konformační změnou enzymu, která umožní rychlou aminoacylaci. Pokud je navázána chybná tRNA, ke konformační změně nedojde. Výsledkem je pomalejší reakce a disociace tRNA. Přenos na ribozom Ribozomová etapa translace - 3 fáze 1. Iniciace translace - vazba mRNA a první aa-tRNA na ribozom 2. Elongace polypeptidového řetězce - průběžné přiřazování aminokyselin do rostoucího polypeptidového řetězce podle kodonů na mRNA 3. Terminace translace - zakončení syntézy polypeptidového řetězce, odpoutání mRNA z ribozomu a jeho rozpad na podjednotky 22 Zařazování metioninu do polypeptidu během iniciace translace a během její elongace u prokaryot - odlišné vlastnosti tRNA vázajících Met Podobá se spíše peptidyl-tRNA tRNA,fMet Metionin Met-tRNAfMet ___. formyl > fMet-tRNAfMet IF2 30S Vazba n< kodon AU ribo a iniciační G v P místě zomu tRNAMet Met-tRNAMet EF-Tu Kompletní ___. ribozom, vazba v A-místě Vazba na kodon AUG pro Met uvnitř genu fMet -protein Deformylace (deformyláza) fMet (aminopeptidáza) 23 Metionin je po vazbě na fmet-tRNAi formylován na formylmetionin, který je po začlenění do polypeptidu deformylován na metionin, který může být následně z N-konce polypeptidu odstraněn H H N—C 2 blokuje NH2-skupinu COOH H H N-C CH formyl COOH H CH2 transformyláza CH metionin CH CH S I CH N-formylmetionin deformyláza aminopeptidáza K formylaci metioninu dochází také u mitochondrií a chloroplastů 24 A) Struktura iniciátorové tRNA Formylated amino acid Met I C A formylace G-C C-G G-C G-C G-C C G G C C s G U U G G. C G AG C i i • i GCUC UG DA G A G U-A C-G U G G U A A A C G C < G°C C A U A C A U A B) Formylace metioninu na iniciátorové tRNA H II CHSSCH2CH2 - C - NH2 I c=o I CH3SCH2CH2 - C-NH-C-H c=o o I Met-tRNA r 10-formyl tetrahydrofolate Sekvence umožňující vstup do P místa N-formyl-Met-tRNAf tetrahydrofolate 25 Tři fáze translace u prokaryot Iniciace translace u prokaryot (E. coli) Elongace polypeptidového řetězce (1) (Metj Aminoacyl-tRNA vstupuje do místa A ribozomu. Přenos rostoucího polypeptidu z tRNA v místě P na tRNA v místě A. peptidyltransferáza (aktivita podjednotky 50S) EF-Tu-GTP: vnáší aa-tRNA do místa A, při tvorbě peptidové vazby je GTP hydrolyzován na GDP EF-G-GTP: zajišťuje translokaci ribozomu o jeden kodon Elongace(2) pokr. předchozího obrázku flw/ 2 \7 Opakování kroku 3. ■ Translokace tRNA s rostoucím Polypeptiden! navázaným z mista A do místa P a tRNA přecházející do místa E 5'1 J Opakování kroků 1-3 Translokace ribozomu o jeden kodon Elongační fáze translace 1. aa-tRNA (druhá a všechny další) vstupuje do místa A a váže se svým antikodonem na kodon mRNA v A místě 2. Vytváří se peptidová vazba mezi poslední aminokyselinou rostoucího polypeptidu a aminokyselinou vázanou na tRNA, která se posunuje do místa P. Začíná translokace ribozomu. 3. Ribozom se posunuje na mRNA o jeden kodon, prázdná tRNA ze uvolní z místa E 4. Do místa A vstupuje další aa-tRNA rostoucí polypeptidový řetězec Účast translačních faktorů při zajištění přesnosti translace 1. aa~tRNA pevně vázaná na EF-Tu se přechodně váže s kodonem v A-místě 3OS. 2. aa~tRNA se nachází v hybridním místě, párování kodon-antikodon vede k hydrolýze GTP navozené EF-Tu. Chybné zařazení tRNA zpomaluje hydrolýzu a aa~tRNA tak může opustit ribozom ještě před vytvořením peptidové vazby. Časový prostoj mezi vazbou aa~tRNA na kodon a její dostupností pro elongaci zvyšuje přesnost translace 3. V případě zařazení správné aa~tRNA dochází k disociaci EF-Tu a aa~tRNA se tak dostává do místa A a může se účastnit elongace peptidového řetězce. 