1
Editace genomů
Genome editing, or genome editing with engineered nucleases
(GEEN)
Postupy genového inženýrství, při nichž se do vybraného místa v
cílové DNA pomocí uměle připravených nukleáz (tzv. molekulárních
nůžek) vnáší inzerce, delece a nebo se stávající sekvence nahrazuje
za jiné (náhrada alel).
Tyto nukleázy vytvářejí na určených místech genomu dvouřetězcové
zlomy (DSBs: double-stranded breaks), čímž vyvolávají přirozené
endogenní buněčné procesy vedoucí k reparaci zlomů:
a) Homologní rekombinací (HR) HDR = homology directed recombination
(rekombinace řízená homologií)
b) Nehomologní spojování volných konců (NHEJ: nonhomologous end-joining)
2
- editace probíhá s přesností až 1 nt
- používají se uměle připravené nukleázy – modifikace přirozeně se vyskytujících
- podstatou je tvorba zlomu v řetězci DNA (1 ale i 2 zlomy)
- v místě štěpení - vznik mutace
- vyštěpení celého úseku DNA (genu)
- náhrada úseku DNA
- lze připravit mutace jakéhokoli typu (včetně náhrady alel – „gene replacement“)
- důležitá je funkce reparačních systémů buněk – endogenní procesy
- „nezávisle“ na vnesené DNA/RNA
3
Historické etapy v CRISPR biologii a editování genomů
4
- poměrně vysoká frekvence HDR u kvasinek
- přenos His3 genu (do His3- kmene)
- pozitivní selekce na His
- využití neg. selekčního markeru (Ura)
- vně sekvence
- vytvořeny buňky His3+ a URA-
5
(RGENs) = RNA-guided engineered nucleases
- programované nukleázy (jejich cíl je řízen molekulou RNA)
Procesy probíhající po vytvoření DSB umělými nukleázami
- snaha o vývoj systému pro sekvenčně specifickou tvorbu dsDNA zlomů
Lidský genom – 3,2 Gbp – cílem musí být jedinečné sekvence (specificita)
- sekvence delší než 20 bp
7
klasická NHEJ
- rychlý proces (10-30 minut)
- výsledkem jsou malé inzerce/delece
- existují i alternativní NHEJ
př. microhomology-mediated end joining (MMEJ)
- rozsáhlé inzerce, delece, fůze, …
8
HDR
- složitější (pomalejší) proces
- zapojeno více proteinů
- nutná přítomnost homologní sekvence
- výsledkem přesně opravená DNA
9
Procesy probíhající po vytvoření DSB umělými nukleázami
10
Overview of possible genome editing outcomes using site-specific nucleases. Nucleaseinduced
DNA double-strand breaks (DSBs) can be repaired by homology-directed repair
(HDR) or error-prone nonhomologous end joining (NHEJ). (A) In the presence of donor
plasmid with extended homology arms, HDR can lead to the introduction of single or
multiple transgenes to correct or replace existing genes. (B) In the absence of donor
plasmid, NHEJ-mediated repair yields small insertion or deletion mutations at the target
that cause gene disruption. In the presence of double-stranded oligonucleotides or in vivo
linearized donor plasmid, DNA fragments up to 14 kb have been inserted via NHEJmediated
ligation. Simultaneous induction of two DSBs can lead to deletions, inversions
and translocations of the intervening segment.
11
Typy nukleáz používané pro editaci genomů
Rozpoznání sekvence
Interakce protein x DNA
Rozpoznání sekvence
Interakce protein x DNA
Rozpoznání sekvence
Interakce protein x DNA
12
Meganukleázy se vyskytují u různých druhů mikroorganismů, mají velmi
dlouhé rozpoznávací sekvence (>14bp vs. RE 4-6 bp) a jsou tak přirozeně
sekvenčně velmi specifické.
Nevýhodou je, že je jich známo relativně málo, a tudíž počet cílových
sekvencí je omezen.
Mutagenezí byly uměle připraveny varianty meganukleáz, které rozpoznávají
další jedinečné sekvence. Byly připraveny rovněž hybridní varianty
meganukleáz fúzí dvou domén s odlišnými cílovými místy.
Byl použit též postup záměn aminokyselin v doménách interagujících s DNA
a docíleno vysoké specifity rozpoznání (method named rationally designed
meganuclease (US Patent 8,021,867 B2).
