Cytologie a morfologie bakterií
I.
Unikátní vlastnosti prokaryotických buněk
Bakteriální prokaryotická
buňka
obvykle samostatné buňky
Velmi málo
vnitřních struktur
Většina dějů
na CM membráně
Stěna spory: jiné a unikátní
složení peptidoglykanu!
Gmeso-diaminopimelová
kys.
G+
L-lysin
Peptidoglykan
„Model tekuté mozaiky“ tvořený tekutou fází lipidů je prostoupen globulárními
proteiny, které jsou jednak periferní (umístěné na povrchu membrány) a
integrální, prostupující celou membránu.
Bičík
Uspořádání: taxonomický znak
Rozdíl mezi
G+ a G-
Weng and Xiao; 2014
Cytoplazma
- Organizovaná
- Difúze či řízené
mechanizmy
Bakteriální cytoskelet
Bakteriální buňka obsahuje řadu vláknitých
proteinů nutných pro:
• regulaci tvaru buňky
• buněčné dělení a
• segregaci chromozomů
• rozdělování plazmidů
• buněčné polaritě
Jsou analogické všem třem
cytoskeletárním strukturám
eukaryotní buňky (3D
strukturou a biochemickými
vlastnostmi)
Bakteriální buňka je
polarizovaná
Shapiro; 2002
Zvláštnosti prokaryotické buňky
• živý, otevřený systém schopný regulace a autoreprodukce
• jádro neodděleno od CPL membránou, větš. kruhová (i lineární) DNA,
bez intronů
• haploidní buňky (1 alela)
• bez buněčných organel, jediná membrána je cytoplasmatická
• ribosomy se liší od ribosomů eukaryotních buněk – menší, volně v CPL
16S rRNA (malá podjednotka), 5S rRNA a 23S rRNA (velká p.)
translace začíná N-formylmethioninem
specifické struktury a vlastnosti bakt. buňky:
peptidoglykan (až na mykoplasmata)
steroly v membránách zcela výjimečně
bičík – globul. bílk. flagelin, pohyb rotací
bakteriální ribozom
G-G+
E. coli
S. aureus
peptidoglykan
Archea –
extrémní podmínky:
• PEPTIDOGLYKAN
• CM – 1 vrstevná
Bacteria vs. Archaea !!
strukturní shody
ale rozdílné chemické složení
• ---- rozdílná citlivost na ATB
• tRNA archeí podobná eukaryotické
PSEUDOPEPTIDOGLYKAN
Cavalier-Smith T (2002)
Cytoplazmatická membrána archeí
Sulfolipidy, glykolipidy, nepolární isoprenoidní lipidy, fosfolipidy, větvené lipidy, mnoho
proteinů v membráně
FOSFOLIPID:
(1) chiralita glycerolu (L-glycerol; dáno enzymy)
(2) etherové vazby - glyceroldiether, tetraether
= jiné chem.vlastnosti fosfolipidů
(3) řetízky isoprenoidů namísto MK
(4) větvení isoprenoidu
Nepřítomnost sterolů
Často jednovrstevná
glycerolové jednotky na obou koncích MK
tvoří 1vrstvu
Lepší přizpůsobení extrémům
– monolayer rezistentnější k narušení teplem
II. Volba správného typu mikroskopie pro pozorování
cytologických a morfologických znaků
Anthony van
Leeuwenhoek
Z 50 – 275 x, 17.stol
Janssenovi Z 9 x, ~1595
Anthony van
Leeuwenhoek
První nákresy bakterií
(z ústní dutiny člověka)
SEM Treponema
pallidum
útočící na membránu
savčí buňky
Mikroskopie – nutno
zvolit vhodný typ
techniky dle
sledované struktury
Světelný mikroskop (1000x) vs. Elektronový
(100 000x)
Světelný mikroskop
- Jasné pole
Světelný mikroskop
- Fázový kontrast
Rastrovací
elektronová
mikroskopie
Jasné pole,
1000x
Rastrovací elektronová mikroskopie
(skenovací, řádkovací, Scanning Electron Microscope - SEM)
Popularita SEM pramení z
možnosti získat obrázky povrchů
širokého spektra objektů
Skenovací tunelová elektronová mikroskopie
(scanning tuneling electron microscopy, STM)
Metoda umožňuje pozorovat detaily buňky a virových částic.
Ke kontrastnímu znázornění zvýraznění struktur se používá negativní
barvení solemi těžkých kovů, které nepropuštějí elektrony například
uranyl acetát, molybdenan amonný.