4. Na ribozom do (nebo poblíž) místa A na 50S se váže EF-G +(GTP) a urychluje pohyb tRNA do hybridních míst A/P a P/E. 5. Kontakt EF-G s ribozomem stimuluje GTP-ázovou aktivitu EF-G - dochází ke konformační změně EF-G, pomocí níž je tRNA přesunuta z hybridního místa A/P do místa P a proces translace tak posune o jeden kodon = translokace ribozomu. Rychlost syntézy: 2-20 aminokyselin/sec Terminace syntézy polypeptidového řetězce Terminace translace 1. Do místa A se dostává terminační kodon na mRNA 2. V místě A se na terminační kodon váže terminační (uvolňovací) faktor (RF1,RF2 n. RF3 3. Změna aktivity peptidyltransferázy vede k uvolnění karboxylového konce peptidového řetězce z P místa, volná tRNA se přesouvá do E místa a opouští ribozom 4. Ribozom disociuje na podjednotky, které se mohou účastnit dalšího cyklu translace stop hQ AUGAACUGG CGAUCG Struktura lidského terminačního faktoru eRFI a jeho podobnost s molekulou tRNA terminační faktory = molekulární mimikry 36 Zakončení translace molekulou tmRNA tmRNA (transfer/messenger RNA) mRNA s neúplnou délkou - chybí STOP kodon „krátká zpráva" Short message (~10aa) mRNA Pozastavený ribozom na mRNA rava > age / Stop codon tmRNA nesoucí alanin (~ alanyl-tRNA) navázaná v A místě ribosome stalled on broken mRNA LrUHJTJ-UTJ-lj elongation resumes using codons of tmRNA •OOOOOOCOOOO incomplete protein 11-amino acid tag Degradace peptidu specifickou tag-proteázou Inkorporace selenocysteinu do polypeptidového řetězce - čtení bifunkčního kodonu UGA senné —-i A C U i seryl-tRNA synthetase selenocysteine tRNA SELB selenocysteine-specific translation factor A C U serine enzymatically converted to selenocysteine Speciální tRNASec selenocysteine added to growing peptide chain Potenciální stop kodon UGA Speciální sekvence pro SELB (Element SECIS) Vnášení tRNA-sec na vnitřní stop kodon UGA a) U bakterií b) U savců Single protein binds tRNA-Sec and stem - loop 3' m RNA Vlásenka je součástí kódující sekvence mRNA i CH2 OH serin h2n- h I ■ c — cooh cil h Cysteine eEFsec mRNA Vlásenka je součástí 3'netranslatované mRNA h h2n — c — cooh ch, h Selenocysteine Translace u eukaryot iniciační tRNA 1. na čepičku na mRNA se postupně navážou elF-4F, elF-4A, a elF-4B (dohromady tvořící CBP-protein) 2. Je vyhledán iniciační kodon a Met-tRNAmet je umístěna proti němu (v P místě) 3. Uvolní se iniciační faktory a připojí se podjednotka 60S 4. Začíná fáze elongace EF-1 a EF-2 (analogy EF-Tu, Ts) malá ribosomální podjednotka s navázanými iniciačními faktory Met vazba mRNA mRNA i;3' r Ji S čepička RNA iniciační tRNA se péaybtijes poděl m RNA,, a hledá první triplet ÄUG 13' iniciační — faktory dísoclufí Mét i naváže sc velká ribosomální podjednotka l;3' naváže se amihoacyl-tRNA (1. krok) 5' tvůň:sa první peptídové vazba (2, krok) elF4A a B se podílejí na rozmotání sekundární struktury mRNA elF6 udržuje ribozom v disociovaném stavu 1. u baktérií se iniciační komplex tvoří přímo na sekvencích ohraničujících AUG 2. u eukaryot nejdříve 40S rozpozná 5' konec mRNA a pak se pohybuje k iniciačnímu místu, kde se spojuje s 60S atd. elF-2 Met initiator tRNA JB small ribosomal subunit with initiator tRNA bound AAAAAAAA^^ ■elF-4G 9 Met P mRNA elF-4E 5' cap additional initiation factors mRNA ® + INITIATOR tRNA MOVES ALONG RNA SEARCHING FOR FIRST AUG ,3 Met - 1 Pi + elF-2 AND OTHER INITIATION FACTORS DISSOCIATE LARGE RIBOSOMAL SUBUNIT BINDS AMINOACYL-tRNA BINDS (step 1) FIRST PEPTIDE BOND FORMS (step 2) Iniciace translace u eukaryot eIF-4G je vázán na polyA-konec RNA a na eIF-4E vázaný na čepičku = překládány budou jen mRNA s úplnou délkou 41 Standardní signální sekvence exportovaných proteinů Pozitivní doména Hydrofobní doména Oblast štěpení zbytek proteinu fMet ■ i místo štěpení vedoucí (signální) peptidáza 