Meganukleázy jsou méně toxické pro buňky než ZNF díky tomu, že mají vyšší
specificitu/stringenci rozpoznání cílových sekvencí DNA.
Jejich navrhování je však časově náročné.
MEGANUKLEÁZY
13
i meganukleázy nebakteriálního původu - LAGLIDADG family of homing
endonucleases (kódovány introny nebo inteiny), často v mitochondriích a
chloroplastech
I-SceI 18-bp z mitochondrií Saccharomyces cerevisiae
I-CreI chloroplasty Chlamydomonas reinhardtii
I-DmoI archea: Desulfurococcus mobilis.
oproti RE:
- delší rozpoznávací sekvence (nemusí být palindrom, často asymetrické)
- vyšší tolerance k malým substitucím v rozpoznávací sekvenci
- obvykle vyžadují součinnost dalších proteinů
14
Enzym FokI přirozeně se vyskytující u Flavobacterium okeanokoites je
restrikční endonukleáza typu IIS (štěpí blízko rozpoznávací sekvence). Je
tvořena N-terminální vazebnou doménou a nespecificky štěpící doménou na
C-konci.
Výhody FokI pro její využití v GI:
- Rozpoznávaná sekvence je oddělena od sekvence, která je štěpena – to
umožňuje izolovat doménu enzymu, která štěpí sekvenčně nespecificky.
Tato doména pak může být spojena s doménou zodpovědnou za rozpoznání
cílové sekvence.
- FokI vyžaduje pro svou nukleázovou činnost dimerizaci – zvýší se tím
specifita rozpoznání cílového místa.
- Byly připraveny modifikované FokI, které fungují jen jako heterodimery, což
zvyšuje specificitu rozpoznání cílových sekvencí a eliminuje možnost
vytváření nespecifického štěpení v případě homodimerů.
- využívá se pro konstrukci ZFN a TALEN nukleáz
NUKLEÁZA FokI
15
Typy nukleáz používané pro editaci genomů
16
Struktura proteinu obsahujícího zinkové
prsty (zinc finger)
Každý zinkový prst sestává asi ze 30 AA v
konformaci . Každý prst kontaktuje 3
nebo 4 bp ve velkém žlábku DNA.
Dimer Zinc-finger nukleázy (ZFN) navázaný
na DNA. Cílová místa pro vazbu ZFN
sestávají ze dvou vazebných míst pro
zinkové prsty, která jsou oddělena 5-7 bp
dlouhou sekvencí, která je štěpena štěpící
doménou FokI.
Protein TALE v komplexu s cílovou DNA.
Jednotlivé repetice proteinu TALE obsahují 33-
35 AA, které rozpoznávají jednotlivé páry bází
prostřednictvím dvou hypervariabilních zbytků
(repeat-variable diresidues – RVDs)
Dimer TALEN navázaný na DNA. Cílová místa
pro TALEN jsou tvořena dvěma vazebnými
oblastmi pro TALE oddělenými mezerníkovou
sekvencí různé délky (12-20 bp). TALE lze upravit
tak, aby rozpoznávala jedinečné sekvence vlevo
a vpravo.
17
Editace genomů pomocí ZFN
- produkovány již otestované firmami:
Sigma-Aldrich
Sangamo BioSciences
- transfekovány obvykle v podobě RNA (či DNA na vektoru)
18
(a) Schematic diagram of a ZFN heterodimer bound to the mutated mtDNA target. Each of the monomeric
ZFN consists of the FokI nuclease domain (FokI CD) linked to a zinc-finger peptide. One of the ZFNs
(NARPd, red) was designed to bind to the mutated mtDNA site, whereas its companion ZFN binds a native
sequence on the opposite DNA strand (COMPa, blue)19. (b) Schematic structure of mtZFN used in the
cleavage assay in c. 'mitochondrial targeting sequence (MTS) F' denotes the mitochondrial targeting
sequence of F1β-subunit of the human mitochondrial ATP synthase (see ANTICIPATED RESULTS for
details). (c) In vitro assay testing the specificity of the F–NARPd–Fok–NES and F–COMPa–Fok–NES
constructs (see ANTICIPATED RESULTS for details).