Transmisní elektronový mikroskop (TEM)
Cytologie a morfologie buňky
• PREPARÁT pro světelnou mikroskopii
- co chceme vidět? – podle toho příprava preparátu
tvar buňky – fázový kontrast, barvený fixovaný prep.
pohyb buňky – fázový kontrast, fluorescence
barvené struktury – pomáhají identifikaci (PHB, síra..)
typ buněčné stěny – Gramovo a acidorezistentní b.
rychlá
příprava
nativního
preparátu
barvení buněk a
spor za horka
a struktur
Gramovo barvení
U jednoho bakteriálního rodu
různý vzhled char. tvaru buňky!
• Př: tyčky bacilů •Haemophilus
Bacillus
anthracis
Bacillus
cereus
Bacillus
subtilis
10 μm
H. influenzae
H. ducrei
•Pseudomonas
P. aeruginosa
P. fluorescens
Bacillus
mycoides
Velikost a tvary bakteriální buňky
velký poměr povrch/objem – velká plocha kontaktu buňky s prostředím
• Velikost bakt b. v µm
Chlamydia 0,3 x 0,3
Bdellovibrio 0,8 x 0,3
Rickettsia 1 x 0,3
S. aureus 0,8-1 x 0,8-1
E. coli 2-3 x 0,4-0,6
B. subtilis 1,8-4,8 x 0,9-1,1
Streptomyces vlákno x 0,7-
1,6
Chromatium 25 x 10
Spirochety 500
• Tvary bakt. buňky
Koky - sférické, oploštělé, lancetovité
- diplokoky, streptokoky, tetrády,
sarciny, stafylokoky
Tyčinky – rovné, zakřivené, větvící se,
palisády pleomorfní
Kokobacily
Pupeny
Prostéky
Spirily
Hvězdice
Mycelia
750 µm - největší známá prokaryotní buňka,
objevená r.1999: Thiomargarita namibiensis
Nejmenší (např. někteří příslušníci rodu
Mycoplasma) měří 100 až 200 nm
Morfologie
• Buňky
• Charakteristických shluků buněk
• Buněčných útvarů (spory,
konidie, sporangia, pouzdra..)
• Bakteriální kolonie
Pozor na: stáří kultury a
pleomorfní buňky
Clostridium
botulinum
endospora
buňka char.shluk
kolonie sporangium
spory
Většinou druhově charakteristické
= identifikační znak
Arthrobacter
Azotobacter
Pleomorfní buňky rodu
Corynebacterium
Mycobacterium avium-intracellulare
Acidorezistentní barvení buněk
histologického řezu lymfatické uzliny
Pleomorfní buňky
M. tuberculosis
Morfologie pleomorfních buněk.
Další potíž:
Jsou barvitelné Gramem?
Haemophilus – ano
Mykobakteria, mykoplazmata - nikoli
Acidorezistentní buňky:
Odmítají Gramovo barvení
Odmítají se po nabarvení odbarvit
ethanolem
i kyselinou. Př: Nocardia…
Bez b.s.
Mykolové kys
Mycobacterium tuberculosis
Zeihl-Neelsonovo barvení (červeně)
Je neznámý
vzorek
vůbec
barvitelný
Gramem?
Není gramlabilní?
Fáze tyčka – kok?
S barevným filtrem
Cíl
mikroskopie?
Typ preparátu
Typ mikroskopie
(typ b. stěny,
průkaz struktur,
růstového cyklu)
Živý (nativní) preparát bez fixace–
vidíme nedeformovaný tvar buňky,
spory, morfologii seskupení buněk, pohyb buněk Živé a mrtvé b., pohyb
Fixov. prep. – tvar a typ b.
Fixov. prep.
nebarvitelný Gramem
Bacillus anthracis
Ústní
mikroflora
Lactococcus
lactis
Staphylococcus
aureus na pokožce
Proteus
Streptomyces
kolonie sporangium
spory
Produkce ATB
Struktury G- buňky
Le
pto
spi
ra
III.
Buněčná stadia
při dělení buňky
Cytologické a morfologické proměny
vstup parazitické, patogenní fáze do buňky
(př: remodelace proteinů listerií)
Struktury a jejich konformace závisí.......
Od jakých procesů se odvíjí cytologie a
morfologie bakteriálních buněk?
Prosté binární dělení
anebo
přítomnost růstových cyklů?
Binární dělení bakteriálních buněk
• Funkce bakteriálního
cytoskeletu
(přepážka, pohyb struktur)
• Ori C
• Zdvojení genetické
informace
Posuzujeme-li vzhled buňky kmene
určitého bakteriálního druhu, je třeba si uvědomit:
1) Prochází sledovaný druh růstovým cyklem?