42 Kotranslační export proteinů u bakterií 43 Syntéza extracelulárních a membránových proteinů preprotein = polypeptid se signálním peptidem na N-konci SRP odstraněn a recyklován 44 Translokace proteinu membránou do vnitřního prostoru endoplazmatického retikula 45 Začlenění transmembránového proteinu do membrány ER íničíačrtľsekvtrice (start-trařisfer) tsřrniftafcnf sekvence tétQp-tíansferj Hydrofobní sekvence signál rv' peptidáza hotový ťřansmarnbránový protein v měmbfanš ER 46 Posttranslační procesy 1. Kotranslační úpravy * deformylace * odštěpení aminokyselin Z N-ko n ce a m in opep t id ázo u * chemické modifikace aminokyselin (hydroxylace, fosforylace, acetylace. aj). * tvorba disulfidových můstků - vznik terciární struktury * připojení cukerných zbytků (oligosacharidů) - glykozylace, vznik glykoproteinů * vznik sekundární a terciární struktury 2. Posttranslační úpravy * vy štěpení peptidů (proinzulin > inzulín) * tvorba kvarterní struktury (spojování protomerů do aktivních oligomerů) * přidání prostetických skupin, koenzymů apod. (hemoglobin) * posttranslační štěpení polyproteinů (polypeptidový prekursor > peptid , např. ACTH) * proteinový sestřih (vyštěpení IVPS - intervening protein sequence), vytvoření nové peptidové vazby 3. Sestavování oligomerních proteinů a nadmolekulárních struktur (nekovalentní interakce mezi rozpoznávacími místy polypeptidových řetězců) * tvorba organel (membrány aj) účast chaperonů a chaperoninů při sestavování struktur 4. Samosestavování (spontánní seskupení proteinových podjednotek) * ribozomy * morfogeneze virů (sestavení virových kapsidů) 47 Modifikace aminokyselin Dekódováním mRNA při translaci je možno do bílkoviny vybrat jen asi 20 aa - z bílkovin lze však vyizolovat až 100 různých modifikovaných forem aminokyselin: hydroxylovaný p roli n a lyzin fosforylovaný serin, treonin, tyrozin c) karboxylovaná kys. glutamová acetylovaný lyzin metylovaný lyzin a prolin adenylovaný tyrozin glykozylované zbytky modifikace lipidickými zbytky * zbytky nenasycených mastných karbonových kyselin (acylace: 12C - laurylace, 14C - myristylace, 16C - palmitylace) * zbytky polyizoprenového charakteru (iso/prenylace: 15C - farnesylace, 20C - geranylgeranylace) Mnohé modifikační enzymy se nacházejí v ER a Golgiho Mikrozomální aparátu, někdy však dochází ke změnám až mimo buňku. frakce 48 Průběh vzniku funkčního proteinu Nascentní polypeptidový řetězec Sbalování, vazba kofaktorů (nekovalentní interakce) Kovalentní modifikace (glykozylace, fosforylace, acetylace aj) Vazba dalších proteinových podjednotek Zralý funkční protein 49 Kotranslační sbalování proteinu Sbalená C-terminální mRNA rtbosome 50 Sbalování proteinů za účasti chaperonů Nesbalený protein Správně sbalený protein Molekulární chaperony/chaperoniny • speciální skupina proteinů podílejících se na sbalo-vání polypeptidů (zabraňují chybnému sbalování) • hlavní rodiny chaperonů: proteiny hsp60 a hsp70 Ohsp70: rozpoznávají krátké úseky polypeptidů tvořené hydrofobními aminokyselinami během jeho syntézy na ribozomu OHspóO (GroE; Hsp60/Hsp10): vytvářejí soudkovité struktury, v nichž se upravují kompletně nasyntetizované proteiny Dva obecné mechanismy působení chaperoninů Hsp70 and partially folded B) GroE Unfolded protein GroE-type chaperone Folded protein Folded protein Účast chaperonů na procesu sbalování proteinů správně sbalený Polypeptid Hsp70 se váže na hydrofobní oblasti (GroEL, GroES) proteinu a zabraňuje jeho agregaci. Další úlohy: • transport • disagregace denaturovaných hsp = heat shock protein proteinů (např. Hsp60) 54 Posttranslační úprava proinzulínu stepem C-řetězec Enzymaticky se vyštěpí A- řetězec