19
Gram negativní bakterie r. Xanthomonas infikují řadu rostlinných druhů, u nichž
mohou způsobovat onemocnění. Injikují svými sekrečními systémy do rostlinných
buněk řadu efektorových proteinů včetně TAL efektorů. TAL effectors (Transcription
Activator-like effectors) mají několik motivů včetně NLS, proto mohou vstupovat do
jádra, kde se vážou na promotorové sekvence a aktivují transkripci rostlinných genů,
které napomáhají bakteriální infekci (snížení hladiny Cu, zvýšení hladiny glukózy, …)
TAL obsahují v centrální části opakující se sekvence aminokyselin, které jsou dlouhé
obvykle 34 AA.
Typická repetice: LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHG, avšak v
pozicích 12 a 13 se vyskytují různé aminokyseliny (místo označované jako repeat
variable diresidue n. RVD) – tyto klíčové pro specificitu vazby na sekvenci DNA
Byly navrženy TALE (Engineered TAL effectors) schopné se vázat na jakékoliv
sekvence DNA díky záměnám aminokyselin.Takové umělé TALE lze využít pro
aktivaci nebo represi endogenů u rostlin i živočichů.
Engineered TAL effectors lze fúzovat se štěpícími doménami nukleáz (FokI) a
vytvářet tak TAL Effector Nucleases (TALENs).
TAL effectory (Transcription Activator-like effectors)
20
Struktura TALEN
21
Struktura proteinu obsahujícího zinkové
prsty (zinc finger)
Každý zinkový prst sestává asi ze 30 AA v
konformaci . Každý prst kontaktuje 3
nebo 4 bp ve velkém žlábku DNA.
Dimer Zinc-finger nukleázy (ZNF) navázaný
na DNA. Cílová místa pro vazbu ZNF
sestávají ze dvou vazebných míst pro
zinkové prsty, která jsou oddělena 5-7 bp
dlouhou sekvencí, která je rozpoznávána
štěpící doménou FokI.
Protein TALE v komplexu s cílovou DNA.
Jednotlivé repetice proteinu TALE obsahují 33-
35 AA, které rozpoznávají jednotlivé páry bází
prostřednictvím dvou hypervariabilních zbytků
aa (repeat-variable diresidues – RVDs)
Dimer TALEN navázaný na DNA. Cílová místa
pro TALEN jsou tvořena dvěma vazebnými
oblastmi pro TALE oddělenými mezerníkovou
sekvencí různé délky (12-20 bp). TALE lze upravit
tak, aby rozpoznával jedinečné sekvence vlevo a
vpravo.
22
Model for DNA-target specificity of TAL effectors. (A) TAL effectors contain central tandem repeats, NLSs, and an
AD. Shown is the amino acid sequence of the first repeat of AvrBs3. Hypervariable amino acids 12 and 13 are
shaded in gray. (B) Hypervariable amino acids at position 12 and 13 of the 17.5 AvrBs3 repeats are aligned to the
UPA box consensus (14). (C) Repeats of TAL effectors and predicted target sequences in promoters of induced
genes were aligned manually. Nucleotides in the upper DNA strand that correspond to the hypervariable amino acids
in each repeat were counted on the basis of the following combinations of eight effectors and
23
DNA binding code for TALENs
24
Schéma strategie pro přípravu genetických konstruktů exprimujících
chimerické proteiny TALEN – postupná ligace klonovaných monomerů
výsledkem je „skládačka“ cílená proti libovolné sekvenci DNA
- každý si může sám vytvořit (http://www.addgene.org/TALEN/)
K dispozici jsou knihovny monomerů, dimerů, trimerů a tetramerů
RE1 RE2 …
25
Umělé nukleázy
- odvozené od aktivátoru transkripce + nukleáz
- vazba na specifické místo v genomu
- do buněk se obvykle dopravují na expresních vektorech
- lze je využít pro tvorbu – bodových mutací …
- delecí
- inzercí
- inverzí
- duplikací
- translokací
… ale také pro značení mRNA
- podstatou je tvorba dsDNA zlomu a jeho oprava
- sekvenční specifita je dána DNA-protein interakcí
26
Systém CRISPR/Cas
- přirozený obraný systém bakterií a archeí proti cizorodé DNA
27
Fungování CRISPR-Cas9 komplexu
systém pravidelně uspořádaných mezerníků mezi
repeticemi CRISPR lokusu
cizorodé DNA rozpoznány proteiny Cas (CRISPR
associated proteins) a začleněny do CRISPR
lokusu
lokus má až několik stovek mezerníků, nový
mezerník, který je převzat z infikující molekuly, je
začleněn jako první (fáze akvizice/adaptace)
následně je lokus přepisován za vzniku
CRISPRové RNA (pre-crRNA), ta je dále
upravována do krátkých molekul CRISPRové
RNA (crRNA)
Asociace crRNA s transaktivační (transaktivující)
tracrRNA a následně s některým z CAS proteinů
tento komplex rozpozná a štěpí cizorodou DNA
28
3 hlavní složky systému – crRNA, tracrRNA, Cas proteiny (1-2)
- Úseky cizorodé DNA jsou začleněny do bakteriálního genomu do lokusů CRISPR
- Lokusy CRISPR jsou přepsány a upraveny do crRNA (crRNA biogenese)
- Během interference vytváří endonukleáza Cas9 komplex s crRNA a tracrRNA,
který pak štěpí cizorodou DNA obsahující sekvenci 20-ti nukleotidů
komplementárních k crRNA poblíž sekvence PAM.