- v každém z nich má pak buňka jinou cytologii a morfologii
Př: Chlamydia, Bdellovibrio, Streptomyces, Caulobacter,
myxobakterie….
Mění se nejen vzhled buňky,
ale buňka v cyklech prochází
typickou změnou vnitřních
struktur.
Buněčný cyklus
Caulobacter crescentus
Jiné životní cykly než binární dělení
Střídání přisedlého a volného stadia
Caulobacter
Sphaerotilus
Jiné životní cykly než binární dělení
Střídání infekčního a reprodukčního stadia
Chlamydie – retikulární a elementární
tělíska
Bacillus
Bdellovibrio
Myxobakterie
2) Vytváří posuzovaný druh endospory?
- v preparátu pak mohou měnit tvar buněk!
„Voják umírající na tetanus“
Sir Charles Bell
lukovité prohnutí zad (opistotonus)
křečovitý výraz
Originál je k vidění:
Royal College of Surgeons
of Edinburgh, Scotland.
Clostridium difficile
Clostridium tetani
Bacillus
anthracis
3) Stárnutím mění buňky tvar
4) Závislost tvaru buňky na vnějším prostředí
- živiny, tlak, osmolarita…
5) pleomorfní buňky – př. rody
Mycobacterium, Corynebacterium,
Haemophillus, Mycoplasma
Morfologie charakteristických shluků buněk
• typické shluky napomáhají identifikaci
řetízky koků: Streptococcus
řetízky bacilů: Bacillus
palisády: Corynebacterium
tetrády koků: Micrococcus
balíčky = sarciny Sarcina hrozníčky:
Staphylococcus
Streptococcus
Micrococcus
Staphylococcus
Bacillus
Mikrokolonie E. coli vznikající ze tří mateřských buněk (na agaru)
- charakteristický vzhled vznikajících útvarů dělících se buněk u růz. rodů….
ASM Microbe Library. J. Shapiro and C. Hsu
Morfologie bakt. kolonií
• potřeba zvážit typ media, ne kterém kolonie hodnotíme!
kultivace - zda vůbec kultivovatelné?? - sledování typu
kolonií
• stáří kultury
Př: sledování morfologie kolonií
– univerzální media, jiný vhled na
selektivním – zda vůbec růst či ne? barevná reakce?)
S-, R- a M-formy
sledování pohybu terasovité kolonie (Př: Proteus)
Proteus
Proteus – pohyb buněk
Bacillus mycoides
Serratia
marcescens
StreptomycesStreptomyces
Morfologie bakteriálních kolonií
I. na základních půdách
Nocardia
E.coli na krevním agaru E.coli na MacConkey agaru
Lac+
E.coli na agaru EMB (Eosin Methylene Blue Agar)
Bakteriální kolonie na
II. diagnost. půdách
Jeden druh
bakterie
různá media
E.coli na C.L.E.D. mediu Cysteine Lactose Electrolyte Deficient Agar
Kontaminace na misce!
Sylabus cvičení
• 24.9. – úvod, práce s programem Nis – Elements, rozdělení
do pracovních skupin
• 1.10. – ukázka elektronové mikroskopie
• 8. a 15.10 – Gramovo barvení, negativní barvení, nativní
preparát
• 22. a 29.10. – struktury buňky
• 5. a 12.11. – pohyb buněk
• 19. a 26.11. – acidorezistentní barvení
• 3. a 10.12. – zaočkování sklíčkových kultur; flourescence
• v týdnu 14. – 18. 12. pozorování sklíčkových kuktur
Bezpečnost a zásady práce
Plášť, přezůvky, skříňky, jídlo, pití
Po vstupu do laboratoře či před zahájením
práce prosím o mytí rukou;
test účinnosti mytí rukou
Stoly – před a po práci Incidur, ethanol
MO – Biohazard group 0
Mytí rukou před návštěvou toalety!!!
29
!! : případně
ethanol
Kahan zapnutý jen po dobu práce s ním
MO – Biohazard group 0
Nemluvit při očkování mikroorganismů
Misky s bakteriálními kmeny otevírat co nejméně
a po práci správně zavřít
Sterilní práce – žíhání kličky v plameni kahanu..
30
Popisování misek: zespodu,
svrchu – dle metody!!
O náplni cvičení se informovat předem
Viz Studijní materiály - příprava
Nevylévat nic do odpadu – stůl: odpadní nádobky
Prosíme neodnášet kultury!
31