stepem B-řetězec 55 Proteinový sestřih srovnání způsobů odstraňování intronů a inteinů Dna Exon 1 Intron Exon 2 Extein 1 Intein Extein 2 Inteiny byly zjištěny u kvasinek, řas, bakterií a archeí - obvykle je přítomen j en j eden intein, výjimečně dva Krom .extein 1 d From r í From exon 1 intein From exon 2 \ From extein 2 _Intein katalyzuje své SPl.ICING OF PROTEIN ^ -| . r >w Á >w r vlastni vystepeni Protein prior to splicing ^vein I ■Mi QfS Průběh sestřihu inteinu probíhá autokatalyticky ve dvou krocích 1 Extein 1 je uvolněn a připojen k cysteinu exteinu 2 - vzniká větvený intermediát Intein je vyštěpen a oba exteiny se spojí peptidovou vazbou do zralého proteinu / 4^ exteins rearrange sh Extein 1 Cys Final protein formed Inteins are currently known in more then 200 types of proteins with diverse in functions. These proteins include metabolic enzymes, DNA and RNA polymerases, proteases, ribonucleotide reductases, and vacuolar-type ATPases. Sestřih inteinu (proteinový sestřih) Intein-containing gene Transcription Intein DNA jumps Cut by the intein Genová konverze Intein homing N-extein Sestřih Sekvenčně-specifická endonukleáza Štěpení genu bez inteinu v místě, kam se má začlenit intein Konzervativní sekvence aminokyselin Intein-minus gene 140-850 aa +/- homing endonuclease gene (HEG) 58 Samosestavování (self-assembling) TRI SESTAVOVACÍ ŘADY hlava vlákna ocásku bazálni destiéka TTT bazální - destička spojená s proteiny dutiny ocásku T přípojení obalového pro Seinu kompletní fágový virion kompletní vlákna ocásku + labilní faktor Vytváření nadmolekulárních struktur, spojování proteinů nekovalentními vazbami Čísly jsou označeny strukturní geny, kterými jsou kódovány proteiny fága Buněčné mechanismy monitorující kvalitu proteinů po translaci Nově :■ syntetizovaný protein *:-£ľ -mii i i iiii ň r..... ■•• Proteinové agregáty Správně sbalen bez cizí pomoci Správně sbalen s pomocí chaperonů Neúplně sbalená forma je rozložena v proteazomu 60 Odbourávání proteinů v proteazomech (eukaryota) Označování proteinů ubiqutinem A. Aktivace ubiquitinu prostřednictvím enzymů El, E2 a E3 ubiquitin B. Připojení ubiquitinu na cílový protein Ubiquitin či ubikvitin (z lat. ubique, všude) je malý globulární protein o délce 76 aminokyselin, přítomný ve všech eukaryotických buňkách, který reguluje rozklad jiných proteinů v proteazomu, lyzozomu či ve vakuole. V určitých případech však také stimuluje endocytózu, vnitrobuněčný transport a podílí se na udržování struktury chromatinu (ubikvitin se váže se na histony). Ubiquitin se zpravidla připojí na protein, který má být rozložen (degradován), tento proces navázání ubiquitinu se označuje jako ubiquitinace. Váže se glycinem (na svém C-terminálním konci) k lysinu na proteinu určeném k degradaci. Po připojení ubikvitinu je označený protein degradován proteasomem 26S. Tato degradace je specifická a přesně cílená, je tedy často využívaná pro specifické odstranění proteinů signálních drah. Proteiny degradované proto, aby jejich aminokyseliny, případně peptidy mohly být použity jako stavební kameny, bývají degradovány spíše nespecificky proteázami. Mechanismus připojení Na cílový protein, určený k degradaci, se ubikvitin váže pomocí tří enzymů, aktivačního El, konjugačního E2 a ligačního E3. Ligační enzym se spojí s cílovým proteinem. Aktivační enzym nejprve ubikvitin aktivuje na účet ATP a poté ho předá konjugačnímu enzymu, který se spojí s komplexem, tvořeným ligačním enzymem spojeným s cílovým proteinem určeným k degradaci. V tomto komplexu tvořeným E2, E3, ubikvitinem a cílovým proteinem pak dojde k navázání ubikvitinu na cílový protein. E2 a E3 se recykluje. 63 64 65