29
30
Spojení
linkerem
sgRNA vytvořená fúzí crRNA a tracrRNA
31
Struktura chimerické sgRNA a kompexu sgRNA s Cas9 pro vytváření DSB v
cílových místech.
sgRNA je vytvořena spojením crRNA a tracrRNA.
NGG
32
PAM sekvence – protospacer adjacent motif
- sekvence v těsném sousedství s cílovou DNA sekvencí
- nutná pro účinné štěpení Cas9 nukleázou
- původní systém „NGG“ (rozpoznán Cas9 ze Streptococcus pyogenes)
- dle systému cílová sekvence musí být ve formátu N20-GG
- systémy jiných bakterií nebo upravené systémy – NAG, YG, TTTN, YTN, …
33
34
35
Srovnání struktury crRNA:tracrRNA a sgRNA
- systém lze exprimovat z jediného vektoru
36
Příprava konstruktu exprimujícího CRISPR/Cas element
hCas9 = sekvence proteinu Cas9 optimalizovaná pro expresi v
eukaryotických buňkách.
sgRNA = chimerická RNA obsahující úseky crRNA a tracrRNA, která je
nezbytná pro dosažení aktivity.
PAM není součástí klonované sekvence
- pro design lze využít dostupný software
- http://crispor.tefor.net/
- http://crispr.mit.edu/ https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/
Sekvence sgRNA je navržena tak, aby byla
komplementární k cílové genomové sekvenci
37
38
39
40
Možnosti editace genomů pomocí systému CRISPR/Cas9
TSS = transcription start site
EGFP = fluorescenční proteiny
dCas9 – deficientní na
nukleázovou aktivitu
Metylázy, acetylázy …
41
dCas9 + aktivační/represorová doména – regulace transkripce
- vazba dCas9 na DNA je reverzibilní – tedy i ta regulace je reverzibilní
(dočasná)
dCas9 + epigenetický regulátor – regulace transkripce
- přestože i zde vazba reverzibilní – epigenetické modifikace se mohou přenášet
do dceřiných buněk
42
dCas9 + fluorescenční značka
- i multicolor formát – více okusů najednou, chromosome painting …
- CRISPRainbow
Působení modifikovaného systému CRISPR/Cas9
Specificita – dána pouze 20 nt sgRNA
- úplná podobnost na 3´konci (seed) a
částečná na 5´konci (distal)
riziko vzniku off-target štěpení
50 - 1500x výšší specifita (n do 20 bp)
ještě vyšší specifita
44
A. Wt Cas9 nukleáza štěpí specificky dsDNA, vytváří DSB a tím navozuje reparaci. Za nepřítomnosti
homologní sekvence může dojít k nehomolognímu spojování konců (NHEJ) a vzniku ins/del mutací,
přerušujících zasažený gen. Za přítomnosti homologní sekvence může dojít k reparaci s využitím této
sekvence a jejími vložení do místa zlomu.
B. Mutantní Cas9 nukleáza vytváří místně specifické jednořetězcové zlomy. Dvojice takových sgRNA
může vést k tvorbě ds DNA zlomů, které mohou být reparovány s využitím homologní rekombinace či
NHEJ (jednořetězcové zlomy zvyšují účinnost HDR). Tento sytém zvyšuje specifitu tvorby ds zlomů.
C. Mutantní Cas 9 nukleáza může být připojena k různým efektorovým doménám, které umisťuje na
specifické sekvence. Mohou to být TF, represory, fluorescenční značky aj.
Analogie
ZFN a
TALEN
45
CRISPR DNA base editing
Fůze nikázy s cytidin deaminázou – konverze C na U blízko PAM
- následná konverze U na T díky BER
- tvorba substitučních mutací
46
CRISPR RNA base editing
CRISPR systémy Cas13a/C2c2 and Cas13b – substrátem je RNA
- fůze nukleázy defektního systému s adenosin deaminázou
- vzniká inosin (funkčně odpovídá G) – tedy z AT vzniká GC
- tvorba substitučních mutací na úrovni RNA
47
Genome wide screen
- tvorba rozsáhlé populace cílených mutací (3-6 gRNA na 1 gen)
- následně analýza fenotypu
- identifikace genů zodpovědných za určitý fenotyp
48
Izolace úseků genomu pomoci dCas9
enChIP (engineered DNA-binding molecule-mediated ChIP)
- Hmotnostní spektrometrie, NGS, …
49
Značení endogenních genů
- přidání značky (tag) pomocí HDR
50
51
Další CRISPR systémy
Cpf1
- má RuvC a nikoli HNH
- jediná RNA (vs. crRNA + tracrRNA)
- lepivé konce (vs. tupé konce)
- PAM (TTN) – AT bohaté oblasti (vs. NGG)
- low off-targeting frequency
Lepivé konce – možné využití pro přímý přenos genů (obdoba RE klonování)
52
1. Selection of a target nucleotide sequence in the genome;
2. Generation of a nuclease construct directed at the selected target;
3. Delivery of this construct to the cell nucleus; and
4. Analysis of produced mutations.
Obecná strategie genomového inženýrování
53
Current and future delivery systems for engineered nucleases: ZFN,
TALEN and RGEN
54
55
56
Příklady typů buněk a organismů, které byly geneticky
modifikovány pomocí Cas9
57
58
Izolace T lymfocytů z pacientů s různými
typy nádorových onemocnění
Editace genomu těchto T lymfocytů –
editace 3 genů
Otestování terapeutického potenciálu takto
editovaných buněk
Pacient s agresivním nádorem plic
Editace genu PD-1 T lymfocytů
Otestování terapeutického potenciálu takto
editovaných buněk
59
60
stovky off-target mutací u myší po editaci genomu metodou CRISPR/Cas9
vs
předchozí studie u linií a myší
61
However, we here demonstrate that the simplest interpretation of data in
Schaefer et al.1 is that the two CRISPR–Cas9-treated mice are
genetically more closely related to each other than to the control mouse.
62
Další možné využití CRISPR technologie
Detekce mutací – zlom v místě mutace indukovaný CRISPR technologií
- detekce mutací o nízké frekvenci (problém sekvenování)
63
CAMERA
CRISPR-mediated analog multievent
recording apparatus
- single cell resolution
- „záznam“ reakce buňky na stimul
- některé buňky ve směsi reagují/jiné nikoli
- lze kombinovat různé signály, jejich pořadí
64
DETECTR/SHERLOCK
- detekce specifické DNA
- využití Cas12/Cas13 (zůstává aktivní i po tvorbě ds zlomu – štěpí ss RNA/DNA)
- testováno na detekci různých kmenů HPV – některé spojeny s rizikem
karcinomů děložního čípku – rozlišeni infekce těmito kmeny (DETECTR)
- využití reportérových molekul – po štěpení vzniká fluorescence
- detekce infekce virem ZIKA (SHERLOCK)
65
Gene drive
- technologie genového inženýrství, která umožňuje rozšíření dané varianty
genu (ů) v populaci prostřednictvím zvýšení pravděpodobnosti přenosu na
potomky nad přirozenou hodnotu 50 procent
- pouze u jedinců s pohlavním rozmnožováním
66
Gene drive
- i přirozené mechanismy – popsány alely genů, jež se nacházejí častěji v gametách
- selekce na úrovni gamet (i u lidí)
- laboratorně ověřeno
Využití – vyhubení škůdců, patogenů, predátorů …
(Predator Free 2050 Nový Zéland) … x etika, bezpečnost